桔青霉降解茶皂素的實驗研究

黃 浦，肖 瑜，劉以清，覃 妍，陳菊清，楊 森

（桂林理工大學(xué)a.廣西危險廢物處置產(chǎn)業(yè)化人才小高地；b.廣西礦冶與環(huán)境科學(xué)實驗中心，廣西　　桂林 541004）

桔青霉降解茶皂素的實驗研究

黃 浦，肖 瑜，劉以清，覃 妍，陳菊清，楊 森

（桂林理工大學(xué)a.廣西危險廢物處置產(chǎn)業(yè)化人才小高地；b.廣西礦冶與環(huán)境科學(xué)實驗中心，廣西桂林 541004）

茶皂素是油茶餅粕中重要的組成成分，是影響油茶粕作為飼料利用的主要原因。為了得到桔青霉降解茶皂素的最佳發(fā)酵條件，對發(fā)酵前后產(chǎn)物進行了研究，以茶皂素（tea saponin）標準品為原料，以茶皂素降解率為指標，利用桔青霉液態(tài)發(fā)酵降解茶皂素。通過對培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、接種量等單因素的研究，確定其最佳的發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間13 d，發(fā)酵溫度31℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，接種量6 mL，在此條件下，茶皂素的降解率達到了36.71%，并用GC-MS對發(fā)酵前后產(chǎn)物進行了分析。

油茶粕；茶皂素；桔青霉；液態(tài)發(fā)酵

0 引 言

油茶粕是油茶榨取茶油后的副產(chǎn)物。齊小健等［1］研究表明，油茶粕組成為：粗蛋白15%，粗脂肪5%，糖類40%，粗纖維6%，茶皂素10%～4%，灰分6%，單寧2%，咖啡堿0.95%，水分14%，同時，油茶粕中富含Mg、Fe、Ca、Mn、Zn、Cu等多種無機微量元素。茶皂素（tea saponin）又名茶皂甙、皂角苷、皂苷，主要分布于茶葉、茶籽、茶根等部位，茶皂素屬于五環(huán)三萜類皂甙，由甙元、糖和有機酸三部分組成。經(jīng)提純后的茶皂素是乳白色或淡黃色無定形粉末，是一種非離子型極性物質(zhì)，具有辛辣、刺鼻的特性，是影響油茶粕作為飼料使用的主要因素，同時，茶皂素還具有溶血毒性和魚毒性。

鄧元榮等［2］研究了油茶皂苷的體外溶血，結(jié)果表明，油茶皂苷低濃度時無溶血作用，大于一定濃度時則具有溶血作用，且溶血強度與濃度呈劑量依賴性。羅毅志等［3］研究表明，茶皂素對紅細胞有很強的溶血作用，紅細胞一旦接觸茶皂素都會產(chǎn)生溶血毒性。首先是破壞細胞膜，隨后就可以觀察到細胞質(zhì)慢慢外滲，最后整個完整的細胞膜完全被破壞，有核的細胞就只剩下細胞核，無核的紅細胞則成一片膠質(zhì)狀態(tài)，但是茶皂素不會對白細胞產(chǎn)生任何毒性。

利用微生物產(chǎn)酶進行酶解的方法進行油茶粕脫毒屬于茶油粕的一個新的領(lǐng)域，具有成本低、重復(fù)性好、工藝簡單、設(shè)備要求低等特點［4］。桔青霉（Penicillium citrinum）常見于腐爛的水果、蔬菜、糧食、肉類、皮革和食物上，呈灰綠色。桔青霉是工業(yè)生產(chǎn)中的重要菌種，如用于核酸酶P1、醛酮氧合酶、脂肪酶、果糖氧化酶的生產(chǎn)等［5］。梁劍光等［6］對桔青霉發(fā)酵的工藝進行了相關(guān)研究，結(jié)果表明，種齡24 h、接種量10%、初始pH 6.5條件下，較高的發(fā)酵溫度下產(chǎn)酶最高點明顯提前，而較低溫度下，發(fā)酵周期延長，但有利于菌體產(chǎn)酶。王端好等［7］研究了溶氧對桔青霉發(fā)酵產(chǎn)核酸酶的影響，發(fā)現(xiàn)搖瓶裝液量為20%、搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min時產(chǎn)酶最好，表明桔青霉菌產(chǎn)酶需要較高的溶氧。

為了對油茶粕進行脫毒，降低茶皂素的含量，本研究利用桔青霉對其液態(tài)搖床發(fā)酵，以茶皂素降解率為指標，通過單因素實驗來確定其最佳的發(fā)酵條件，最后，通過GC-MS對其發(fā)酵前后產(chǎn)物進行分析。

1　材料和儀器

1.1菌種

桔青霉（Penicillium citrinum）購買于廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

1.2原料與培養(yǎng)基

茶皂素標準品（純度在98%以上）購于長沙哈根生物科技有限公司。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖（20 g/L），馬鈴薯汁，硫酸鎂（0.5 g/L），磷酸二氫鉀（1 g/L），硫胺素（8 mg/L），瓊脂（20 g/L），pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：茶皂素標準品（20 g/L），硫酸鎂（0.5 g/L），磷酸二氫鉀（1 g/L），硫胺素（8 mg/L），pH自然。

1.3主要儀器及設(shè)備

Clarus 680氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國PE公司；Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色譜，美國安捷倫公司；SH Z-B水浴恒溫振蕩器，上海安亭科學(xué)儀器廠；TGL-18000cR高速臺式冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；AR224CN電子分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；SN-GJ -2FD潔凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LTFG-通風(fēng)柜，深圳市利龍湖實業(yè)有限公司；YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司；廣口錐形瓶。

1.4主要化學(xué)試劑

甲醇（色譜純），四氯化碳（色譜純），葡萄糖，硫酸鎂，磷酸二氫鉀，硫胺素，瓊脂粉（分析純）。

2　實驗方法

2.1茶皂素標品標準曲線的制定

準確稱取2.5 g茶皂素標準品，定容于250 mL的容量瓶中，為10 mg/mL標準液，準確量取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL標準液于10 mL的比色管中，分別用甲醇（色譜純）定容至刻度線，搖勻，用注射器抽取一定量液體，過0.45 μm的針頭過濾器，注入1.5 mL液相進樣瓶中，最終置于液相色譜儀中進行測定，高效液相色譜洗脫方式為純甲醇以0.5 mL/min的速度洗脫，進樣量為2 nL，柱箱溫度30℃，檢測波長218 nm。當擬合直線相關(guān)系數(shù)達到0.999以上為合格，如圖1所示。

圖1　茶皂素的標準曲線Fig.1 Tea saponin standard curve

2.2桔青霉菌懸液的制備

用壓力蒸汽滅菌鍋滅菌250 mL超純水、2個250 mL的廣口錐形瓶，于121℃高溫下滅菌30 min，將滅菌過后的無菌水及錐形瓶放在潔凈工作臺上，紫外殺菌30 min，冷卻至室溫，再倒入少量無菌水于斜面培養(yǎng)基中，用涂布棒輕輕將桔青霉的菌落撮取下來，倒入250 mL廣口錐形瓶中，放入25℃、150 r/min的水浴恒溫振蕩器中旋轉(zhuǎn)振蕩30 min，再用棉花擋住瓶口，過濾到另一滅菌后的250 mL廣口錐形瓶中，最后放入冷藏柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3桔青霉時間單因子的確定

按發(fā)酵時間1～15 d進行三角瓶液態(tài)發(fā)酵實驗，每天取樣，提取出發(fā)酵液，測定其茶皂素的濃度，以確定最佳發(fā)酵時間。

2.4桔青霉溫度單因子的確定

在最佳的發(fā)酵時間下，分別將三角瓶放入15、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和55℃的水浴恒溫振蕩器中進行發(fā)酵，提取出發(fā)酵液，測定其茶皂素的濃度，以確定最佳發(fā)酵溫度。

2.5桔青霉轉(zhuǎn)速單因子的確定

在最佳時間、溫度的條件下，分別將三角瓶放入到設(shè)置為120、150、180、210、240 r/min的水浴恒溫振蕩器中發(fā)酵，提取出發(fā)酵液，測定其茶皂素的含量，以確定最佳的轉(zhuǎn)速。

2.6桔青霉接種量單因子的確定

在最佳發(fā)酵時間、溫度及轉(zhuǎn)速的條件下，分別向裝有液態(tài)培養(yǎng)液的三角瓶中加入0.5、1.0、3、6、9、12、15 mL桔青霉菌懸液，取出發(fā)酵液，測定其茶皂素的濃度，以確定最佳接種量。

2.7氣相色譜-質(zhì)譜分析

將發(fā)酵液裝入分液漏斗中，用四氯化碳進行液液萃取，放在通風(fēng)廚上讓其分層，當出現(xiàn)明顯的分層后，再將下部分萃取得到的白色乳化狀的液體放入到高速臺式冷凍離心機中進行離心，將得到的透明液體進行氮氣吹脫、濃縮，最終將濃縮至2 mL的液體過0.45 μm的針頭過濾器，裝入進樣瓶，進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測試。

3　結(jié)果與分析

3.1茶皂素標準品HPLC圖譜

茶皂素的標準品HPLC圖譜見圖2。

圖2　茶皂素標準品　HPLC圖Fig.2 Tea saponin standard HPLC

3.2時間對桔青霉發(fā)酵降解茶皂素的影響

由圖3可見，時間單因子實驗按2.3節(jié)所述方法進行，以茶皂素作為桔青霉新陳代謝的唯一碳源，隨著發(fā)酵時間的延長，茶皂素的降解率呈現(xiàn)出一種穩(wěn)步增高的趨勢，可能是由于桔青霉的大量生長繁殖，消耗了大量的能源物質(zhì)，當培養(yǎng)到第13d時，桔青霉生長達到穩(wěn)定期，降解對能源物質(zhì)的消耗達到了動態(tài)平衡，降解效果最佳，茶皂素的降解率達到了23.17%，因而可知，茶皂素最佳的培養(yǎng)時間為13 d。

圖3　時間對茶皂素降解的影響Fig.3 Time influence on the degradation of tea saponin

3.3溫度對桔青霉發(fā)酵降解茶皂素的影響

由圖4可知，溫度單因子實驗按2.4節(jié)所述方法進行，在較高或者較低的溫度環(huán)境條件下培養(yǎng)，茶皂素的降解效果很不理想，這是因為高溫或低溫限制桔青霉的新陳代謝，降低了酶的產(chǎn)出；當培養(yǎng)溫度為31℃時，茶皂素降解效果最好，在31℃周圍，隨著溫度變化，茶皂素降解率變化很大，說明溫度對桔青霉新陳代謝和酶解有著重要的作用，得到最佳的培養(yǎng)溫度為31℃。

圖4　溫度對茶皂素降解的影響Fig.4 Temperature influence on the degradation of tea saponin

3.4轉(zhuǎn)速對桔青霉發(fā)酵降解茶皂素的影響

由圖5可知，轉(zhuǎn)速單因子實驗按2.5節(jié)所述方法進行，隨著搖床轉(zhuǎn)速的變化，茶皂素的降解率呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。因為桔青霉是一種好氧菌，轉(zhuǎn)速過低，溶解氧不足，影響其新陳代謝，導(dǎo)致產(chǎn)酶較少，對茶皂素的降解比較有限；當轉(zhuǎn)速過快、溶解氧含量過高時，可能是過高的氧會轉(zhuǎn)化成超氧化物基·和過氧化物基·或羥基自由基（·OH），破壞微生物細胞組分，或者是過高的轉(zhuǎn)速不利于菌膠團的形成，從而影響到桔青霉對茶皂素的降解。

圖5　轉(zhuǎn)速對茶皂素降解的影響Fig.5 Rotate speed influence on the degradation of tea saponin

3.5接種量對桔青霉發(fā)酵降解茶皂素的影響

由圖6可知，接種量單因子實驗按2.6節(jié)所述方法進行，隨著桔青霉接種量的增加，茶皂素的降解率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。接種量從0.5 mL增加到1 mL的過程中，茶皂素降解率變化較大，主要是因為營養(yǎng)物質(zhì)充足，能夠提供微生物大量生長，能源物質(zhì)被大量消耗。當接種量為6 mL時，降解率達到了最佳狀態(tài)36.71%，繼續(xù)增加接種量，茶皂素降解率有所降低，最終趨于穩(wěn)定，可能是微生物之間出現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)的相互競爭關(guān)系，使活菌體數(shù)維持在一個動態(tài)平衡，因而茶皂素降解率也趨于穩(wěn)定，得出最佳的接種量為6 mL。

圖6　接種量對茶皂素降解的影響Fig.6 Inoculum size influence on the degradation of tea saponin

3.6氣相色譜-質(zhì)譜分析

將桔青霉發(fā)酵前和發(fā)酵后的發(fā)酵液分別用四氯化碳進行液液萃取，對萃取液作氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。對比GC-MS圖譜可知，在熱帶假絲酵母的降解作用下生成了新物質(zhì)，新物質(zhì)通過GCMS檢索為：［1-Benzyl-2-o-toyl-ethyl］-isonitrile和Benzene，4-pentynyl（表1）。

以茶皂素作為桔青霉生長的唯一碳源，將茶皂素中原有的成分通過桔青霉自身的新陳代謝和酶解作用，轉(zhuǎn)變?yōu)樾碌奈镔|(zhì)，改變了其原有的一些成分，對茶皂素的降解有著積極的作用。新生成的物質(zhì)為苯丁基炔和1-甲基-2-對苯乙基腈，炔烴可以發(fā)生加成、取代、聚合、消去及氧化反應(yīng)；腈類物質(zhì)在酸性或者堿性環(huán)境中水解為酰胺或者羧基，與格利雅試劑加成、水解生成酮，還原成一級胺。

4　結(jié) 論

油茶是我國南方重要的山茶科植物，油茶粕主要用作為飼料，本文利用桔青霉來降解油茶粕中的茶皂素，不僅工藝簡單、無二次污染，而且節(jié)約了經(jīng)濟成本，減少了環(huán)境污染。茶皂素為桔青霉的生長提供了必要的碳源，促進了菌體生長，發(fā)酵后發(fā)酵液中的各種成分含量與發(fā)酵前相比有較大程度的下降，說明桔青霉對茶皂素有較強的降解能力。通過桔青霉對茶皂素降解的單因素實驗研究得到最佳條件為：培養(yǎng)時間13 d，培養(yǎng)溫度31℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，接種量6 mL。在此條件下，茶皂素的降解率達到了36.71%，對茶皂素的降解有著重要的現(xiàn)實意義。

表1　桔青霉發(fā)酵后生成的新物質(zhì)Table 1 Degradation products of Penicillium citrinum

［1］齊小健，彭瑞福.從油茶餅中提取皂素［J］.化學(xué)世界，1989（6）：275-277.

［2］鄧元榮，卓儀榮，王玲.油茶皂苷的體外溶血試驗研究［J］.海峽藥學(xué)，2008，20（12）：29-32.

［3］羅毅志，葉雪平，施偉達.茶皂素對部分常見淡水水生生物的毒性試驗［J］.淡水漁業(yè)，2004，34（1）：10-12.

［4］王元鳳，俞蘭，魏新林.從油茶餅粕中提取油茶籽多糖和茶皂素的工藝研究［J］.食品工業(yè)，2008（6）：29-32.

［5］宋威，張芹，李歡慶，等.復(fù)合載體固定化細胞發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶P1的對比研究［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，29（3）：51-54.

［6］梁劍光，黃鵬，徐正軍.桔青霉發(fā)酵法生產(chǎn)核酸酶P1工藝條件及影響因素研究 ［J］.中國釀造，2007（11）：27-30.

［7］王端好，周河治，張小里.桔青霉生產(chǎn)核酸酶的發(fā)酵條件研究［J］.生物加工過程，2008，6（2）：33-37.

Degradation of tea saponin by Penicillium citrinum

HUANG Pu，XIAO Yu，LIU Yi-qing，QIN Yan，CHEN Ju-qing，YANG Sen
（a.Guangxi Talent Highland for Hazard and Waste Disposal Industrialization；b.Guangxi Mining and Environmental Sciences Laboratory Center，Guilin University of Technology，Guilin 541004，China）

Tea saponin is an important component in oil tea cake，a major influence on oil tea cake as aninal feeding utilization.In order to get the Penicillium citrinum degradation of tea saponin in the best fermentation condition the fermentation was studied before and after.The tea saponin standard was liquid fermentation degradated by Penicillium citrinum according to the degradation rate of tea saponin.The optimum fermentation conditions were determined by single factor，such as time，fermentation temperature，rotate speed and inoculum size，etc.The optimum fermentation degradation conditions were studied by time 13 d，fermentation temperature 31℃，rotating speed 150 r/min and inoculum size 6 mL etc.Under the control of the optimum fermentation degradation conditions，the decomposition rate of tea saponin was 36.71%.Finally，the produsts before and after being fermented are analyzed by GC-MS.

oil tea cake；tea saponin；Penicillium citrinum；liquid fermentation

X5

A

1674-9057（2016）03-0592-05

10.3969/j.issn.1674-9057.2016.03.028

2014-12-04

國家自然科學(xué)基金項目（21367010）

黃 浦 （1989—），碩士，研究方向：固體廢物處理與資源化，1096558202@qq.com。

肖 瑜，博士，教授。

引文格式：黃浦，肖瑜，劉以清，等.桔青霉降解茶皂素的實驗研究［J］.桂林理工大學(xué)學(xué)報，2016，36（3）：592-596.