錦鯉皰疹病毒病的診斷與防控

李玉平，毛洪順，唐紹林，翟秀梅，馬家好

（1.黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院水產(chǎn)技術(shù)與環(huán)境工程系，黑龍江哈爾濱150025；2.廣東省廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司，廣東廣州510510）

錦鯉皰疹病毒病的診斷與防控

李玉平1，毛洪順1，唐紹林2，翟秀梅1，馬家好2

（1.黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院水產(chǎn)技術(shù)與環(huán)境工程系，黑龍江哈爾濱150025；2.廣東省廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司，廣東廣州510510）

錦鯉皰疹病毒病是危害黑龍江省鯉魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的疾病之一，目前本病無(wú)有效地治療方法，只能及早診斷，做好疾病的預(yù)防和控制工作。本文就錦鯉皰疹病毒病的診斷方法和防控措施進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。

錦鯉皰疹病毒?。↘oi herpes virus disease，KHVD），是嚴(yán)重威脅鯉和錦鯉養(yǎng)殖業(yè)安全的一種世界性疾病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須申報(bào)的疾病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。病原為異樣皰疹病毒科，鯉病毒屬，錦鯉皰疹病毒（Koi herpes virus，KHV）。KHV主要感染鯉和錦鯉，其魚苗、幼魚、成魚階段均可感染，但幼魚比成魚更易感染KHV。鯉皰疹病毒病來(lái)勢(shì)兇猛，傳染快，死亡率高，且無(wú)有效治療方法，給鯉魚養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，極大地影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖者的養(yǎng)殖積極性。

由于該病毒造成病魚的死亡率極高，疫情難以控制，已引起國(guó)內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的高度關(guān)注。黑龍江省是鯉魚養(yǎng)殖大省，以鯉魚為代表的鯉科魚類年產(chǎn)量占淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%以上。為了進(jìn)一步做好黑龍江省鯉皰疹病毒病的病害防控工作，保障我省水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，本文將介紹鯉皰疹病毒病的診斷方法和防控措施，并對(duì)該病防控技術(shù)進(jìn)行應(yīng)用及推廣。

1　臨床癥狀及病理變化初診

患病魚無(wú)力、無(wú)食欲，游動(dòng)姿勢(shì)異常，魚體皮膚上常有蒼白的大小不等的塊斑及水泡，鰭條充血，鰓出血（要與大紅鰓進(jìn)行鑒別診斷）并產(chǎn)生大量粘液。

2　流行病學(xué)特點(diǎn)

錦鯉皰疹病毒僅感染鯉、錦鯉，該病發(fā)病溫度18～30℃，最適水溫是23～28℃,死亡率高達(dá)80%～100%。低于18℃，高于30℃不會(huì)引起死亡。

3　PCR診斷

目前，PCR診斷方法是錦鯉皰疹病毒病最準(zhǔn)確的診斷方法，相關(guān)試劑和步驟（參照SN/T 1674-2011）如下：

3.1儀器與試劑

（1）儀器：PCR儀（晶格T960），電泳儀電源、電泳儀、紫外儀（北京六一）

（2）試劑：dNTP、Buffer、DNA聚合酶等（購(gòu)自大連寶生物公司）

引物的設(shè)計(jì)與合成：KHV-R（292bp）:5’-GACACCACATCTGCAAGGAG-3’KHV-F（292bp）:5’-GACACATGTTACAATGGTCGC-3’

3.2操作步驟

（1）采樣：采集腎臟、脾臟進(jìn)行病毒PCR檢測(cè)

（2）DNA抽提：將待檢樣品與滅菌生理鹽水混合勻漿（1/10），取100μL組織勻漿加到有500μL組織裂解液的1.5mL離心管中，65℃處理1h，加入20μL蛋白酶K （20mg/mL），55℃孵育30min，加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），振蕩混勻，靜置20s，13500r/min，4℃離心3min，取上清液移入另一離心管，加入等體積氯仿/異戊醇（24：1）混勻，靜置20s，10000r/min，4℃離心15min。

取上清液（約600μL）到新的離心管中，加入1.5倍體積(約900μL)，-20℃預(yù)冷無(wú)水乙醇混勻，靜置20℃過(guò)夜，15000r/min，4℃離心5min，棄上清液，加入500μL的70%乙醇，輕輕漂洗DNA沉淀2遍，棄上清液，吸水紙去除殘余的乙醇，自然干燥10min，加50μL雙蒸水溶解沉淀，-20℃保存。

（3）PCR擴(kuò)增：100μL體系：10X緩沖液10μL，氯化鎂10μL，dNTP 2μL，引物（40pmol）各2.5μL，Taq酶5μL，模板10μL，加水到100μL。94℃預(yù)變性5min，95℃1min，63℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。

（4）瓊脂糖凝膠板制備和電泳：制備1%瓊脂糖凝膠，EB終濃度0.5-1μg/mL，100V電泳約20min，紫外儀觀察。

結(jié)果：擴(kuò)增292bp片段（見圖1）

圖1　PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果292bp

4　防控

4.1調(diào)控好水質(zhì)和底質(zhì)，定期用微生態(tài)制劑全池潑灑進(jìn)行水質(zhì)調(diào)控，用氧化型改底制劑進(jìn)行池塘底質(zhì)改良，減少病原體大量繁殖的機(jī)率。

4.2疾病高發(fā)期，10～15d進(jìn)行一次水體消毒，用二氧化氯按100～125g每畝水深1m全池潑灑。

4.3水體消毒3～5d后，使用1次有益菌類水質(zhì)改良劑，按200～300g每畝水深1m全池潑灑。

4.4在發(fā)病高峰期以1個(gè)療程5～7d，在飼料中每天按0.25g/kg·bw添加三黃散和0.2g/kg·bw大黃與板藍(lán)根合劑投喂，間隔15d后，再投喂1個(gè)療程。

5　討論

錦鯉皰疹病毒病具有高度傳染性，給鯉和錦鯉的養(yǎng)殖業(yè)造成極大經(jīng)濟(jì)損失，是OIE必須申報(bào)的疾病之一，PCR是目前檢測(cè)錦鯉皰疹病毒最常用的方法，據(jù)資料報(bào)道，LAMP擴(kuò)增法診斷錦鯉皰疹病毒具有方便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但還未在基層推廣應(yīng)用。該病以預(yù)防為主，最有效的預(yù)防方法是疫苗免疫，組織漿疫苗安全但免疫效果不理想，弱毒疫苗免疫效果好，但存在毒力返強(qiáng)或散毒的風(fēng)險(xiǎn)，因此，結(jié)合目前現(xiàn)狀，做好水質(zhì)底質(zhì)調(diào)控，提高魚體抵抗力，是防控該病的有效措施，從而減少疾病發(fā)生，降低經(jīng)濟(jì)損失，以保證錦鯉和鯉魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

[1]譚愛萍，等.錦鯉皰疹病毒病主要囊膜蛋白基因的PCR擴(kuò)增與序列分析[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2008，15（5）：880-884.

[2]朱霞，等.錦鯉皰疹病毒病的研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2011，41 （01）:106-110.

[3]張艷，等.錦鯉皰疹病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J].吉林畜牧獸醫(yī)，2010，31（4）：11-14.

[4]閆春梅，等.錦鯉皰疹病毒組織滅活疫苗研制初探[J].河北漁業(yè)，2010，4（196）:7-8.

[5]包衛(wèi)空，等.錦鯉皰疹病毒的鑒定及預(yù)防[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2015，36 （4）：45-48.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．10.024

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目資助，項(xiàng)目編號(hào)：12535118