甘薯爪哇黑腐病的病原鑒定

高 波, 王容燕, 馬 娟, 李秀花, 陳書龍

(河北省農林科學院植物保護研究所, 河北省農業(yè)有害生物綜合防治工程技術研究中心,農業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室, 保定 071000)

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甘薯爪哇黑腐病的病原鑒定

高 波, 王容燕, 馬 娟, 李秀花, 陳書龍*

(河北省農林科學院植物保護研究所, 河北省農業(yè)有害生物綜合防治工程技術研究中心,農業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室, 保定 071000)

甘薯爪哇黑腐病是甘薯貯藏期的一種真菌性病害,是全球熱帶和亞熱帶地區(qū)甘薯貯藏期的重要病害之一。2013年我們從廣東湛江采集的甘薯中,發(fā)現(xiàn)病薯薯塊由兩端向中間變黑變硬,切開發(fā)病薯塊,在傷口處會逐漸長出黑色或灰色的菌絲。發(fā)病薯塊室內放置30 d后表面龜裂,裂口處有大量的黑色粉末溢出,顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大量褐色有隔膜孢子。經(jīng)對病原菌進行分離,采用柯赫氏法則回接驗證,依據(jù)病原菌的形態(tài)特征和rDNA-ITS及β-tubulin基因序列,確定該病害為甘薯爪哇黑腐病,病原菌為可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)。致病性測定發(fā)現(xiàn)該病具有較強致病性,對于貯藏期甘薯具有較大威脅。這是國內首次對該病進行的報道。

甘薯; 爪哇黑腐病; 可可毛色二孢; 分子鑒定

我國是世界上最大的甘薯生產國,年均種植面積460萬hm2左右,年均總產量占世界總產量的75%左右[1]。但由于甘薯的體積大、水分多、表皮薄易破損、擦傷,而使得其安全貯藏成為我國甘薯生產的重要環(huán)節(jié)。影響甘薯安全貯藏的因素主要是貯藏環(huán)境以及貯藏期病害,其中又以貯藏期病害對甘薯的威脅最大。

甘薯爪哇黑腐病(Java black rot)是由可可毛色二孢[Lasiodiplodiatheobromae(Pat.) Griffon & Maubl.]引起的一種貯藏期真菌病害[2],于1896年在美國首次發(fā)現(xiàn)并報道,是美國南部地區(qū)甘薯貯藏期最具破壞性的病害之一,也是全球熱帶和亞熱帶地區(qū)甘薯貯藏期的重要病害之一[3]。該病原菌寄主范圍廣泛,可以侵染58科的138種植物并導致很多作物發(fā)生貯藏期腐爛病[3]。我國目前為止鮮有對甘薯爪哇黑腐病的研究報道。由于其致病菌可可毛色二孢具有寄主范圍廣,分布廣的特點,目前已經(jīng)在我國的多種作物上有報道,例如花生莖腐病、沙田柚果腐病、香蕉黑腐病、芒果蒂腐病等[4-7]。

2013年6月從廣東湛江采集的甘薯薯塊中發(fā)現(xiàn)大量病薯,其癥狀與甘薯爪哇黑腐病癥狀極為相似,通過對疑似病原菌進行分離純化、形態(tài)觀察、致病性測定以及基因序列分析,最終確定其病原種類,進而為該病的防控及其深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品種:甘薯樣本于2013年6月采自廣東湛江;用于回接鑒定的品種為‘煙薯25’;用于致病性測定的品種為:‘冀薯6-8’、‘煙薯25’、‘商薯19’、‘冀薯98’、‘冀紫薯1號’、‘冀薯4號’、‘徐薯25’。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA):馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L和瓊脂20 g/L。LB培養(yǎng)液:胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 5 g/L和NaCl 10 g/L。LB固體培養(yǎng)基含瓊脂20 g/L。所有培養(yǎng)基經(jīng)121℃,濕熱滅菌15～20 min后使用。

試劑:Fungal gDNA Kit購自美國Biomiga公司;2×EsTaqMasterMix、DM2000 plus marker、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司;pMD18-T載體、T4連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司;感受態(tài)大腸桿菌DH5α為本實驗室自制;EB、氨芐青霉素購自生工生物工程(上海)股份有限公司;其他試劑均為國產分析純。

儀器:梯度PCR儀,美國ABI公司;DYY-6C型電泳儀,北京六一儀器廠;凝膠成像儀,伯樂公司;光照培養(yǎng)箱,寧波江南儀器廠;振蕩培養(yǎng)箱,上海智誠分析儀器制造有限公司;尼康Eclipse 80i顯微鏡,尼康映像儀器銷售(中國)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化

切取發(fā)病薯塊的病健交界處組織,75%乙醇消毒1 min,無菌水沖洗3遍后移入10%次氯酸鈉消毒2 min,然后再用無菌水沖洗3次,最后用滅菌濾紙吸干組織表面水分。消毒后的組織移入PDA培養(yǎng)基上(含50 mg/L鏈霉素),在25℃,光周期L∥D=14 h∥10 h下培養(yǎng)3 d。將初次培養(yǎng)獲得的各菌株分別接種到新鮮PDA培養(yǎng)基上同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)至新生菌絲長出,以此為第一代，通過在顯微鏡下挑取單條新生菌絲的方法連續(xù)繼代培養(yǎng)3代后獲得純化的病原菌。

1.2.2 柯赫氏法則驗證

選取健康、表面無破損的‘煙薯25’薯塊,用70%乙醇表面消毒,無菌水沖洗3次后用于回接試驗。在薯塊靠近兩端處分別打取5 mm孔,用于接種受測菌株和空白對照(PDA瓊脂塊),具體方法為:從分離獲得的各菌株平板上打取5 mm菌盤,將菌盤菌絲面朝下置于薯塊一端的一個接種點處,另一個接種點以同樣的方法接種PDA瓊脂塊,每個菌株接種3個薯塊。將接種好的薯塊置于濕潤無菌沙土中于25℃、光周期L∥D=14 h∥10 h下保濕培養(yǎng),分別于3、6、10和15 d時調查發(fā)病情況,再次分離致病菌,并進行形態(tài)和分子鑒定。

1.2.3 病原菌形態(tài)鑒定

將直徑為5 mm的菌盤接種到PDA平板中央,置于25℃，光周期L∥D=14 h∥10 h下培養(yǎng),觀察其菌落的培養(yǎng)特征;從發(fā)病薯塊切取一小塊干腐變黑的組織,置于無菌水中搗碎,吸取上層液體于尼康80i顯微鏡下觀察孢子的形態(tài),并利用顯微鏡附帶軟件NIS-Elements F 3.2對孢子進行拍照并測量其大小。

1.2.4 病原菌的分子鑒定

利用Fungal gDNA Kit提取病原菌的基因組DNA。用兩對通用引物ITS1/ITS4(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′/5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和Bt2a/ Bt2b(5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′/5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′)分別對病原菌的rDNA-ITS以及β-tubulin基因進行擴增,PCR體系為:2×EsTaqMasterMix 10 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA模板1 μL,加ddH2O至20 μL。反應程序為:94℃,3 min;94℃ 30 s,55℃/58℃ 30 s,72℃ 1 min,共30個循環(huán);72℃充分延伸10 min。PCR 產物在濃度為1%的瓊脂糖凝膠中電泳,EB染色,用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照,用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶。將回收純化后的PCR產物與pMD18-T載體4℃過夜連接,連接產物用熱激法轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,并于含氨芐青霉素(50 mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～14 h，篩選陽性克隆。挑取單菌落于4 mL含氨芐青霉素(50 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng),將獲得的菌液利用質粒小提試劑盒提取質粒后進行PCR驗證。最后將經(jīng)PCR驗證的陽性克隆(至少3個)送至上海生工進行測序。利用DNAStar軟件包的SeqMan進行序列拼接比對。所得序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析。采用MEGA 5.2軟件包中的neighbor-joining(NJ)聚類分析法對所測定的序列進行聚類分析。

1.2.5 致病性測定

在PDA培養(yǎng)基上接種已純化菌株,25℃,光周期L∥D=14 h∥10 h下培養(yǎng)5 d用于致病性測定。7個受試甘薯品種為:‘冀薯6-8’、‘煙薯25’、‘冀薯98’、‘商薯19’、‘徐薯25’、‘冀薯4號’以及‘冀紫薯1號’。每個品種選取3個薯塊作為試驗組接種致病菌,1塊作為對照組接種PDA瓊脂塊,方法：將所有薯塊經(jīng)70%乙醇表面消毒,無菌水沖洗3次后,每個薯塊分別設置針刺與不處理兩個接種點,兩接種點均接種5 mm菌盤(對照組接種5 mm PDA瓊脂塊),菌絲面朝下置于接種點上。接種好的薯塊置于濕潤無菌沙土上25℃，光周期L∥D=14 h∥10 h保濕培養(yǎng)10 d后調查發(fā)病情況。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀和病原菌形態(tài)特征

采自廣東湛江的甘薯,在實驗室放置1個月左右大量薯塊發(fā)生干腐,發(fā)病率達80%(n=20)。癥狀主要表現(xiàn)為薯塊干腐變硬,表面龜裂,變褐,裂口部分可見亮黑色物質(圖1a),挑取部分該組織于顯微鏡

下觀察可見大量孢子,共分為兩種:一種為無色透明無隔膜的橢圓形孢子,另一種為深褐色中間有隔膜的橢圓形或紡錘形孢子(圖1b),孢子大小為(20.5～28.7)μm×(12.2～16.6)μm。與甘薯爪哇黑腐病的癥狀相似。

圖1 甘薯爪哇黑腐病發(fā)病癥狀及其病原菌的孢子形態(tài)Fig.1 Symptoms of Java black rot on sweet potato and spore morphology of the pathogen

分離獲得的5個疑似病原菌在PDA 培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀基本一致,因此,選取菌株1306ZJ作為代表菌株進行研究。疑似病原菌菌落呈圓形或近圓形,質地疏松；菌絲絮狀、淺白色,沿平面輻射狀生長(圖2a)。48 h 長滿培養(yǎng)皿后有旺盛的氣生菌絲生長,在培養(yǎng)皿中央聚集成絮狀,后逐漸變?yōu)榛揖G色(圖2b),最后整個菌落變?yōu)榛液谏?圖2c),培養(yǎng)基背面呈黑色。10 d 后,開始產生暗灰色、小蘑菇狀、近圓形的菌絲團。切開菌絲團可見有透明的無隔膜的未成熟孢子,與可可毛色二孢的形態(tài)特征基本一致。

圖2 甘薯爪哇黑腐病菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)不同時間菌落的形態(tài)Fig.2 Colony morphology of the pathogen isolated from sweet potato in different culture periods on PDA medium

2.2 柯赫氏法則回接驗證

經(jīng)純化的疑似病原菌回接薯塊3 d后(圖3),接種菌盤處周圍表皮顏色變褐,組織變軟,而接種瓊脂塊處未發(fā)病,隨著時間的延長,接種菌盤處周圍表皮顏色開始變深最終變成黑色,同時薯塊表皮逐漸變皺,干腐,伴有黑色穹頂狀或墊狀子實體突破表皮生成,切開薯塊可見表皮以下組織已變成褐色或黑色。以上癥狀與甘薯爪哇黑腐病的特征基本一致[2]。從發(fā)病組織分離純化病原菌,經(jīng)形態(tài)和分子鑒定與之前獲得菌株一致。

圖3 病原菌回接薯塊發(fā)病癥狀Fig.3 Symptoms of the inoculated sweet potato tuber

2.3 病原菌的分子鑒定

用真菌通用引物ITS1/ITS4和Bt2a/ Bt2b分別對病原菌的rDNA-ITS及β-tubulin基因的擴增結果顯示其rDNA-ITS目的條帶大小約為540 bp,而β-tubulin目的條帶大小約為460 bp(圖4),與預期大小一致。經(jīng)測序獲得其rDNA-ITS區(qū)序列長為542 bp(GenBank登錄號:KJ866153),β-tubulin基因區(qū)序列長為459 bp(KJ866154)。分別將獲得的兩條序列提交GenBank進行BLAST比對分析,結果顯示其ITS序列與登錄號為KC964547、JX982240以及HM466959的Lasiodiplodiatheobromae菌株同源性為100%,而β-tubulin基因序列與登錄號為EU673110、KC960992、JX462265的菌株同源性為99%～100%,說明該病原菌為L.theobromae?；谶@兩個基因的聚類分析結果顯示(圖5),該病原菌均與L.theobromae聚為一組,進化距離最近,進一步證明了以上結論。

圖4 病原菌rDNA-ITS及β-tubulin基因 PCR擴增后電泳結果Fig.4 Electrophoresis results of the PCR products of rDNA-ITS and β-tubulin gene

圖5 利用鄰接法基于rDNA-ITS(a)和β-tubulin(b) 基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Neighbor-joining tree calculated from the sequences of rDNA-ITS (a) and β-tubulin (b)

2.4 致病性測定

對病原菌進行的致病性測定顯示,接種10 d后

受試的7個品種的對照組薯塊兩個接種點均未見異常,而試驗組中‘冀6-8’,‘煙薯25’,‘商薯19’,‘冀薯98’,‘冀紫薯1號’等5個品種針刺接種點周圍組織受到不同程度的侵染,而不經(jīng)處理的接種點周圍組織未受到明顯侵染,另兩個品種‘冀薯4號’和‘徐薯25’的兩個接種點均未受到侵染(圖6)。在發(fā)病的品種中‘煙薯25’的薯塊整個表面均散布穹頂狀或墊狀病原菌, ‘冀薯98’和‘冀紫1號’只在針刺接種點周圍組織發(fā)生凹陷變軟,顏色褐化變深,并有墊狀病原菌生成,而‘冀6-8’,‘商薯19’針刺接種點周圍只見組織凹陷變軟,并無墊狀病原菌生成。

3 討論

本研究通過對采自廣東湛江的甘薯發(fā)病薯塊的病原菌進行分離純化、致病性測定和形態(tài)學觀察,并結合分子鑒定,最終確定該病害為由可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)引致的甘薯爪哇黑腐病(Java black rot)。這是我國首次通過形態(tài)學以及分子生物學的方法對甘薯爪哇黑腐病進行鑒定。對7個甘薯品種進行的致病性測定顯示該病原菌具有較強致病性,可以通過薯塊的傷口侵染,最終導致甘薯爪哇黑腐病。

圖6 甘薯爪哇黑腐病病原接種7個甘薯品種的發(fā)病情況Fig.6 Incidence of the seven tested sweet potato varieties

可可毛色二孢廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區(qū),寄主范圍目前已知達500種之多[8],可以導致寄主的發(fā)病癥狀包括:梢枯、根腐、果腐、枯萎、流膠、葉斑、叢枝等[9]。我國對該菌報道最多的是在熱帶、亞熱帶地區(qū)水果上引起的病害,至今研究最深入的是由可可毛色二孢引起的肉桂枯枝病[10-13]、芒果蒂腐病[14-15]、龍眼焦腐病[16-17]等。近年來,在北方地區(qū)也不斷有該病原的報道,例如:北京的板栗黑斑病[18],山東的花生莖腐病[7],黑龍江的黑木耳“黑皮病”[19]等,說明該病原也能適應溫帶氣候,對我國北方薯區(qū)也存在著威脅。

綜上所述,無論北方還是南方薯區(qū)都存在受甘薯爪哇黑腐病危害的風險,應該引起足夠的重視,甘薯收獲期采取精耕細挖,最大限度避免薯塊受傷以及結合化學防治等措施對于該病的防治將具有積極的作用。

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(責任編輯：楊明麗)

Pathogen identification of Java black rot disease on sweet potato

Gao Bo, Wang Rongyan, Ma Juan, Li Xiuhua, Chen Shulong

(Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences;IPM Centre of Hebei Province; Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture, Baoding 071000, China)

Sweet potato Java black rot is an important fungus-caused storage disease on sweet potato in the world’s tropical and subtropical areas. In 2013, lots of sweet potato tubers collected from Zhanjiang of Guangdong Province turned black and solid from both ends during storage. Gray to black mycelium developed on the cut ends of diseased sweet potato tubers. The periderm of the diseased tubers would be wrinkled and cracked, and the black stromatic masses would erupt through the tuber surface after 30 days’ storage, and a large number of brown and diaphragm spores would be observed under the microscope. Through the pathogen isolation and purification, pathogenicity test, microscopic observation and molecular identification based on the rDNA-ITS andβ-tubulingenes analysis, the disease was finally diagnosed as sweet potato Java black rot that caused byLasiodiplodiatheobromae. Pathogenicity test revealed that the disease had strong pathogenicity and a great threat to the storage of sweet potato. This is the first report about the disease on sweet potato in China.

sweet potato; Java black rot;Lasiodiplodiatheobromae; molecular identification

2015-11-10

2016-01-05

國家現(xiàn)代農業(yè)(甘薯)產業(yè)技術體系(CARS-11-B-08)；河北省財政基本科研業(yè)務費(494-0401-JBN-6440)

S 432.44

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.05.035

* 通信作者 E-mail: chenshulong65@163.com