亞麻木酚素對復合因素誘導大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療作用研究

李興勇，魏曉輝，李喜香，劉效栓，陳二林，楊旭濤，吳國泰

（1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州市第一人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000）

亞麻木酚素對復合因素誘導大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療作用研究

李興勇1，魏曉輝2，李喜香1，劉效栓1，陳二林1，楊旭濤3，吳國泰3

（1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州市第一人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000）

目的：觀察亞麻木酚素（FLs）對實驗性骨質(zhì)疏松大鼠的治療作用。方法：60只SD大鼠隨機分為正常對照組，模型對照組，陽性對照組和FLs低、中、高劑量組，除正常對照組外其余各組灌胃醋酸潑尼松，第8天灌胃維甲酸。造模第14天，F(xiàn)Ls低、中、高劑量組大鼠分別灌胃不同劑量的FLs混懸液，陽性對照組灌胃雌二醇，正常對照組和模型對照組灌胃等容量的蒸餾水，連續(xù)14天。結(jié)果：造模后，與正常組比較模型組大鼠血清鈣和磷的含量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），骨鈣含量降低（P＜0.05），Pmax、Mmax明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，F(xiàn)Ls高劑量組股骨重量增加（P＜0.05），F(xiàn)Ls高、中劑量組大鼠血清鈣和磷的含量均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），F(xiàn)Ls各劑量組骨鈣含量明顯升高（P＜0.05），F(xiàn)Ls各劑量都能不同程度提高Pmax，Lmax，Mmax和骨應變（P＜0.05，P＜0.01）。FLs各劑量組骨小梁數(shù)量增加，骨小梁厚度增厚，平均骨小梁間距減少，骨小梁體積百分比增大，平均骨皮質(zhì)厚度增加（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論：亞麻木酚素對潑尼松和維甲酸所致的大鼠骨質(zhì)疏松有一定的治療作用。

亞麻木酚素；骨質(zhì)疏松大鼠模型；治療作用

骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少及骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞為特征的一種全身性骨骼疾病，隨著人口老齡化，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率不斷升高，其研究亦日益受到全球的重視［1-2］。雌激素缺乏是導致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生的主要原因，故雌激素是目前治療骨質(zhì)疏松癥的首選藥物之一，但其存在增加乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等風險［3］。亞麻木酚素（FLs）與雌激素結(jié)構(gòu)十分相似。亞麻木酚素對雌激素依賴性疾病乳腺癌、前列腺癌、經(jīng)期綜合征、骨質(zhì)疏松有預防作用，對糖尿病、胃腸腫瘤、冠心病、腎臟病具有輔助治療作用［4-5］。本研究通過建立實驗性大鼠骨質(zhì)疏松癥模型，觀察FLs對股骨重量，血清和骨鈣、磷的含量，骨生物力學及骨組織形態(tài)學指標變化的影響，探討其對大鼠骨質(zhì)疏松的治療作用。

1　材料

1.1 動物

SD大鼠，SPF級，60只，雌性，體質(zhì)量（200±2）g，由甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK（甘）2011-0001，動物實驗設施使用證號SYXK（甘）2011-0001。SPF級飼料（由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供）喂養(yǎng)，自由飲水，室溫（25±0.5）℃，相對濕度（55±5）%，12h燈光，12h黑暗，適應7天后開始實驗。

1.2 藥品與試劑

亞麻木酚素由甘肅省中醫(yī)院藥劑科提供（口服擬推薦臨床成人日用量0.2g）。醋酸潑尼松由浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號141126。維甲酸由上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)，批號SN1114CA14。戊酸雌二醇由拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司生產(chǎn)，批號153A。鈣測試盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號20150326。無機磷測試盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.3 主要儀器

Nestorius電子天平由德國Nestorius生產(chǎn)，XYJ-2低溫離心機由金壇市恒豐儀器廠生產(chǎn)，AG-107A型自動控制電子萬能試驗機由日本島津生產(chǎn)，P型陶瓷纖維馬弗爐由北京美誠科學儀器有限公司生產(chǎn)，3300型紫外分光光度計由上海美譜達儀器有限公司生產(chǎn)，AG-107A型自動控制電子萬能試驗機由日本島津生產(chǎn)，BX60-32FB3-F01型OLMPUS顯微鏡由奧林帕斯公司生產(chǎn)，大恒細胞分析系統(tǒng)由中國大恒集團有限公司生產(chǎn)，TEC5組織包埋機由北京怡康勇佳科技有限責任公司生產(chǎn)，TEKVIP5全自動密閉式組織脫水機由北京怡康勇佳科技有限責任公司生產(chǎn)，RM2135石蠟切片機由德國Leica公司生產(chǎn)。

2　方　法

2.1 造模、分組及給藥

60只大鼠隨機分為6組，設正常對照組、模型對照組、陽性對照組、亞麻木酚素（FLs）低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只。除正常對照組外其余各組灌胃醋酸潑尼松20mg/kg、每天1次、連續(xù)7天，第8天灌胃維甲酸80mg/kg、每天1次、連續(xù)8天。造模第14天，F(xiàn)Ls低、中、高劑量組大鼠灌胃亞麻木酚素（分別為0.05g/kg、0.1g/kg、0.2g/kg，相當于臨床成人日用量的7、14、28倍），陽性對照組灌胃雌二醇（1.5mg/kg，相當于臨床成人日用量的14倍），正常對照組和模型對照組灌胃等容量的蒸餾水，連續(xù)14天。

2.2 指標與檢測方法

體質(zhì)量和股骨重量。各組大鼠每3天稱體質(zhì)量1次，觀察大鼠的運動情況，皮毛光澤、飲食情況等，末次給藥60min后，取血后處死大鼠，摘取左側(cè)股骨，剔除肌肉肌腱等組織，稱股骨重量。

血清鈣和磷含量。末次給藥60min后，麻醉大鼠，股動脈取血，分離血清（低溫離心，3500r/min，10min）用比色法在660nm波長處測定鈣、磷含量。磷含量（mmol/L）=（測定OD值-空白OD值/標準OD值-空白OD值）×標準品濃度（0.5mmol/L）×樣本前處理稀釋倍數(shù)（5倍）。鈣含量（mmol/L）=（測定OD值-空白OD值/標準OD值-空白OD值）×標準品濃度（2.5mmol/L）×樣本前處理稀釋倍數(shù)（5倍）。

骨鈣和磷含量。分離大鼠左側(cè)股骨，剝凈軟組織，放入干燥箱中，90℃烘干2h后用天平稱干重（精確至0.1mg）。在電爐上炭化后置馬福爐中，800℃灰化2h，冷卻至室溫，稱重。稱取0.10g骨灰，加3%硝酸溶液3mL，室溫放置48h，待溶液呈無色透明，用試劑盒測定溶液中鈣和磷的含量。

骨生物力學指標測定。取右股骨進行骨生物力學試驗，計算最大載荷（Pmax）、最大擾度（Lmax）、最大彎矩（Mmax）、骨應力（σ）和骨應變。

骨組織形態(tài)計量學參數(shù)。取右側(cè)股骨，10%甲醛常規(guī)固定，脫鈣，切片，H-E染色，應用病理圖像分析儀于100倍下，在干骺端生長板下約2mm近皮質(zhì)處取視野為測量范圍，計算骨小梁數(shù)量（TN）、平均骨小梁厚度（TMPT）、平均骨小梁間距（TMPS）、骨小梁體積百分比（TBV）及平均骨皮質(zhì)厚度（MCBT）。

3　結(jié)　果

FLs對大鼠體質(zhì)量和股骨重量的影響見表1。

表1 FLs對大鼠體質(zhì)量和股骨重量的影響 （g，±s）

表1 FLs對大鼠體質(zhì)量和股骨重量的影響 （g，±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05。

組別　n劑量（mg/kg）　　體質(zhì)量　　股骨重量正常對照組　10　　—　234.62±15.92　0.31±0.08模型對照組　10　　—　206.97±17.96**0.27±0.06*陽性對照組　10　1.5　193.11±9.38　0.29±0.05 FLs高劑量組　10　200　209.24±14.05　0.31±0.09△FLs中劑量組　10　100　219.93±14.04　0.24±0.05 FLs低劑量組　10　50　202.10±14.15　0.29±0.06

FLs對大鼠血清鈣和磷含量的影響見表2。

表2 FLs對大鼠血清磷和鈣含量的影響 （mmol/L，±s）

表2 FLs對大鼠血清磷和鈣含量的影響 （mmol/L，±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別　n劑量（mg/kg）　Ca含量　P含量正常對照組　10　　—　2.47±0.71　1.00±0.25模型對照組　10　　—　2.03±0.43*　1.48±0.18**陽性對照組　10　1.5　2.63±0.42△　1.10±0.39△FLs高劑量組　10　200　2.59±0.35△　1.18±0.38△FLs中劑量組　10　100　2.94±0.44△△　1.25±0.18△FLs低劑量組　10　50　2.30±0.45　1.35±0.43

FLs對大鼠股骨中鈣、磷含量的影響見表3。

表3 FLs對實驗性骨質(zhì)疏松大鼠股骨中鈣、磷含量的影響 （±s）

表3 FLs對實驗性骨質(zhì)疏松大鼠股骨中鈣、磷含量的影響 （±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05。

組別　n劑量（mg/kg） 鈣含量（mg/g） 磷含量（mg/g）正常對照組 10　　—　224.54±32.33　204.73±1.36模型對照組 10　　—　156.13±27.67*　205.21±0.00陽性對照組 10　1.5　108.79±41.16　205.21±0.00 FLs高劑量組 10　200　186.45±30.40△　203.38±0.00 FLs中劑量組 10　100　203.04±136.47△　204.98±0.03 FLs低劑量組 10　50　196.65±168.52△　204.98±0.03

FLs對大鼠骨生物力學指標的影響見表4。

表4 FLs對大鼠骨力學指標的影響 （±s）

表4 FLs對大鼠骨力學指標的影響 （±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別　n　　劑量（mg/kg）　Pmax（n）　Lmax（mm）　Mmax（M）　　σ（N/mm2）　　骨應變（%）正常對照組　10　　—　103.41±7.28　0.98±0.24　465.6±40.5　99.41±12.65　4.52±1.35模型對照組　10　　—　86.46±6.85＊＊　0.85±0.35　380.4±36.4＊＊　82.25±11.60＊　4.04±1.20陽性對照組　10　1.5　97.52±7.64△　1.06±0.38#　435.2±41.8△△　101.56±16.54△△　4.68±0.92△FLs高劑量組　10　200　96.83±6.89△　1.23±0.13#　455.3±50.2△△　98.61±12.94△△　4.66±0.87△FLs中劑量組　10　100　93.56±10.56　0.95±0.34　438.0±52.6△　90.50±8.46△　4.32±0.66 FLs低劑量組　10　50　91.94±8.34　0.90±0.19　405.6±59.5　86.25±18.40　4.30±1.28

FLs對大鼠骨組織形態(tài)計量學指標的影響見表5。

表5 FLs對實驗性骨質(zhì)疏松大鼠骨組織形態(tài)計量學指標的影響 （±s）

表5 FLs對實驗性骨質(zhì)疏松大鼠骨組織形態(tài)計量學指標的影響 （±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別　n　　劑量（mg/kg）　TN（n）　MTPT（μm）　MTPS（μm）　MBCT（μm）　TVB（%）正常對照組　10　　—　3.26±0.35　7.56±0.54　8.16±0.85　10.65±0.88　40.50±1.42模型對照組　10　　—　2.05±0.92＊＊　6.06±0.37＊　12.04±1.40＊＊　8.66±0.64＊＊　25.89±1.95＊＊陽性對照組　10　1.5　2.68±0.62△　7.22±0.58△△　10.25±1.11△　11.51±0.77△△　34.00±1.33△△FLs高劑量組　10　200　2.80±0.39△　7.68±0.38△△　9.32±1.20△△　9.88±0.82△　38.14±1.80△△FLs中劑量組　10　100　2.60±0.64△　6.91±0.30#　10.10±0.96#　9.57±0.83△　36.07±2.18△△FLs低劑量組　10　50　2.14±0.91　6.18±0.33　10.61±0.88　8.85±0.69　38.33±2.74△△

4　討　論

維甲酸也叫維A酸，是維生素A的衍生物，可影響骨的生長、發(fā)育和代謝，維甲酸既可增加成骨細胞的數(shù)量，又刺激破骨細胞使其活性增強，從而使骨代謝呈現(xiàn)高轉(zhuǎn)換型改變，但總趨勢是骨吸收大于骨形成，是骨質(zhì)疏松癥動物模型制備的常規(guī)試劑，病理模型符合繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的臨床特點，穩(wěn)定性較高，重復性較好［6-8］。潑尼松為臨床常用糖皮質(zhì)激素類藥物，糖皮質(zhì)激素能分別促進和抑制破骨細胞和成骨細胞的功能，可抑制骨組織中蛋白質(zhì)、膠原合成、細胞生長及RNA合成、導致骨質(zhì)疏松［9-10］。用兩種造模劑建立大鼠實驗性骨質(zhì)疏松癥模型，模型大鼠體質(zhì)量和股骨重量明顯降低，血清鈣和磷的含量均顯著降低，骨鈣含量降低，Pmax，Mmax，TN、MTPT、MTPS、TBV和MCBT均明顯減小，骨小梁稀疏、斷裂，骨髓腔擴大，說明大鼠骨質(zhì)疏松模型復制成功。

骨質(zhì)疏松癥可引起單位體積內(nèi)骨量減少，骨皮質(zhì)變薄，髓腔增寬，骨負載功能減弱，從而引起脊柱畸形甚至骨折，目前認為鈣的缺乏，激素水平，細胞因子，營養(yǎng)狀況，生活習慣，遺傳基因，藥物和疾病，運動和制動等因素與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生有關(guān)［11］。中老年人易得骨質(zhì)疏松癥，是由于隨年紀的增大，體內(nèi)血鈣被酸性物質(zhì)所中和，導致血鈣含量下降，引起體內(nèi)鈣失衡。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥在老年女性中高達82.30%，其原因是卵巢活性下降，合成激素效率降低，導致鈣的流失。所以，雌激素替代療法效果較為明顯，而亞麻木酚素屬于植物雌激素樣物質(zhì)，具備雌激素的結(jié)構(gòu)，臨床研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過亞麻木酚素治療的患者在治療后體內(nèi)BMD和血清鈣明顯升高，增強甲狀腺旁腺激素的敏感性，重新催生新的骨基質(zhì)，同時還能起到抑制骨吸收，降低其轉(zhuǎn)換率［12-15］。研究顯示，亞麻木酚素能增加模型大鼠股骨重量，升高血清鈣和磷的含量，增加骨鈣含量，也能不同程度提高Pmax，Lmax，Mmax和骨應變，骨組織形態(tài)學顯示骨小梁數(shù)量增加，骨小梁厚度增厚，平均骨小梁間距減少，骨小梁體積百分比增大，平均骨皮質(zhì)厚度增加。亞麻木酚素對實驗性骨質(zhì)疏松具有一定的治療作用，但其作用機制還有待進一步研究。

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Objective：To observe the therapeutic effect of FLs on . Method: 60 SD rats were divided into the control group， the model control group， the positive control group， low dose FLs group， middle dose FLs group and high dose FLs group in random. Each group were given prednisone acetate by gavage and were given retinoic acid by gavage on the 8th day except the normal control group. On the 14th day， the rats in low dose FLs group， middle dose FLs group and high dose FLs group were given different dose FLs suspension by gavage. The positive control group were given E2 by gavage. The normal control group and the model control group were given an equivalent amount of normal saline. It last 14 days continuously. Result: After the model was built， compared with that of the normal group， the content of calcium and phosphorus in serum of the model group decreased significantly（P＜0.05，P＜0.01），the content of calcium in bone of the model group decreased （P＜0.05)， Pmax and Mmax decreased significantly（P＜0.05，P＜0.01）. Compared with that of the model group， the femur weight of high dose FLs group increased（P＜0.05），the content of calcium and phosphorus in serum of the high dose FLs group and middle dose FLs group decreased significantly（P＜0.05，P＜0.01）， the content of calcium in bone of each dose FLs group increased significantly（P＜0.05）， Pmax，Lmax，Mmax and stress and strain of bones increased in different degree（P＜0.05，P＜0.01）.The quantity of bone trabecula increased， the thickness of of bone trabecula increased， the mean trabecular bone spacing(mtbs) decreased，the volume fraction of bone trabecula increased and average cortical bone thickness increased（P＜0.05，P＜0.01）. Conclusion: FLs has certain therapeutic effect on osteoporosis rats due to prednisone acetate and retinoic acid.

FLs；Osteoporosis rat model；Therapeutic effect

R271.917.5

B

1004-2814（2016）10-0948-03

蘭州市科技支撐項目（2012-2-77）

李喜香

2016-05-19