基于金銀復(fù)合納米粒子的三聚氰胺檢測*

姜翠鳳，吳銀杏，翟雪松，宋 娟

(鹽城工學(xué)院材料工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051)

?

分析測試

基于金銀復(fù)合納米粒子的三聚氰胺檢測*

姜翠鳳，吳銀杏，翟雪松，宋 娟

(鹽城工學(xué)院材料工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051)

為實(shí)現(xiàn)三聚氰胺的快速簡便檢測，我們提出一種基于金銀復(fù)合納米粒子，利用紫外吸收光譜檢測三聚氰胺的方法。首先，以金納米粒子為晶種制備金銀復(fù)合納米材料。然后，基于三聚氰胺誘導(dǎo)復(fù)合粒子聚集而使其紫外吸收光譜發(fā)生變化的原理，構(gòu)建以金銀復(fù)合納米粒子為基底的三聚氰胺傳感器，具有較好的準(zhǔn)確度和選擇性。該方法樣品制備無需修飾，且成本大大降低；檢測過程簡便快速，10 min即可完成檢測，有望應(yīng)用于三聚氰胺的實(shí)時(shí)快速檢測。

金銀；復(fù)合納米粒子；三聚氰胺；快速；檢測

三聚氰胺(Melamine)，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，簡稱三胺。因其含氮量為66%，是牛奶含氮量的4倍，一些不法商家經(jīng)常將三聚氰胺添加到食品中冒充蛋白質(zhì)[1]。然而，三聚氰胺不能被人體代謝，長期攝入會(huì)對人體健康造成不利影響，嚴(yán)重的甚至能引起死亡[2]。2008年9月，中國發(fā)生因食用三鹿嬰幼兒奶粉導(dǎo)致嬰幼兒產(chǎn)生腎結(jié)石病癥的嚴(yán)重事件，一時(shí)間引起人們對三聚氰胺的高度關(guān)注。準(zhǔn)確、靈敏、快速的檢測三聚氰胺成為國家和廣大科研工作者關(guān)注的課題。目前，檢測三聚氰胺的方法主要有：液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜以及酶聯(lián)免疫吸附分析法等[1,3-5]。這些方法雖然各有優(yōu)點(diǎn)，但是需要精密的大型儀器、復(fù)雜的樣品前處理和專業(yè)操作人員，不能滿足便利、實(shí)時(shí)、快速檢測三聚氰胺的需求。比色法的出現(xiàn)為三聚氰胺的實(shí)時(shí)快速檢測提供了新思路。例如，鐘堅(jiān)海等[6]利用三聚氰胺可以使金納米顆粒聚集變色的特性，向納米金溶液中加入適量的三聚氰胺，即可由納米金溶液顏色由紅色變?yōu)樽仙?，從而?shí)現(xiàn)了可視化檢測三聚氰胺。又如公開號為CN101846631A的中國專利通過金納米粒子的制備、冠醚的衍生化、金納米粒子偶聯(lián)冠醚、運(yùn)用金納米粒子自組裝和分子識(shí)別檢測三聚氰胺[7]。根據(jù)金納米粒子體系的顏色變化，可檢測奶粉中的三聚氰胺含量。然而，目前報(bào)道的比色(紫外可見吸收)法檢測三聚氰胺多用金納米粒子做探針。要實(shí)現(xiàn)檢測的批量化和市場化，成本較高。因此，開發(fā)免修飾、低成本的納米探針用于比色法檢測三聚氰胺成為三聚氰胺檢測中面臨的關(guān)鍵問題。

本文提出一種利用金銀復(fù)合納米材料做探針，通過紫外可見吸收光譜檢測三聚氰胺的方法。首先在水相環(huán)境中，以金納米粒子為晶種原位制備金銀復(fù)合納米粒子，通過控制抗壞血酸的加入速度獲得尺寸均勻的納米粒子。然后，基于三聚氰胺誘導(dǎo)金銀復(fù)合納米粒子聚集而使其紫外可見吸收光譜發(fā)生變化的原理，構(gòu)建以金銀復(fù)合納米粒子為基底的三聚氰胺傳感器，具有較好的靈敏度和選擇性。該方法樣品制備無需修飾，且只有晶種用到金納米粒子，成本大大降低；檢測過程簡便快速，10 min 即可完成檢測；靈敏度和選擇性較好，有望應(yīng)用于三聚氰胺的實(shí)時(shí)快速檢測。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 金銀復(fù)合納米粒子的制備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

硼氫化鈉(NaBH4)，安耐吉化學(xué)；L-抗壞血酸，Alfa Aesar；氯金酸(HAuCl4·3H2O)、檸檬酸鈉、硝酸銀，Sigma Aldrich；三聚氰胺、谷胱甘肽、葡萄糖、果糖、麥芽糖、胸腺嘧啶、KCl、CaCl2，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

所有玻璃儀器均用王水(濃HNO3:濃HCl=1:3)洗滌。除特別說明，實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.1.2 金銀復(fù)合納米粒子的制備方法

金納米粒子的制備：將1.47 mg檸檬酸鈉和1.97 mg HAuCl4·3H2O溶解在20 mL水中，劇烈攪拌，向其中加入0.2 mL 0.1 M的新鮮NaBH4溶液(用冰水配制)，2 s后，溶液變成棕紅色，表明金納米粒子生成，繼續(xù)攪拌5 min，備用。

金銀復(fù)合納米粒子的制備：向溶解有10 mg AgNO3和30 mg 檸檬酸鈉的50 mL水溶液中迅速加入3 mL金納米粒子溶液。然后將30 mg(10 mL)抗壞血酸，逐滴加入到上述溶液中，約10 min加完。黑暗處繼續(xù)攪拌1 h, 得到棕黃色的金銀復(fù)合納米粒子溶液。

1.2 樣品的性能及表征

將納米粒子溶液滴到銅網(wǎng)上(2滴)，然后用場發(fā)射透射電子顯微鏡FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN進(jìn)行觀測獲得透射電鏡照片。UV-Visible紫外可見吸收光譜由Shimadzu公司UV-2450紫外可見分光光譜儀測得。

1.3 檢測實(shí)驗(yàn)

取0.2 mL所制備的復(fù)合納米粒子溶液，加入不同濃度的三聚氰胺，混合均勻后，靜置10 min，加一定量的去離子水稀釋，進(jìn)行紫外可見分光光譜表征。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米粒子形貌表征

傳統(tǒng)方法制備金銀復(fù)合納米粒子存在尺寸不均的問題，本文以金納米粒子為晶種，原位制備金銀復(fù)合納米材料，通過控制抗壞血酸的加入速度，得到尺寸均勻的復(fù)合納米粒子。對所制備的納米粒子進(jìn)行透射電鏡表征，照片如圖1所示。從圖1中可見，金納米種子的尺寸約為 4 nm，而復(fù)合粒子為球形，尺寸約為 13 nm，復(fù)合粒子大小均勻，分散性好，從透射電鏡中不能辨別是否核殼結(jié)構(gòu)?？箟难岷拖跛徙y加入后，在檸檬酸鈉做表面保護(hù)劑的情況下，金納米粒子做晶種，在其表面上，抗壞血酸還原硝酸銀得到納米銀，隨著抗壞血酸的繼續(xù)加入，納米銀不斷長大，直到形成最后的復(fù)合納米粒子[8]。

圖1 所制備的金納米種子(a)、金銀復(fù)合

2.2 紫外-可見吸收光譜分析

為了研究復(fù)合粒子隨時(shí)間的成長過程，對所制備的金納米粒子和金銀復(fù)合納米粒子溶液進(jìn)行紫外可見分光光譜表征，如圖 2所示。從圖2可見，所得金納米種子溶液為酒紅色，在520 nm處有一吸收峰。而金銀復(fù)合納米粒子呈深黃色，紫外吸收峰在400 nm，與純銀納米粒子的吸收峰值相似[9]。為了研究復(fù)合粒子的生長過程，我們對其吸收光譜隨反應(yīng)時(shí)間的變化進(jìn)行監(jiān)測，結(jié)果如圖3所示。從圖3可見，檸檬酸鈉、硝酸銀、金種子溶液、抗壞血酸加入的瞬間，金納米種子在520 nm的特征吸收峰消失，而400 nm出現(xiàn)新的吸收峰，表明金銀復(fù)合納米粒子的形成。這是因?yàn)榭箟难崾菑?qiáng)還原劑，短時(shí)間內(nèi)迅速將銀離子還原為納米銀。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，400 nm的吸收峰值越來越高，在反應(yīng)60 min后達(dá)到最大值并不再變化，表明反應(yīng)已經(jīng)完全結(jié)束。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸加入的速度與復(fù)合納米粒子的均勻性有著密切關(guān)系，10 min左右逐滴加入抗壞血酸，所得納米粒子尺寸均勻。反之，若抗壞血酸一次性急速加入，則納米粒子尺寸不一。

圖2 金納米種子溶液(a)和Au/Ag復(fù)合納米粒子(b)的圖片及

圖3 復(fù)合納米粒子吸收光譜隨反應(yīng)時(shí)間的變化

2.3 三聚氰胺檢測線性范圍與檢測限

三聚氰胺是一種工業(yè)粘合劑，由于其富含氮而經(jīng)常被添加到食品中。食品中三聚氰胺的添加會(huì)造成腎臟和泌尿系統(tǒng)的疾病，實(shí)驗(yàn)證明長期攝取三聚氰胺可造成人體多臟器官損害[6]。所以三聚氰胺的檢測成為分析檢測領(lǐng)域一個(gè)非常重要的課題。

貴金屬納米粒子存在等離子體共振現(xiàn)象，具有局部表面等離子體共振吸收峰。研究表明，納米粒子的形狀和聚集狀態(tài)對等離子體共振峰的位置有著顯著的影響[10-11]。基于此，貴金屬納米材料被用于化學(xué)與生物分子的檢測[12-13]。本文正是利用這一原理設(shè)計(jì)了檢測三聚氰胺的傳感體系。將三聚氰胺加入復(fù)合粒子溶液中后，溶液顏色發(fā)生了顯著改變，從原來的淡黃色變?yōu)樯铧S色，隨著三聚氰胺濃度的增大，顏色變?yōu)楹邳S色(圖4所示)。通過TEM照片可以非常清晰的觀察納米粒子的形態(tài)，加入三聚氰胺后，復(fù)合粒子發(fā)生了聚集(圖1c)。如圖4所示，單純的復(fù)合納米粒子分布均勻，加入三聚氰胺后，復(fù)合粒子開始聚集，且聚集程度很高，說明三聚氰胺導(dǎo)致了復(fù)合粒子的聚集。這是因?yàn)槿矍璋贩肿又腥齻€(gè)胺基的氮原子可與復(fù)合粒子表面結(jié)合，而三聚氰胺分子之間又可以形成氫鍵，通過相鄰的復(fù)合粒子上三聚氰胺分子之間的氫鍵作用而使復(fù)合粒子發(fā)生聚集[14]。通過紫外可見吸收光譜對三聚氰胺濃度進(jìn)行監(jiān)測，隨著三聚氰胺的加入，復(fù)合粒子在400 nm的吸收峰降低，并且隨著三聚氰胺濃度的增大，逐漸降低，而在636 nm出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰。400 nm的吸收值代表單分散的納米粒子，而636 nm的吸收值代表聚集的納米粒子，因此，A636/A400代表聚集的納米粒子與單分散的納米粒子數(shù)目之比。用A636/A400對三聚氰胺的濃度作曲線，呈線性關(guān)系，最低檢測限為0.025 mM，檢測范圍從0.083 mM到2.04 mM。

圖4 復(fù)合納米粒子紫外可見吸收光譜隨三聚氰胺濃度的

圖5 A636/A400對三聚氰胺濃度的曲線圖

2.4 選擇性

為考察體系對三聚氰胺檢測的特異性，分別加入1.6 mM的干擾物質(zhì)進(jìn)行測試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、麥芽糖、果糖、K+、抗壞血酸、胸腺嘧啶等生物體內(nèi)常見成分的A636/A400均很小，谷胱甘肽和Ca2+的A636/A400略大，但與三聚氰胺的A636/A400相比，相對較小，表明用此復(fù)合粒子檢測三聚氰胺具有較好的選擇性。

圖6 金銀復(fù)合納米粒子用于三聚氰胺檢測的選擇性

2.5 回收率測定

為了進(jìn)一步證明金銀復(fù)合納米粒子可以用來檢測三聚氰胺，選取0.8 mM和1.5 mM兩個(gè)濃度點(diǎn)，進(jìn)行了自來水和去離子水樣品的加入回收試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。從表中可以看出，無論在自來水還是去離子水中，用金銀納米復(fù)合粒子對三聚氰胺的檢測都具有較好回收率，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)都較小，說明所設(shè)計(jì)的方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表1 自來水和去離子水中三聚氰胺的回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 結(jié) 論

本文以金銀復(fù)合納米粒子為探針，利用紫外可見吸收光譜法實(shí)現(xiàn)了三聚氰胺的快速、低成本檢測。首先在水相環(huán)境中，以金納米粒子為晶種原位制備了尺寸均勻的金銀復(fù)合納米粒子，尺寸約為13 nm。然后，基于三聚氰胺引起復(fù)合納米粒子聚集而使其紫外可見吸收光譜發(fā)生變化的原理,對三聚氰胺進(jìn)行檢測，最低檢測限為0.025 mM，檢測范圍從0.083 mM到2.04 mM，且具有較好的選擇性。在自來水和去離子水樣品中進(jìn)行的加入回收試驗(yàn)結(jié)果顯示，回收率較高，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小?？傊?，該方法所需復(fù)合粒子探針制備簡單，無需修飾，成本較低；檢測過程快速，且具有較高的準(zhǔn)確度，在三聚氰胺的實(shí)時(shí)快速以及產(chǎn)業(yè)化檢測中具有巨大的應(yīng)用潛力。

[1] Adriana ZM, Martyna M, Magdalena D.Noble metal-based bimetallic nanoparticles: the effect of the?structure on the optical, catalytic and photocatalytic properties[J].Advances in Colloid and Interface Science,2016,229:80-107.[2] 張延彪,徐超,姚輝,等.表面等離子體共振生物傳感器及其應(yīng)用[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2012, 28(1):126-132.

[3] 史燁弘,石欲容.超高速液相色譜測定奶粉中的三聚氰胺[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2009, 25(2):214-216.

[4] 徐昊,劉慶軍,馬蓉.含乳食品中三聚氰胺檢測方法研究進(jìn)展[J].綠色科技,2015(8):265-267.

[5] 白文薈,劉金釧,朱超,等.納米金比色法在三聚氰胺檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全,2015(1):26-31.

[6] 林祥梅,王建峰,賈廣樂,等.三聚氰胺的毒性研究[J].毒理學(xué)雜志,2008,22(3):216-218.

[7] 胥傳來,嚴(yán)文靜,陳偉,等.一種金納米粒子比色法快速檢測奶粉中三聚氰胺含量的方法[P].中國:CN101846631A,2010-09-29.

[8] 梁芳慧,靳丹紅,馬品一,等.三聚氰胺檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器,2013(4): 62-67.

[9] 李秀燕.銀納米粒子的消光光譜與粒子形狀的關(guān)系[J].漳州師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2007(2):62-66.

[10]Zeng SD, Baillargeat HP, Yong KT.Nanomaterials enhanced surface plasmon resonance for biological and chemical sensing applications[J].Chem Soc Rev, 2014,43(10):3426-3452.

[11]Sun F, Ma W, Xu L, et al.Analytical methods and recent developments in the detection of melamine[J].Trends in AnalyticalChemistry,2010,29(11):1239-1249.

[12]Wang R, Yao Y, Shen M, et al.Green synthesis of Au@Ag nanostructures through a seed-mediated method and their application in SERS[J].Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2016,492:263-272.

[13]Palanisamy S, Zhang X, He T.Simple colorimetric detection of dopamine using modified silver nanoparticles[J].Science China Chemistry,2015,59(4):387-393.

[14]鐘堅(jiān)海,吳金梅,郭良洽,等.納米金比色法快速檢測三聚氰胺的研究[J].分析化學(xué), 2008,37(z1):81.

Detection of Melamine Based on Au/Ag Nanocomposite*

JIANGCui-feng,WUYin-xing,ZHAIXue-song,SONGJuan

(School of Materials Engineering, Yancheng Institute of Technology, Jiangsu Yancheng 224051, China)

To achieve rapid and simple detection of melamine, a method based on Au/Ag nanocomposite by using UV-Visible spectra was proposed.Firstly, Au/Ag nanocomposite was prepared by using Au nanoparticles as seed.Then, a sensing platform for melamine was fabricated based on the principle that melamine induced aggregation of Au/Ag nanocomposite, leading to change of UV-Vis spectra.The assay displayed good accuracy and selectivity.The proposed method is label-free and low cost due to use of Au/Ag nanocomposite instead of Au nanoparticles.The whole detect process is simple and fast, which can be finished in 10 min.Thus, the method could be used in real-time and rapid detection of melamine.

Au/Ag; nanocomposite; melamine; rapid; detection

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21605128)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20150427)。

姜翠鳳(1982-)，女，副教授，研究方向：貴金屬納米材料的制備及應(yīng)用。

TB331

A

1001-9677(2016)019-0132-04