吐魯番黑羊?qū)氩呃蘸谘蚨嗵セ颍‵ecB）的初步研究

古麗格娜，蔣曉梅，艾買提·買買提，史洪才，牛志剛，儲明星

（1.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830000；2.新疆托克遜縣地方國營牧場，托克遜 838100；3.新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830000）

吐魯番黑羊?qū)氩呃蘸谘蚨嗵セ颍‵ecB）的初步研究

古麗格娜1，蔣曉梅1，艾買提·買買提1，史洪才2，牛志剛2，儲明星3

（1.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830000；2.新疆托克遜縣地方國營牧場，托克遜 838100；3.新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830000）

以592只吐魯番黑羊與策勒黑羊雜交一代羊為實驗群體，采用PCR-RFLP技術(shù)分析了FecB基因的多態(tài)性。結(jié)果表明：吐魯番黑羊?qū)氩呃蘸谘蜓汉?，雜交一代個體中出現(xiàn)BB、B+和++三種基因型，其基因型頻率分別為0.181、0.411、0.408；B、+兩種等位基因頻率分別為0.615、0.385；經(jīng)χ2檢驗，吐魯番黑羊?qū)氩呃蘸谘蜓汉螅s交一代群體在FecB基因位點上均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P＜0.01），且該位點上呈現(xiàn)出中度的多態(tài)性（PIC=0.362）。研究結(jié)果提示，F(xiàn)ecB基因能夠作為吐魯番黑羊與策勒黑羊雜交育種多胎性能的候選基因，為多胎羊分子育種研究提供理論依據(jù)。

吐魯番黑羊；策勒黑羊；FecB基因

吐魯番黑羊是以生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)羔羊肉和羔皮為主的優(yōu)良新疆地方綿羊品種之一，也稱托克遜大尾黑羊，其主要產(chǎn)區(qū)位于吐魯番地區(qū)托克遜縣［1］。吐魯番黑羊具有適應(yīng)夏季酷熱、冬季嚴(yán)寒、多風(fēng)沙的吐魯番盆地氣候；能耐受粗纖維多、木質(zhì)化強、多刺、耐鹽堿抗干旱的牧草植物，且能快速增膘和生長迅速等特點。吐魯番本地大尾羊，角短、大尾脂、粗毛，被毛顏色栗、黃、花、黑不一，是以短脂尾蒙古系巴音布魯克大尾羊為父本，以肥臀型哈薩克羊為母本的雜交后代。20世紀(jì)60年代，吐魯番地區(qū)引進(jìn)庫車羔皮羊卡拉庫爾羊雜交改良吐魯番本地大尾羊，經(jīng)多年自群繁育，雜交后代既保持了原本地羊大尾脂的特征，同時又遺傳了庫車羔皮羊黑色被毛的特征，最終形成了遺傳特征基本穩(wěn)定的吐魯番黑羊，深受當(dāng)?shù)厝罕姷南矏郏?］。

FecB基因位于綿羊6號常染色體，對綿羊的排卵率及產(chǎn)羔數(shù)有較大影響［3-4］。該基因?qū)嶋H為骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白IB型受體基因（bonemorphogenetic protein receptor IB，BMPR-IB）。在澳大利亞多胎綿羊品種Booroola羊中BMPR-IB基因編碼序列中有1個A746G突變，正是這個突變（Q249R）與Booroola母羊的高繁殖力密切相關(guān)，導(dǎo)致攜帶該突變基因的綿羊產(chǎn)羔數(shù)增加［5-6］。

策勒黑羊是新疆以產(chǎn)羔皮為主的多胎優(yōu)良地方綿羊品種，其主要產(chǎn)區(qū)位于塔克拉瑪干大沙漠南緣、昆侖山北麓的策勒縣，全年發(fā)情和繁殖率高是其突出的品種特征［7-8］。本研究緊密結(jié)合新疆策勒黑羊高繁品系的育種現(xiàn)狀，應(yīng)用國內(nèi)外羊多胎基因研究成果，通過地方品種的雜交，研究吐魯番黑羊群體導(dǎo)入策勒黑羊公羊血液后，雜交一代羔羊群體中FecB基因與高繁殖力之間的相關(guān)性，以期為指導(dǎo)高繁品系選育，加快育種進(jìn)程提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

在新疆吐魯番地區(qū)吐克遜縣地方國營牧場采集策勒黑羊與吐魯番黑羊雜交一代90日齡羔羊血樣592份。頸靜脈采血5 mL/只，用肝素鈉抗凝，-20℃凍存。

1.2主要試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP購于北京天根生物技術(shù)有限公司，限制性內(nèi)切酶AvaⅡ、DNA Marker等購自BBI公司（加拿大）。

1.3方法

1.3.1基因組DNA的提取 采用常規(guī)酚氯仿抽提法從抗凝血中提取基因組DNA，用紫外分光光度計測定基因組DNA濃度和純度，稀釋DNA樣品至50 ng/μL左右，置-20℃冰箱中備用。

1.3.2引物設(shè)計根據(jù)綿羊FecB基因的突變位置，在引物上引入一個錯配堿基，與該突變位點形成一個AvaⅡ的酶切位點。引物由上海生工生物工程公司合成。

表1　FecB基因引物序列

1.3.3PCR-RFLP檢測對策勒黑羊與吐魯番黑羊雜交一代90日齡羔羊血樣的基因組DNA進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)體系：10×Buffer 2 μL，10 μmol/L上下游引物各1μL，10mmol/LdNTP2 μL，25mmol/LMg2+1.5μL，50 ng/μL左右的DNA模板1 μL，2.5 U/μLTaq DNA聚合酶0.5 μL，加去離子水至總體積為20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，62℃退火40 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

用限制性內(nèi)切酶AvaⅡ?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系：10×緩沖液1 μL，PCR反應(yīng)產(chǎn)物為4 μL，10 U/μLAvaⅡ內(nèi)切酶為0.8μL，加去離子水至總體積10μL。酶切反應(yīng)條件：37℃水浴6 h，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物加樣于3%瓊脂糖凝膠電泳檢測和判讀酶切結(jié)果。

1.3.4數(shù)據(jù)處理用Picalc程序包計算多態(tài)信息含量（用以估計標(biāo)記基因的多態(tài)性，PIC＞0.5則該標(biāo)記呈現(xiàn)高度多態(tài)，0.25＜PIC＜0.5呈現(xiàn)為中度多態(tài)，PIC＜0.25呈現(xiàn)為低度多態(tài)）；用PopGene32軟件計算基因型頻率、等位基因頻率、基因純合度（Ho）、基因雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）及多態(tài)信息含量（PIC）。

2　結(jié)果與分析

2.1FceB基因多態(tài)位點的PCR-RFLP擴增結(jié)果

本實驗以策勒黑羊與吐魯番黑羊雜交一代90日齡羔羊的基因組DNA為模板進(jìn)行擴增后，得到了預(yù)期的目的片段，大小為141 bp，見圖1。

AvaⅡ限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物后，出現(xiàn)3種帶型：++基因型為141 bp，B+基因型為141 bp和111 bp，BB基因型為111 bp。30 bp遷移到凝膠外，觀察不到，但不影響結(jié)果判定，見圖2。

圖2　FecB酶切電泳圖

2.2FecB基因多態(tài)位點的等位基因頻率和基因型頻率

對策勒黑羊與吐魯番黑羊雜交一代90日齡羔羊群體進(jìn)行FecB基因突變的多態(tài)性檢測，檢測到突變純合子（BB）107只、突變雜合子（B+）243只、未發(fā)生突變（++）個體242只?；蛐皖l率及等位基因頻率見表2。

表2　吐魯番黑羊?qū)氩呃蘸谘蜓弘s交一代90日齡羔羊FecB基因型頻率及等位基因頻率

2.3Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)檢驗

遺傳雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC）是衡量群體遺傳變異和遺傳多態(tài)性的合適參數(shù)。不同的遺傳參數(shù)體現(xiàn)出各群體其遺傳上的本質(zhì)差異。從表3看出，吐魯番黑羊?qū)氩呃蘸谘蜓汉?，雜交一代90日齡羔羊群體的FecB基因序列的多態(tài)信息含量（PIC）為0.362，屬于中度多態(tài)，即吐魯番黑羊?qū)氩呃蘸谘蜓?，雜交一代90日齡羔羊群體遺傳變異處于中等水平。

表3　吐魯番黑羊?qū)氩呃蘸谘蜓弘s交一代90日齡羔羊群體FecB基因遺傳參數(shù)

3　討論

近年來，國內(nèi)外研究者在關(guān)于綿山羊多胎基因分子標(biāo)記研究方面取得了一定的進(jìn)展。作為綿羊高繁殖力的第1個主效基因，F(xiàn)ecB基因首次在澳大利亞Booroola Merino綿羊中被發(fā)現(xiàn)。1993年，Montgomery等［9］首先發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ecB基因與微衛(wèi)星基因座OarAE101和OarHH55緊密連鎖，遺傳距離分別為13 cM和20 cM。1994年，Montgomery等［5］又采用連鎖分析法將FecB基因定位到OarAE101和EGF（表皮生長因子）/IF（補體因子1）之間的區(qū)域，趨向于綿羊6號染色體的著絲粒。1998年，Lord等［6］通過在EGF與微衛(wèi)星標(biāo)記OarAE101之間加入2個微衛(wèi)星基因座McM53和OarJL1A以及1個基因座著絲粒自身抗原E，進(jìn)一步將FecB基因精確定位在綿羊6號染色體著絲粒區(qū)的微衛(wèi)星標(biāo)記OarAE101和BM1329之間的10 cM區(qū)間內(nèi)。2001年，Mulsant等［10］將FecB基因定位于該區(qū)域微衛(wèi)星基因座471 U和300 U之間小于1 cM的區(qū)間內(nèi)，而微衛(wèi)星BMS2508和LSCV043為位于FecB基因區(qū)域兩端最近的標(biāo)記，遺傳距離分別為1.5 cM和2.3 cM，微衛(wèi)星基因座GC101則位于FecB基因突變區(qū)內(nèi)；在Booroola綿羊的回交群體中檢測到471 U的3個等位基因。2006年，殷子惠等［11］首先在小尾寒羊中分析了FecB基因與微衛(wèi)星標(biāo)記Oar J L36的連鎖關(guān)系，結(jié)果顯示FecB基因B等位基因與Oar J L 36之間仍然存在重組，但其研究群體僅為72只BB型的小尾寒羊，具有一定的局限性。2007年，管峰等［12］在101只湖羊中檢測到471U的3個等位基因，471U的PIC為0.405；湖羊微衛(wèi)星基因座 471 U的 196/200、200/200、200/204和204/204基因型之間的產(chǎn)羔數(shù)均無顯著差異（P＞0.05）。

本實驗對吐魯番黑羊?qū)氩呃蘸谘蜓汉螅s交一代90日齡羔羊群體的FecB基因突變多態(tài)性檢測結(jié)果表明，突變雜合子（B+）和未發(fā)生突變（++）基因型是主要基因型，基因型頻率分別為0.411和0.408；等位基因以B等位基因占優(yōu)勢，占群體的61.5%，+等位基因頻率為38.5%。B＋基因型（雜合子）的出現(xiàn)說明品種改良雜交新品種群也存在與Booroola Merino羊相同的突變位點，此結(jié)果與史洪才等［13］將BMPR-IB基因作為新疆多浪羊多胎性能候選基因的研究結(jié)果相近。在實際生產(chǎn)過程中，可以根據(jù)攜帶FecB突變的情況開展選種選配，指導(dǎo)吐魯番黑羊肉用綿羊高繁品系的選育，為加快新品種的育種進(jìn)程提供理論依據(jù)。由本研究結(jié)果可知，吐魯番黑羊?qū)氩呃蘸谘蜓汉螅s交一代群體基因頻率分布處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P＜0.01），這可能與檢測過程中公母羊比例以及選擇有關(guān)，另一方面也可能與樣本量少有關(guān)。

4　結(jié)論

本研究首次分析了FecB基因在吐魯番黑羊?qū)氩呃蘸谘蜓汉?，雜交一代90日齡羔羊群體中的遺傳多態(tài)性，檢測到了FecB基因存在BB、B+、++三種基因型，B、+兩種等位基因。研究結(jié)果提示，F(xiàn)ecB基因存在于吐魯番黑羊與策勒黑羊雜交一代羔羊群體中。

致謝：感謝新疆托克遜國營牧場伊力哈木等工作人員在血樣采集和資料收集過程中給予的大力支持和幫助。

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S826.2

A

2095-3887（2016）01-0009-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.01.003

2015-12-08

新疆維吾爾自治區(qū)科技援疆項目（2013911056）

古麗格娜，女，副研究員。

儲明星，男，研究員，博士，博士生導(dǎo)師。