在水稻上種出“人血清白蛋白”

文|楊代常 武漢大學 編輯|孫潔

在水稻上種出“人血清白蛋白”

文|楊代常 武漢大學 編輯|孫潔

項目成果：水稻胚乳細胞生物反應器及其應用

課題單位：武漢大學

目前全世界范圍內血漿都十分緊缺，各國除了從血漿中提取人血清白蛋白之外，都試圖采用生物技術生產、重組。武漢大學生命科學學院的楊代常教授改造了水稻種子從而制造大量的人血清白蛋白，占了種子的總可溶性蛋白的大約10%。

人血白蛋白具有多種臨床應用價值，是我國的一線大宗臨床用藥，廣泛地用于肝硬化腹水、燒傷燙傷、手術后體液的補充、失血過多導致的休克、腦水腫、癌癥和艾滋病人放化療的輔助治療等。由于1克HSA可保留18 毫升的水，每5克的HSA保留循環(huán)內水分的能力約相當于100毫升血漿或200毫升全血的功能，在戰(zhàn)場上可用于補充因失血導致的體液流失。此外，還被廣泛地用于疫苗的賦形劑、蛋白藥物的保護劑以及動物細胞和干細胞培養(yǎng)的添加劑。我國HSA每年需求量估計在420噸左右。隨著國內外生物醫(yī)藥產業(yè)的蓬勃發(fā)展，HSA的市場需求將持續(xù)增加。

由于HSA在臨床和生物技術中具有重要作用，存在巨大的市場需求，為擺脫血漿來源有限的產能限制，以及解決利用血漿來源的市售人血清白蛋白存在傳染病毒如艾滋病病毒和肝炎病毒等的風險，各國科學家一直在努力尋找一種不依賴血漿、安全廉價的重組人血清白蛋白（recombinant Human Serum Albumin，rHSA）的技術。自1987年開始，科學家們在細菌、酵母、動物細胞和植物等宿主中進行了大量的探索和嘗試，并取得了一定的進展，但細菌、酵母、動物細胞各有缺陷，被證明不適于表達重組人血清白蛋白。

水稻胚乳細胞具有完整的真核細胞蛋白質加工體系，重組蛋白質的翻譯、折疊和修飾都與哺乳細胞十分相近；而原核細菌以及酵母表達系統(tǒng)對蛋白的折疊和翻譯后修飾都與人類有很大區(qū)別，產生的蛋白存在錯誤折疊和修飾的差異。OsrHSA經內膜系統(tǒng)進行加工和折疊成結構正確的有活性的蛋白質，并儲藏在水稻種子的蛋白體內。

水稻種子繁殖系數(shù)高達1000倍以上，獲得大量的蛋白質只需擴大水稻種植面積，而且容易儲藏。而基于細胞培養(yǎng)和發(fā)酵的表達體系在擴大生產時，需要進行購置細胞生物反應器或者發(fā)酵罐及其相應設施，技術要求十分苛刻，不僅需要很大的固定資產投資，而且周期長。利用基因工程動物生產重組蛋白，實現(xiàn)規(guī)?；a受限于非常長的動物繁殖周期。該發(fā)明技術只需在2年內可實現(xiàn)公斤級的重組蛋白質產品。

重組蛋白質在水稻種子可保存4年，蛋白質活性不會喪失，具有極強的穩(wěn)定生產能力，保障穩(wěn)定的產品供應。由于水稻種子的儲藏蛋白不僅種類少，而且生化性質非常清楚。尤其是水稻基因組數(shù)據詳實，為設計分離純化工藝提供了良好的技術支撐，因而加工、提取和純化工藝較為簡單，從水稻米粉中提取OsrHSA只需3步柱層析即可達到企業(yè)質量標準，單批次生產周期僅需2.5天。

水稻是我國的主食，已有幾千年的食用歷史，其生物學背景清楚，目前沒有任何有關動物病原菌和病毒侵入植物細胞和植物病毒與人共患的報道，因而利用水稻表達重組蛋白質，完全杜絕動物或人類病原菌或病毒的污染，具有更好的安全性。較傳統(tǒng)的微生物如細菌或酵母發(fā)酵技術、哺乳動物細胞培養(yǎng)以及基因工程動物都可能存在內毒素、病原細菌、動物病毒等污染可能存在人畜共患的病原而引發(fā)傳染疾病的風險；尤其是酵母或細菌的細胞壁具有復雜的糖結構，人對這類反應較為敏感。水稻沒有人源性傳染性疾病的病菌和病毒，還可避免血源性疾病。

水稻胚乳細胞生物反應器將通過發(fā)酵來合成蛋白質改為通過植物利用光合作用來完成，省去了在發(fā)酵過程中消耗大量能源和大量的污水排放問題，因而具有綠色環(huán)保特點。比較該技術與酵母發(fā)酵技術生產一克重組HSA的能耗估算：1克重組HSA的水稻原料生產過程的能耗是酵母的1/28。

水稻胚乳成為“蛋白生產車間”

水稻胚乳生物反應器技術是利用基因工程技術改造水稻，以水稻胚乳作為“蛋白生產車間”來表達和生產重組蛋白質或者多肽的技術。整個生產過程包含了基因克隆、蛋白表達，原料種植、收獲、運輸、儲藏，蛋白提取、純化、加工等技術（圖1）。水稻胚乳生物反應器以農業(yè)的形式完成原料生產，而加工過程和最終產品又以醫(yī)藥的形式完成，將農業(yè)和制藥業(yè)有機整合，因此又叫分子醫(yī)藥（Molecular Pharming），其產品稱為植物源重組藥物。

課題組利用水稻胚乳特異性啟動子、水稻偏愛密碼子優(yōu)化、蛋白質定向存儲技術，根據人血清白蛋白氨基酸序列，人工合成水稻偏愛密碼子的人血清白蛋白基因全序列，將它克隆到水稻胚乳特異性的谷蛋白基因Gt13a的啟動子和信號肽之后，構建了水稻轉化載體pOsPMP114，然后轉化成水稻植株，通過Western-blotting檢測篩選出在水稻胚乳高效表達OsrHSA的基因工程純合品系4-114-7。表達產物經Western-blotting、質譜分析及氨基酸N端序列、C端序列和全序列測序、等電點、圓二色譜和近紫外光譜等進行了結構確證，進一步說明OsrHSA具有與人血清白蛋白相同的一級和三級結構；通過X射線-晶體衍射證明了OsrHSA具有與HSA（2I2Z）相同的高級結構和構象。

按照我國中藥材原料生產規(guī)范，建立了GAP管理規(guī)范，按照GAP規(guī)范和農業(yè)部的《農業(yè)轉基因生物安全管理條例》建立了標準的規(guī)?；N植4-114-7-9-9-37-23水稻的生產和稻谷加工基地，可以提供優(yōu)質的原料。

OsrHSA的純化工藝經一系列中試優(yōu)化，最后確定了整個純化工藝流程，即首先高溫提取、低pH沉淀、壓濾澄清后，經過三步層析（陽離子、陰離子和疏水層析），產品純度可達96.0%以上，宿主蛋白含量不高于5微克/克白蛋白，內毒素、熱源等指標檢測合格。整個純化方法簡便，得率高，每升提取液可獲得350毫克以上純品。經過連續(xù)4批中試生產，證實了該工藝穩(wěn)定可行，能夠進行產業(yè)化放大。

“雙規(guī)”準則下的團隊管理

圖1 植物源重組人血清白蛋白技術流程

禾元生物的研發(fā)團隊由具有分子細胞生物學、藥理學、生物化學、臨床醫(yī)學等多種專業(yè)背景的技術人才組成。本科以上學歷占公司總人數(shù)的95%以上，其中碩士/博士學歷占公司總人數(shù)的30%以上。技術人員理論基礎扎實，具有蛋白質和多肽表達及純化工藝研究等生物醫(yī)藥項目研發(fā)的豐富經驗。禾元技術團隊穩(wěn)定，堅持創(chuàng)新，對應用需求、技術現(xiàn)狀和未來發(fā)展都有很深的理解，并擁有項目實施經驗。開始這個項目之前，武漢大學生命科學學院楊代常教授組織了調研團隊，對國內白蛋白的市場需求和產業(yè)發(fā)展作了詳細的調查。他發(fā)現(xiàn)，我國白蛋白需求量達到210噸/年，都是靠血漿提取。但血漿短缺度達到2/3，50%靠進口。得出結論后，研發(fā)團隊開始了夜以繼日的研究實驗。

研究所里定下“雙規(guī)”準則：所有人必須“在規(guī)定時間內完成規(guī)定任務”。2011年，這一項目獲得階段性成功，楊代常和研發(fā)團隊一起，迅速開展新工藝白蛋白產品的臨床前藥學、毒理、藥物代謝動力學和藥效評價工作。“如果一個技術開發(fā)者沒有一個控制能力的話，難以做起來。做好這個工作不容易，公司的發(fā)展和項目的推進，得益于3個‘No’—no holiday，no weekend，no day and night(沒有節(jié)假日、沒有周末、沒日沒夜)。” 楊代常和他的研發(fā)團隊成員一天一次討論實驗結果，周末晚上連續(xù)加班，僅用了兩個月就把新藥創(chuàng)制的純度從小數(shù)點后面的3個9提高到6個9，達到99.999999%的純度，是生物技術應用領域的一個飛躍?！?/p>

成果轉化與應用

科研團隊采取以市場為導向、以研發(fā)為驅動、以質量為保障的商業(yè)策略，充分發(fā)揮水稻胚乳細胞特異性表達技術平臺的各項優(yōu)勢，研發(fā)具有較大市場前景、符合技術平臺優(yōu)勢的各種醫(yī)藥產品、工業(yè)試劑和相關技術。采取產品及技術銷售與服務并舉的商業(yè)模式，短期內以產品原輔料與試劑為主、長期以生物醫(yī)藥制劑為主。采取國際與國內市場并重的營銷策略，構建“研發(fā)驅動型”的高科技企業(yè)，形成集“研發(fā)、生產、銷售”為一體的國際知名、國內首創(chuàng)的植物源生物技術企業(yè)。

藥用。人血清白蛋白（HSA）是我國的一線大宗臨床用藥，被國家列為具有重大戰(zhàn)略需求、重大市場需求和存在重大安全隱患的生物藥“三重”品種。我們利用DNA重組技術，以水稻胚乳細胞作為生物反應器生產植物源重組人血清白蛋白（Recombinant Human Serum Albumin from Oryza sativa，OsrHSA)，克服了酵母體系表達重組人血清白蛋白（recombinant Human Serum Albumin，rHSA）因結構不均一性和復雜糖結構引起的熱穩(wěn)定性差與免疫反應等問題，具有表達量高、成本低、安全性好、規(guī)?；菀?、綠色環(huán)保等優(yōu)勢。經與市售人血清白蛋白“頭對頭”比較，在一級、二級和高級結構上與市售人血清白蛋白等同；經逐級放大，研發(fā)了簡單而穩(wěn)定的提取與純化工藝，批間穩(wěn)定一致；研究并制定了符合《中國藥典》2015版要求的質量標準，除宿主蛋白、殘留核酸含量和糖蛋白含量是自行標準外，其余標準均滿足或高于《中國藥典》2015版三部的人血白蛋白標準；建立了完善而規(guī)范的質量保障體系；藥理、毒理和藥代動力學與市售人血清白蛋白一致；大鼠肝硬化腹水藥效試驗與家兔失血性休克藥效試驗結果與市售人血清白蛋白等同。

工業(yè)用。本項目的產品已進入培養(yǎng)基添加劑、美容市場，產品銷往美國、加拿大、歐盟、韓國、日本等國家，累計實現(xiàn)銷售312萬元，出口占60%。農民種植醫(yī)用轉基因水稻每畝增收980元，每年增加農民收入29.4萬元，累計增加農民收入88.2萬元；2013-2015年預計獲得100噸左右的人血清白蛋白稻谷原料，可生產人血清白蛋白390～450公斤，含有人血清白蛋白的稻谷產值1006萬元。

人血清白蛋白技術具有完全自主知識產權，國內首創(chuàng)、國際領先，標志著我國植物生物反應器的研究與應用走在世界前列，將對我國醫(yī)藥乃至國際上醫(yī)藥生產帶來革命性影響，生產的OsrHSA可以解決我國人血清白蛋白供應緊張的局面，滿足國家重大戰(zhàn)略需求。