茵陳蒿湯方劑配伍對(duì)黃疸模型小鼠血清生化指標(biāo)的影響

竇志華 陳敏 羅琳 孟萍 顧薇

1.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南通226006；2.南通大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南通226019

茵陳蒿湯方劑配伍對(duì)黃疸模型小鼠血清生化指標(biāo)的影響

竇志華1▲陳敏1▲羅琳2孟萍1顧薇1

1.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南通226006；2.南通大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南通226019

目的研究茵陳蒿湯不同方劑配伍對(duì)黃疸模型小鼠的治療作用。方法將144只ICR小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成正常組、模型組、茵陳蒿湯組、缺茵陳方組、缺梔子方組、缺大黃方組、單味茵陳組、單味梔子組和單味大黃組，每組16只。除正常組外，其余各組于實(shí)驗(yàn)第1、4、7、10天灌胃異硫氰酸-1-萘酯復(fù)制黃疸模型。正常組和模型組灌胃生理鹽水，其余各組每天1次灌胃茵陳蒿湯及其各缺味方和單味藥治療，連續(xù)12 d，第12天給藥后1 h取血，檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）和總膽汁酸（TBA）。結(jié)果與模型組比較，茵陳蒿湯組、單味大黃組、缺梔子方組、缺茵陳方組ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA明顯下降（P＜0.01或P＜0.05），單味梔子組AST、ALP、TBA明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論茵陳蒿湯全方配伍合理，其中大黃在方中發(fā)揮主要作用，梔子單用具有一定肝毒性，大黃與梔子配伍及全方配伍可減毒增效。

茵陳蒿湯；方劑配伍；黃疸；轉(zhuǎn)氨酶；膽紅素；總膽汁酸；堿性磷酸酶

茵陳蒿湯由茵陳18 g、梔子12 g、大黃6 g組成［1］，始載于漢代張仲景所著《傷寒論》，為中醫(yī)臨床治療濕熱黃疸的經(jīng)典名方［2］?，F(xiàn)代研究提示，該方具有抗肝損傷、防治脂肪肝、抗肝纖維化等作用［3］，在肝病治療領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景［4］。方劑配伍規(guī)律是近年來中藥方劑研究的重點(diǎn)課題［5］。方劑配伍藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究是方劑配伍規(guī)律研究的內(nèi)容之一［6］，該方法是從藥效學(xué)方面研究方劑配伍變化與藥效變化的關(guān)系，驗(yàn)證方劑組方的合理性或發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生藥效對(duì)應(yīng)的組分［7］。方劑配伍藥效學(xué)研究通常采用拆方法，拆方形式包括單味藥、撤藥分析等［6］。有鑒于此，本研究復(fù)制了異硫氰酸-1-萘酯（ANIT）小鼠黃疸模型，比較了茵陳蒿湯全方及各撤藥缺味方和單味藥對(duì)模型動(dòng)物血清總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、總膽汁酸（TBA）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）等生化指標(biāo)的影響，以期闡明茵陳蒿湯的配伍機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠，雌雄各半，6周齡，體重（19.1± 3.9）g，購自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2012-0031，合格證號(hào)：0036300。小鼠在南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。溫度保持在19～25℃，相對(duì)濕度為60%～65%，環(huán)境光照保持12 h明12 h暗時(shí)刻表，可以自由進(jìn)食和飲水，小鼠在進(jìn)行正式試驗(yàn)之前進(jìn)行1周左右的適應(yīng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都經(jīng)南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)同意，所有實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守國際試驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與使用準(zhǔn)則。

1.2 藥物與試劑

茵陳（產(chǎn)地江蘇，批號(hào)120701）購自徐州彭祖中藥飲片公司，梔子（產(chǎn)地江西，批號(hào)130520）、大黃（產(chǎn)地甘肅，批號(hào)130703）購自南通三越中藥飲片公司，經(jīng)南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心龔旭東主任中藥師鑒定，茵陳、梔子、大黃的飲片來源分別為菊科植物茵陳蒿Artemisia capillaris Thunb.的干燥地上部分、茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實(shí)和蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.的干燥根和根莖；ANIT（批號(hào)18320LD）購自美國Sigma公司。

1.3 儀器

數(shù)顯智能型恒溫水浴槽（GKC型，上海波絡(luò)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；超聲波清洗器（SK5200H型，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；離心機(jī)（TGL-16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠）；全自動(dòng)生化分析儀（7170型，日本日立公司）。

1.4 灌胃用藥的制備

按質(zhì)量比3∶2∶1稱取茵陳、梔子、大黃，60%乙醇回流3次（乙醇加入量分別為8倍、8倍、6倍，回流時(shí)間分別為1、1、0.5 h），3次乙醇回流液合并，回收乙醇后的溶液作為全方供試藥物；分別稱取茵陳、梔子、大黃，同法制備茵陳、梔子、大黃供試藥物；分別按質(zhì)量比3∶2稱取茵陳和梔子、3∶1稱取茵陳和大黃、2∶1稱取梔子和大黃，同法制備缺大黃方、缺梔子方、缺茵陳方供試藥物。各供試藥物灌胃劑量均相當(dāng)于茵陳蒿湯及單味藥的成人等效劑量。

1.5 動(dòng)物分組及處理

ICR小鼠144只，雌雄各半，雌雄小鼠均使用隨機(jī)數(shù)字表產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字分成9組：正常組、模型組、茵陳蒿湯組、缺茵陳方組、缺梔子方組、缺大黃方組、單味茵陳組、單味梔子組和單味大黃組，每組雌雄各8只。除正常組外，其余各組于實(shí)驗(yàn)第1、4、7、10天按劑量80mg/kg灌胃給予0.8%ANIT（將ANIT溶于植物油中，配成0.8%的ANIT溶液），所有小鼠自由飲水，常規(guī)飼養(yǎng)。除正常組和模型組灌胃生理鹽水外，其余各組每天1次灌胃相應(yīng)劑量供試藥物，連續(xù)12 d，第12天所有動(dòng)物先禁食12 h，末次給藥后1 h頸動(dòng)脈取血，置冰箱4℃靜置6 h后，900 r/min離心10min，自動(dòng)生化分析儀檢測血清中ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Stata 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，行單因素方差分析（ANOVA）和Scheffe檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA均顯著升高（P＜0.01），說明造模成功。與模型組比較，茵陳蒿湯組、缺茵陳方組、缺梔子方組及單味大黃組以上指標(biāo)均明顯下降（P＜0.01或P＜0.05），單味梔子組AST、ALP和TBA反而明顯升高（P＜0.05）。見表1。

3 討論

筆者先期研究結(jié)果顯示，水煎液60%乙醇沉淀后的上清液部分為茵陳蒿湯保肝利膽的藥效部位［8］，提示其藥效物質(zhì)溶解于60%乙醇，故本實(shí)驗(yàn)直接采用60%乙醇提取制備灌胃用藥。

ANIT是復(fù)制動(dòng)物黃疸模型的經(jīng)典造模劑，血清ALT、ALP、TBIL、TBA是黃疸的4項(xiàng)常規(guī)指標(biāo)［8］，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠血清中這4項(xiàng)指標(biāo)均較正常組顯著升高（P＜0.01），說明造模成功。

本研究結(jié)果提示，茵陳蒿湯全方配伍、單味大黃、缺茵陳方、缺梔子方均具有明顯的保肝及促進(jìn)膽紅素和膽汁酸代謝作用，單味茵陳及缺大黃方作用不明顯，提示茵陳蒿湯全方具有合理性，大黃在方中發(fā)揮主要作用，這一結(jié)論與傳統(tǒng)的茵陳為君藥、梔子為臣藥、大黃為佐藥［9］不一致，但卻得到了近年來本課題和其他相關(guān)研究的證實(shí)。近期本課題組分別制備了茵陳蒿湯全方灌胃給藥后不同時(shí)間點(diǎn)含藥血清和拆方配伍后相同時(shí)間點(diǎn)含藥血清，一方面測定了含藥血清指紋圖譜［3］，另一方面將含藥血清作用于H2O2誘導(dǎo)的HL-7702肝細(xì)胞損傷模型進(jìn)行了藥效評(píng)價(jià)，最后通過譜-效關(guān)系分析，指認(rèn)了含藥血清指紋圖譜中與藥效相關(guān)的色譜峰，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1個(gè)來源于大黃的蒽醌類成分體內(nèi)代謝產(chǎn)物活性較強(qiáng)［10］。日本研究人員采用大鼠肝纖維化模型研究發(fā)現(xiàn)，茵陳蒿湯具有明顯的抗肝纖維化作用，大黃是方中唯一發(fā)揮該作用的藥味［11-12］。魏國麗等［13］研究了茵陳蒿湯方劑配伍對(duì)急性胰腺炎小鼠模型的作用，發(fā)現(xiàn)大黃可能起君藥作用。劉瑩等［14］采用正交試驗(yàn)法進(jìn)行了茵陳蒿湯拆方治療非酒精性脂肪性肝炎的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃的作用最為全面。

表1 方劑配伍對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響（x±s，n=16）

本研究結(jié)果同時(shí)提示，梔子單用具有一定的肝毒性，大黃與梔子配伍及全方配伍可減毒增效。梔子的肝毒性可能與梔子所含的梔子苷等環(huán)烯醚萜類成分具有低劑量保肝高劑量則產(chǎn)生肝毒性的雙重作用有關(guān)［15-18］。肖小華等［19］研究了不同劑量的梔子苷和西紅花苷Ⅰ對(duì)ANIT誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，西紅花苷Ⅰ低劑量具有保護(hù)作用，高劑量西紅花苷Ⅰ及低劑量梔子苷均沒有保護(hù)作用，高劑量梔子苷反而具有肝毒性，筆者推測以上結(jié)果與劑量設(shè)計(jì)有關(guān)，梔子苷低劑量沒有保肝作用是因?yàn)楸Ｗo(hù)和毒性作用抵消，西紅花苷Ⅰ高劑量也具有肝毒性，之所以沒有顯示出來，也是因?yàn)楸Ｗo(hù)和毒性作用抵消。本課題組對(duì)茵陳蒿湯不同時(shí)間點(diǎn)含藥血清的譜效關(guān)系研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，西紅花苷Ⅰ等西紅花酸類成分及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物可能具有肝細(xì)胞保護(hù)和毒性雙重作用（論文另發(fā)）。大黃與梔子配伍及全方配伍可降低梔子苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的提取率［20］，可能與這兩種配伍的減毒增效有關(guān)。

［1］賈波，李冀.方劑學(xué)［M］.2版.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2012：209.

［2］許波，竇志華，羅琳，等.茵陳蒿湯血清藥化學(xué)研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，39（2）：162-168.

［3］竇志華，許波，劉青青，等.茵陳蒿湯含藥血清指紋圖譜研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2016，51（5）：6-12.

［4］Yokoyama Y，Nagino M.Current scenario for the hepatoprotectiveeffectsof Inchinkoto，a traditionalherbalmedicine，and its clinical application in liver surgery：a review［J］. Hepatol Res，2014，44（4）：384-394.

［5］張靜宇，年莉，尹進(jìn).方劑配伍實(shí)驗(yàn)研究方法概述［J］.中醫(yī)雜志，2015，56（6）：526-530.

［6］徐硯通.方劑配伍的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵探討［J］.中草藥，2015，46（4）：465-469.

［7］楊愛華.茵陳蒿湯藥效部位篩選及配伍機(jī)理初步研究［D］.南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

［8］竇志華，羅琳，候金燕，等.茵陳蒿湯保肝退黃藥效部位篩選［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2014，25（10）：2371-2373.

［9］徐維佳，范應(yīng)，陳少東，等.均勻設(shè)計(jì)法篩選茵陳蒿湯抗脂肪肝脂質(zhì)代謝異常的效應(yīng)組分［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31（4）：274-277.

［10］候金燕.茵陳蒿湯保肝作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究［D］.南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

［11］Imanishi Y，Maeda N，Otogawa K，et al.Herb medicine Inchin-ko-to（TJ-135）regulates PDGF-BB-dependent signaling pathways of hepatic stellate cells in primary culture and attenuates development of liver fibrosis induced by thioacetamide administration in rats［J］.JHepatol，2004，41（2）：242-250.

［12］Imanishi Y，Maeda N，Matsui H，et al.Suppression of rat stellate cell activation and liver fibrosis by a Japanese herbalmedicine，inchinko-to（TJ135）［J］.Comp Hepatol，2004，3（Suppl 1）：S11.

［13］魏國麗，鄭學(xué)寶，劉強(qiáng)，等.茵陳蒿湯方劑配伍對(duì)急性胰腺炎小鼠模型作用的研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29（7）：1670-1672.

［14］劉瑩，陳曉偉，李健，等.茵陳蒿湯拆方對(duì)非酒精性脂肪性肝炎的正交實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2013，21（4）：182-188.

［15］張海燕，鄔偉魁，李芳，等.梔子保肝利膽作用及其肝毒性研究［J］.中國中藥雜志，2011，36（19）：2610-2164.

［16］Ding Y，Zhang T，Tao JS，et al.Potential hepatotoxicity of geniposide，the major iridoid glycoside in dried ripe fruits of Gardenia jasminoides（Zhi-zi）［J］.Nat Prod Res，2013，27（10）：929-933.

［17］程生輝，唐超，李會(huì)芳，等.梔子苷對(duì)正常大鼠急性肝、腎毒性的時(shí)-毒關(guān)系分析［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（1）：162-165.

［18］程生輝，張妍妍，李會(huì)芳，等.基于黃疸模型大鼠的梔子苷急性肝腎毒性研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（4）：174-174.

［19］肖小華，徐麗瑛，周艷艷，等.梔子苷和西紅花苷Ⅰ對(duì)ANIT致小鼠肝損傷的保肝作用研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2014，25（7）：1600-1601.

［20］竇志華，羅琳，姜曉燕，等.方劑配伍對(duì)茵陳蒿湯中15種成分提取率的影響［J］.中草藥，2015，46（12）：1753-1758.

Effects of prescription com patibility of Yinchenhao Decoction on the serum biochem ical parameters of jaundice in m ice

DOU Zhihua1▲CHENMin1▲LUO Lin2MENG Ping1GUWei1
1.Department of Pharmacy，Nantong Third Affiliated Hospital of Nantong University，Jiangsu Province，Nantong 226006，China；2.College of Pharmacy，Nantong University，Jiangsu Province，Nantong 226019，China

Ob jective To study the therapeutic effect of different prescription compatibility of Yinchenhao Decoction on jaundice in mice.M ethods One hundred and forty four ICR mice were randomly divided into normal group，model group，Yinchenhao Decoction group，Yinchenhao Decoction without Herba Artemisiae Scopariae group，Yinchenhao Decoction without Fructus Gardeniae group，Yinchenhao Decoction without Radix et Rhizoma Rhei group，Herba Artemisiae Scopariae group，F(xiàn)ructus Gardeniae group and Radix et Rhizoma Rhei group by random number table，with 16 mice in each group.The jaundicemice were induced by gavage of alpha-naphthylisothiocyanate at 1，4，7，10 d，except the mice in normal group.The normal group and model group were given normal saline by gavage，the other groupswere given Yinchenhao Decoction and its lacking one herb of component and single herb by intragastric administration for 12 days.The serum was collected at 1 h after the last administration.The levels of alanine transaminase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），alkaline phosphatase（ALP），total bilirubin（TBIL），direct bilirubin（DBIL）and totalbileacids（TBA）were detected.Results Compared withmodelgroup，the levelsof ALT，AST，ALP，TBIL，DBIL，TBA in the Yinchenhao Decoction group，Radix etRhizoma Rhei group，Yinchenhao Decoction without Fructus Gardeniae group，Yinchenhao Decoction without Herba Artemisiae Scopariae group were all significantly decreased（P＜0.01 or P＜0.05），while the levels of AST，ALP，TBA in the Fructus Gardeniae group were significantly increased（P＜0.05）. Conclusion The concerted application of Yinchenhao Decoction is reasonable prescription，among which，Radix et Rhizoma Rhei plays themain effect，single application of Radix et Rhizoma Rhei can induce some hepatotoxicity，while concerted application of Radix et Rhizoma Rhei and Fructus Gardeniae or Yinchenhao Decoction can reduce toxicity and enhance effect.

Yinchenhao Decoction；Prescription compatibility；Jaundice；Aminotransferase；Bilirubin；Total bile acids；Alkaline phosphatase

R285.5

A

1673-7210（2016）05（a）-0093-04

2016-01-02本文編輯：張瑜杰）

江蘇省中醫(yī)藥局科研項(xiàng)目（HZ07071）；江蘇省省屬高校自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（08KJB360009）。

竇志華（1966-），男，博士，主任中藥師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究。

羅琳（1976-），女，博士，副教授，主要從事藥理學(xué)研究。

▲共同第一作者