刺五加根的抗炎活性成分研究

張羨媛 李賀然

蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇蘇州215123

刺五加根的抗炎活性成分研究

張羨媛 李賀然

蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇蘇州215123

目的研究刺五加根的抗炎活性成分。方法脂多糖（LPS）和干擾素（IFN-γ）誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞RAW264.7作為細(xì)胞炎癥模型，考察了刺五加根提取物對一氧化氮（NO）釋放抑制活性，利用HPD100大孔吸附樹脂、硅膠柱層析、反相色譜柱（ODS）、凝膠色譜、半制備高效液相等色譜技術(shù)對其進行化學(xué)成分分離，并運用薄層色譜法，紅外光譜、核磁等波譜技術(shù)確定化合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果刺五加根提取物具有抑制NO釋放活性，從中分離得到7個化合物，分別鑒定為紫丁香苷、刺五加苷B1、刺五加苷E、芝麻素、胡蘿卜苷、β-谷甾醇和香草酸。結(jié)論刺五加根提取物具有抗炎活性，其中的苯丙素類成分為其抗炎活性成分。

刺五加根；化學(xué)成分；抗炎活性；一氧化氮

刺五加Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms為五加科五加屬植物，別名五加皮、刺拐棒；刺五加含有酚苷類、黃酮類、脂肪酸類、多糖類及各種微量元素、氨基酸等化學(xué)成分；具有兔疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗損傷及抗疲勞作用，可治療心腦血管疾病、糖尿病、神經(jīng)衰弱、高脂血癥、低血癥等疾?。?-7］。本研究以脂多糖（LPS）和干擾素（IFN-γ）誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7作為細(xì)胞炎癥模型，考察了刺五加根提取物對一氧化氮（NO）釋放抑制活性，并從中分離得到7個化合物，經(jīng)TLC與波譜解析鑒定為紫丁香苷、刺五加苷B1、刺五加苷E、芝麻素、胡蘿卜苷、β-谷甾醇和香草酸。

1 儀器與試藥

VARIAN 600 MR超導(dǎo)核磁共振波譜儀（TMS為內(nèi)標(biāo)，美國VARIAN公司），熔點儀（北京科儀電光儀器廠），酶聯(lián)兔疫檢測儀（Model 3550 Microplate Reader，BIO-RAD）。凝膠Sephadex LH-20（美國GE公司），HPD100大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司），ODS（50～70μm），實驗所用試劑規(guī)格均為分析純。RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（ATCC TIB-71）購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫，脂多糖（美國Sigma公司）、干擾素-γ（美國Genzyme/Techne公司）。刺五加根購自貴州益佰制藥股份有限公司，由蘇州大學(xué)劉春宇教授鑒定為五加科植物刺五加A. senticosus Harms的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 NO釋放抑制活性測定

RAW 264.7細(xì)胞濃度8×104個/mL，每孔100μL接種于96孔培養(yǎng)板，設(shè)立空白對照組、模型對照組、陽性對照組（100、30μg/mL）及給藥組（100、30、10、3μg/mL），每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，在5%CO2和37℃下培養(yǎng)24 h，加入LPS（終濃度為100 ng/mL），IFN-γ（終濃度為0.33 ng/mL），樣品DMSO溶液（溶解樣品的DMSO相對于培養(yǎng)基的含量＜0.5%），培養(yǎng)24 h［8］。取上清液100μL，分別加入50μL Griess試劑A［1%的磺胺磷酸溶液（5%）］和Griess試劑B（0.1%的萘基乙烯基二胺），遮光反應(yīng)10min，用酶聯(lián)兔疫檢測儀在570 nm下測定吸光度，計算NO生成抑制率。

2.2 提取分離

稱取刺五加根1000 g，8000mL 60%乙醇回流提取2 h，重復(fù)3次，合并提取液，濃縮至浸膏。將浸膏水溶解，濾紙過濾，濾液經(jīng)HPD100大孔吸附樹脂，依次以蒸餾水、20%乙醇、30%乙醇、75%乙醇洗脫。20%乙醇洗脫部位經(jīng)硅膠柱層析；30%乙醇部分經(jīng)硅膠柱層析、ODS柱層析、凝膠柱層析；75%乙醇部分經(jīng)硅膠柱層析、ODS柱層析；最終分離得到7個化合物，化合物1（799 mg）、化合物2（8 mg）、化合物3（41 mg）、化合物4（13mg）、化合物5（9 mg）、化合物6（10 mg）和化合物7（61mg）。

2.3 刺五加提取物對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響

刺五加根60%乙醇提取物對LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7產(chǎn)生NO的抑制作用呈劑量依賴關(guān)系，濃度為100μg/mL，抑制率達到（59.96± 4.57）%，濃度為30μg/mL，抑制率為（20.02±4.22）%，濃度為10μg/mL，抑制率為（8.81±5.29）%，濃度為3μg/mL，（6.36±3.52）%，n=3。陽性對照組濃度為100μg/mL，抑制率達到（94.73±2.05）%，濃度為30μg/mL，抑制率為（62.70±5.08）%，n=3。刺五加根60%乙醇提取物在濃度為100μg/mL時，與30μg/mL濃度的陽性對照組對NO產(chǎn)生的抑制能力相當(dāng)。

2.4 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

將化合物1～7的波譜數(shù)據(jù)進行綜合分析，并與參考文獻、對照品比對，最終確定結(jié)構(gòu)見圖1?；衔?～7的性狀與主要波譜數(shù)據(jù)歸屬如下：

化合物1：白色針晶（甲醇），mp 190.0～192.0℃。三氯化鐵-鐵氰化鉀顯色反應(yīng)呈陽性，Molish反應(yīng)呈陽性。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6），δ：6.69（1H，d，J=2.0 Hz，H-3），6.69（1H，d，J=2.0 Hz，H-5），6.44（1H，d，J=15.8 Hz，H-7），6.41（1H，d，J=15.8 Hz，H-8），4.07（2H，m，H-9），4.81（1H，d，J=7.9 Hz，glc-H-1'），3.17～3.55（6H，m），δ3.73（6H，s，2×OCH3）。13C-NMR（125MHz，DMSO-d6），δ：134.4（C-1），153.25（C-2，6），105.0（C-3，5），133.1（C-4），129.0（C-7），130.7（C-8），61.4（C-9），103.1（C-1'），74.7（C-2'），77.8（C-3'），70.5（C-4'），77.1（C-5'），62.0（C-6'），56.9（2×OCH3）。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻［9］報道的紫丁香苷數(shù)據(jù)一致，與紫丁香苷對照品薄層比較，二者的薄層層析行為一致，且與對照品混合熔點不下降，鑒定化合物1為紫丁香苷。

化合物2：無色針晶（甲醇），mp 204.0～205.0℃。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6），δ：7.96（1H，d，J=9.5 Hz，H-4），7.13（1H，s，H-5），6.40（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），5.16（1H，d，J=7.0 Hz，glc-H-1'），3.82（3H，s，OCH3），3.91（3H，s，OCH3）。13C-NMR（125MHz，DMSO-d6），δ：159.8（C-2），114.7（C-3），144.4（C-4），105.5（C-5），149.4（C-6），141.6（C-7），140.2（C-8），142.4（C-9），114.5（C-10），102.1（C-1'），74.1（C-2'），77.5（C-3'），69.8（C-4'），76.5（C-5'），61.2（C-6'），56.5（OCH3），60.8（OCH3）。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻［10］報道的刺五加苷B1數(shù)據(jù)一致，鑒定化合物2為刺五加苷B1。

化合物3：白色粉末（甲醇），10%H2SO4試劑呈現(xiàn)藍(lán)色，Molish反應(yīng)呈陽性。1H-NMR（600MHz，DMSO-d6），δ：6.62（4H，s，H-2'，6'，2''，6''），4.86（2H，d，J= 5.4 Hz，glu-1，glu-1'），4.60（2H，d，J=4.0 Hz，H-7，7'），3.11（2H，m，H-8，8'），3.80，4.13（H-9，9'），3.81～4.16（12H，m），3.73（12H，s，4×OCH3）。13C-NMR（125MHz，DMSO-d6），δ：53.6（C-1，5），85.1（C-2，6），71.3（C-4，8），133.7（C-1'，1''），104.2（C-2'，6'，2''，6''），152.6（C-3'，5'，3''，5''），137.1（C-4'，4''），102.7（glc-1'，1''），74.2（glc-2'，2''），76.5（glc-3'，3''），69.9（glc-4'，4''），77.2（glc-5'，5''），60.9（glc-6'，6''），56.4（4×OCH3）。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻［11］報道的刺五加苷E數(shù)據(jù)一致，與刺五加苷E對照品薄層比較，二者的薄層層析行為一致，且與對照品混合熔點不下降，鑒定化合物3為刺五加苷E。

化合物4：白色粉末（甲醇），Molish反應(yīng)呈陽性。IR（KBr）：3420，2937，2870，1465，1380，1105，1060 cm-1。與胡蘿卜苷對照品薄層比較，二者的薄層層析行為一致，且與對照品混合熔點不下降，鑒定化合物4為胡蘿卜苷。

化合物5：白色粉末。將其與β-谷甾醇對照品對照品薄層比較，二者的薄層層析行為一致，且與對照品混合熔點不下降，鑒定化合物5為β-谷甾醇。

化合物6：白色粉末。1H-NMR（600MHz，DMSO-d6），δ：3.00（2H，m，H-8，8'），3.75（2H，dd，J=9.2，3.3 Hz，H-9a，9'a），4.11（2H，dd，J=8.8，6.6 Hz，H-9e，9e'），4.63（2H，d，J=4.0 Hz，H-7，7'），5.99（4H，s，2×OCH2O），6.92（2H，s，H-2，2'），6.83（2H，d，J=8.1 Hz，H-6，6'），6.87（2H，d，J=7.7 Hz，H-5，5'）。13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6），δ：147.4（C-4，4'），146.5（C-3，3'），135.5（C-1，1'），119.4（C-6，6'），108.0（C-5，5'），106.6（C-2，2'），84.9（C-7，7'），71.0（C-9，9'），53.7（C-8，8'），100.9（2×OCH2O）。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻［12］報道的芝麻素數(shù)據(jù)一致，鑒定化合物6為芝麻素。

化合物7：白色晶體（甲醇），mp 63.0～64℃。1HNMR（600MHz，DMSO-d6），δ：6.82（1H，d，J=8.1 Hz，H-5），7.42（1H，m，H-2，6），3.78（3H，s，OCH3），δ9.86（1H，s，OH）。13C-NMR（125MHz，DMSO-d6），δ：167.2（-COOH），151.0（C-4），147.1（C-3），123.4（C-6），121.5（C-1），114.9（C-2），112.6（C-5），55.5（OCH3）。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻［13］報道的香草酸數(shù)據(jù)一致，鑒定化合物7為香草酸。

圖1 化合物1～7結(jié)構(gòu)

3 討論

NO是從血管內(nèi)皮發(fā)現(xiàn)的小分子，一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸產(chǎn)生的5個電子的氧化物；NO既兼有第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)的功能，又是效應(yīng)分子，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)多種生理和病理過程；急慢性炎癥的發(fā)生均與NO有關(guān)系，抑制NO的生成被認(rèn)定為治療炎癥疾病比較有前景的方法［14］。文獻報道，刺五加水提物具有抗炎作用，可能通過抑制活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)發(fā)揮其抗炎功效［15］。巨噬細(xì)胞中含有誘導(dǎo)型NOS，在LPS、IFN-γ等刺激下誘導(dǎo)表達可以催化精氨酸產(chǎn)生NO。因此，采用LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞RAW264.7作為細(xì)胞炎癥模型，考察刺五加醇提物對單核巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生NO的影響。實驗結(jié)果表明，刺五加根的醇提物對LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7產(chǎn)生NO具有抑制作用，從中分離得到紫丁香苷、刺五加苷B1、刺五加苷E、芝麻素等苯丙素類成分。文獻報道，芝麻素等苯丙素類成分具有抑制NO生成和抗炎的作用，此類化合物在抗感染、抗心血管疾病等方面具有顯著的活性［16］，與刺五加的功效、臨床應(yīng)用［1-7］比較一致。因此，此類化合物可能是刺五加的抗炎藥效成分之一，對此類化合物的深入研究將有助于人類更深入地理解刺五加的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

中藥抗炎藥理研究已從“整體-器官-細(xì)胞”水平發(fā)展到在分子、細(xì)胞水平探討中藥的作用機制；中藥有多種抗炎作用機制，如對下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸（HPAA）的影響，導(dǎo)致內(nèi)源性皮質(zhì)醇分泌增多而發(fā)揮抗炎效應(yīng)［17］；干擾花生四烯酸代謝，苦參堿對磷脂酶A2（PLA2）活性的抑制是其抗炎機制之一［18］；對細(xì)胞因子的影響，銀杏葉提取物通過下調(diào)IL-13的表達，從而使氣道炎細(xì)胞浸潤減少，減輕氣道炎癥［19］；對核因子的影響，氧化苦參堿可抑制NF-κB活化，降低TNF-α和IL-6的生成，從而減輕葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎炎性損傷［20］；抗組胺、5-羥色胺、NO等炎癥介質(zhì)的作用，銀杏葉總黃酮能明顯降低大鼠足爪局部炎癥組織中NO的含量，提示其抗炎機制與抑制NO生成有關(guān)［21］。本次實驗中，刺五加提取物能抑制LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7的NO產(chǎn)生，這可能是刺五加抗炎作用機制之一；刺五加含有多種化學(xué)成分，不同成分的藥理作用及作用靶點不同，下一步，可以從炎癥動物模型驗證刺五加的抗炎作用，從細(xì)胞因子、核因子等方面多角度探索刺五加的抗炎作用機制。

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Anti-inflammatory constituents of Acanthopanax senticosus

ZHANG Xianyuan LIHeran
Department of Pharmacy，Soochow University，Jiangsu Province，Suzhou 215123，China

Objective To study the anti-inflammatory constituents of Acanthopanax senticosus.Methods NO production in the activated RAW 264.7macrophages induced by LPS and IFN-γwere used to evaluate anti-inflammatory activity.The compounds were isolated by HPD 100 resin，silica gel，ODSand HPLCmethods，their structureswere identified by Infrared TLCmethod and spectral imaging spectrum technology.Resu lts The extraction of A.senticosus.had inhibitory activity on NO production.Seven compoundswere isolated and identified as Syringin，Isofraxidin-7-O-glucoside，Syringaresinoldi-O-β-D-glycoside，Sesamin，Daucosterol，β-sitosterol and Vanillic acid respectively.Conclusion The extraction of A.senticosus.has the anti-inflammatory effect，and phenylpropanoids are the anti-inflammatory constituents.

Acanthopanax senticosus；Constituents；Anti-inflammatory activity；Nitric oxide

R961.1

A

1673-7210（2016）05（a）-0020-04

2016-01-21本文編輯：趙魯楓）

蘇州大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃項目（573151 1710）。

張羨媛（1990.3-），女，碩士，主要從事天然產(chǎn)物活性成分研究。

李賀然（1976.11-），男，副教授，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)成分及活性研究。