芍藥湯對胃腸濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠Th17相關(guān)細(xì)胞因子的影響

羅敏 吳強(qiáng) 朱蓉 李帥軍 胡響當(dāng) 王曉艷 楊宗亮

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肛腸科，湖南長沙410005；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410007

芍藥湯對胃腸濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠Th17相關(guān)細(xì)胞因子的影響

羅敏1吳強(qiáng)2朱蓉2李帥軍1胡響當(dāng)1王曉艷1楊宗亮1

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肛腸科，湖南長沙410005；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410007

目的研究芍藥湯對胃腸濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠Th17相關(guān)因子的影響，探討芍藥湯治療胃腸濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制。方法將40只清潔級大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、芍藥湯組及柳氮磺吡啶（SASP）組；除空白組外，其他三組大鼠制成胃腸濕熱型模型后，再用三硝基苯磺酸（TNBS）造模成潰瘍性結(jié)腸炎模型；灌胃治療14 d后，處死大鼠前對其進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評分，完畢后麻醉大鼠，腔靜脈取血，采用酶聯(lián)兔疫吸附測定（ELISA）檢測血清中細(xì)胞因子白細(xì)胞介素17（IL-17）、γ干擾素（IFN-γ）及白細(xì)胞介素27（IL-27），并取病變結(jié)腸進(jìn)行結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)（CMDI）評分。結(jié)果DAI評分及CMDI評分方面，與空白組比較，模型組明顯升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），治療后芍藥湯組評分低于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；血清IL-17方面，模型組明顯高于空白組，芍藥湯組明顯低于模型組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；大鼠血清IFN-γ及IL-27方面，模型組明顯低于空白組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），芍藥湯組高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論芍藥湯能明顯降低胃腸濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清中IL-17水平，并可相應(yīng)升高其血清中IFN-γ及IL-27水平，其可能為治療潰瘍性結(jié)腸炎的有效機(jī)制之一。

芍藥湯；潰瘍性結(jié)腸炎；胃腸濕熱；Th17相關(guān)細(xì)胞因子

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種主要累及結(jié)腸、直腸黏膜和黏膜下層的慢性非特異性炎癥，屬病因不明的炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）范疇［1］。UC發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，其可能與環(huán)境、飲食、感染、遺傳及兔疫等因素有關(guān)，其中，兔疫因素在UC發(fā)病中作用已經(jīng)被廣泛接受［2］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Th17相關(guān)因子［主要指白細(xì)胞介素17（IL-17）、γ干擾素（IFN-γ）及白細(xì)胞介素27（IL-27）］在UC的發(fā)病及愈合中有著重要作用［3-4］。目前西醫(yī)治療UC常用兔疫抑制劑、激素和抗生素；中醫(yī)中藥對于UC也有較好效果，雖然治療作用有雙向性且毒副作用發(fā)生率低，但其機(jī)制不清，芍藥湯是中醫(yī)臨床治療胃腸濕熱型UC的常用方劑，臨床收效可觀。本研究通過觀察芍藥湯對胃腸濕熱型UC大鼠血清IL-17、IFN-γ及IL-27的影響，試從細(xì)胞層面探討芍藥湯對UC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級SD大鼠40只，雌雄各半，體重180～200 g，均購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SYXK（湘）2013-0005］。實(shí)驗(yàn)前，所有大鼠均在通風(fēng)、溫度、濕度適宜的動(dòng)物室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 器材3K-30Z型高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）；大鼠IL-17酶聯(lián)兔疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；大鼠IL-27 ELISA檢測試劑盒［杭州豪普斯生物有限公司，試劑盒貨號（CK-E30296R）］；大鼠IFN-γELISA檢測試劑盒（杭州豪普斯生物有限公司）。

1.1.3 主要試劑水合氯醛（天津市巴斯夫化工有限公司，每瓶100 g，批號Q/12HB 4218-2013），蒸餾水制作成濃度為10%的水溶液；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（美國Sigma公司）；柳氮磺胺吡啶（SASP）（上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司，批號H31020557，每片含0.25 g）；芍藥湯由芍藥、大黃、黃連、木香、黃芩、檳榔、肉桂、當(dāng)歸、甘草9味藥物組成，所用藥物均為超微顆粒，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供，并由醫(yī)院制劑科用蒸餾水制成水劑，每1 mL含生藥1.2 g。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及造模方法按照完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方法，分別從20只雄性大鼠及20只雌性大鼠中隨機(jī)抓取分為4組，每組10只，雌雄各半。除空白組外，其他三組大鼠均按照文獻(xiàn)［5-6］復(fù)制胃腸濕熱模型，將大鼠在普通飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上飼以高脂高糖飲食，即加用200 g/L蜂蜜水給大鼠自由飲用，隔日按照大鼠體重?cái)?shù)量給予10 g/kg的油脂灌服，并油脂隔日按照10mL/kg灌服白酒，總共10 d，然后放入溫度為（32±2）℃、相對濕度為95%的人工氣候箱中，共5 d。在已復(fù)制的胃腸濕熱型模型基礎(chǔ)上，采用三硝基苯磺酸（TNBS）灌腸法制作UC大鼠模型。造模前禁食24 h，然后取SD大鼠，根據(jù)大鼠體重，予水合氯醛按照0.4 m L/100 g行腹腔麻醉，麻醉成功后，用大鼠灌胃針頭輕輕從肛門插入，切忌用力過猛，避兔損傷大鼠腸道黏膜，插入深度為8 cm，然后按照4 mL/kg推入TNBS溶液（含25mL/L TNBS和500mL/L 50%乙醇），捏緊大鼠肛門平放5min即可，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。造模4 d后，從四組各隨機(jī)抽取1只處死并解剖，游離結(jié)腸組織，沿腸系膜方向剪開，生理鹽水充分沖洗干凈，平鋪長腸管組織于試驗(yàn)臺進(jìn)行觀察，觀察距離肛緣6～10 cm出見肉眼可見潰瘍面，病理檢查發(fā)現(xiàn)炎性改變及典型潰瘍面時(shí)，即造模成功。

1.2.2 給藥方法于造模成功后第2天開始，芍藥湯組大鼠芍藥湯劑按照含生藥量9.2 g/（kg·d）灌胃，SASP組大鼠按照0.3 g/（kg·d）灌胃，空白組及模型組予等體積的生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)2周。

1.3 標(biāo)本選取

給藥14 d后，每組大鼠均禁食24 h，各大鼠分別予水合氯醛按照0.4 mL/100 g行腹腔麻醉，麻醉成功后，腔靜脈取血4 mL，高速離心，取上層血清，ELISA法測定血清中細(xì)胞因子IL-17、IFN-γ及IL-27水平。

1.4 觀察指標(biāo)

①分別于造模成功后給藥前及末次麻醉前觀察各組大鼠大便、體重、活動(dòng)度及精神狀態(tài)，進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評分，DAI=（體重下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù)）/3，其參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行，積分為0～4分，0分：大便性狀正常，無隱血，體重?zé)o下降；1分：大便性狀正常，大便無隱血，體重下降＜5%；2分：大便松散，大便隱血陽性，體重下降5%～＜10%；3分：大便松散，大便隱血陽性，體重下降10%～＜15%；4分：稀便，肉眼血便，體質(zhì)量下降≥15%。②ELISA法測定血清中細(xì)胞因子IL-17、IFN-γ及IL-27水平。③解剖大鼠，取病變結(jié)腸進(jìn)行結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)（CMDI）評分，其參照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行。0分：無損傷；1分：輕度充血但沒有糜爛及潰瘍；2分：充血而且腸壁變厚但沒有潰瘍；3分：有1處小潰瘍，直徑0～1 cm；4分：潰瘍較大，直徑1～2 cm，但腸管與外周臟器無粘連；5分：潰瘍直徑1～2 cm，腸管增厚，與周圍臟器粘連嚴(yán)重。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）計(jì)算，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果

造模后各組隨機(jī)取1只大鼠處死并對其腸道進(jìn)行觀察，除空白組外，其他三組均有肉眼可見的潰瘍面；至療程結(jié)束前各組大鼠均存活。

2.2 各組大鼠DAI、CM DI評分比較

模型組DAI評分及CMDI評分明顯高于空白組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），芍藥湯組治療后DAI評分及CMDI評分低于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠DAI、CMDI評分比較（分，x±s）

2.3 各組大鼠血清中細(xì)胞因子IL-17、IFN-γ及IL-27水平比較

與空白組比較，模型組IL-17顯著升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而IFN-γ及IL-27明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，芍藥湯組IL-17明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而IFN-γ及IL-27明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清中細(xì)胞因子IL-17、IFN-γ及IL-27水平比較（pg/m L，x±s）

3 討論

本研究通過在胃腸濕熱模型建立基礎(chǔ)上，用TNBS制作大鼠UC模型，大鼠出現(xiàn)腹瀉及膿血便等癥狀，且對結(jié)腸組織進(jìn)行大體觀察時(shí)，見明顯充血、水腫、糜爛及潰瘍等炎癥性腸病的病理變化。UC的發(fā)生機(jī)制中，兔疫反應(yīng)異常當(dāng)今被普遍接受并日漸受重視［9-10］。目前相關(guān)研究提示，Th1、Th2細(xì)胞在炎癥性腸?。↖BD）的發(fā)生中起重要作用［11］。Th17細(xì)胞是近來發(fā)現(xiàn)的一種不同于Th1、Th2細(xì)胞的新的輔助性T細(xì)胞亞群，因其能夠特異性分泌IL-17而命名，Th17尚能分泌IL-6、IL-21、IL-22、腫瘤壞死因子（TNF-α）等多種細(xì)胞因子［11］，其在炎癥性腸病的發(fā)病及愈合中起著重要作用［13］。IL-17通過誘導(dǎo)與炎癥相關(guān)的多個(gè)基因的表達(dá)（包括粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子、IL-6、細(xì)胞間黏附分子1等），增強(qiáng)IL-1及TNF-α誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，還可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，建立適應(yīng)性與先天性兔疫的聯(lián)系［14-15］，在各種組織的炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，對于UC的炎癥發(fā)生起促進(jìn)作用。目前IL-27與IFN-γ對于IBD的影響尚存爭議，有研究認(rèn)為其具有促炎作用［16-18］，而有研究認(rèn)為其具有抗炎作用［19］。

UC屬于中醫(yī)學(xué)“休息痢”“大瘕瀉”等范疇。東漢時(shí)期張仲景認(rèn)為其“下利復(fù)發(fā)”是“病不盡故也”。隋代巢元方《諸病源候論·卷十七·痢病諸候》認(rèn)為，休息痢的形成是由于腸胃虛弱，胃管有停飲，冷熱氣乘之而成。大瘕瀉病名首見于《難經(jīng)·五十七難》：“大瘕瀉者，里急后重，數(shù)至圊而不能便，莖中痛?！敝嗅t(yī)對本病的病因病機(jī)論述較為詳盡?！秲?nèi)經(jīng)》對其病因的論述，或言風(fēng)，或言濕，或言寒，或言熱，或言清氣在下?！吨T病源候論》認(rèn)為病因與外感時(shí)邪、內(nèi)傷飲食、情志失調(diào)等有關(guān)。如《靈樞·師傳》指出：“腸中寒，則腸鳴饗泄?！薄端貑枴り庩枒?yīng)象大論》；：“清氣在下，則生饗泄?！薄端貑枴ぬ庩柮髌罚骸笆筹嫴还?jié)，起居不時(shí)，則陰受之。陰受之則人五臟，人五臟則脫滿閉塞，下為飧泄，久為腸澼?！睆堉倬罢J(rèn)為該病與熱邪有關(guān)，其復(fù)發(fā)是因“病不盡故”及“胃中冷，水別不故也”。以上論述表明，該病病因病機(jī)是：外感時(shí)邪、起居失常、內(nèi)傷飲食，或情志失調(diào)，而致濕濁邪熱郁蒸，胃腸被傷，腑氣壅阻，氣血凝滯導(dǎo)致發(fā)病。針對這一病機(jī)，清熱燥濕、調(diào)和氣血為目前中醫(yī)治療UC的主要治療大法。

筆者在臨床中使用芍藥湯治療胃腸濕熱型UC收效甚佳。該方出《素問·病機(jī)氣宜保命集》，功擅清熱燥濕、調(diào)和氣血。方中芍藥雖非君藥，但其用量大，且在本方中養(yǎng)血斂陰，緩急止痛，柔肝瀉火，《本草綱目》云其“止下痢腹痛”，相關(guān)文獻(xiàn)［20-21］有述，芍藥有緩解平滑肌痙攣及調(diào)節(jié)兔疫之功效，此即為以其名方之緣由。方中以黃芩、黃連為君，因其清熱瀉火，解毒燥濕除病因；當(dāng)歸助芍藥行血調(diào)血，木香、檳榔行氣導(dǎo)滯，有云“行血?jiǎng)t便膿自愈，調(diào)氣則后重自除”，四藥為臣調(diào)和氣血；大黃瀉熱通便，通因通用，肉桂以防苦寒傷中，二藥為佐；甘草益胃和中，調(diào)和諸藥為使；諸藥合參，使熱得清、濕得化、氣血條暢而不亂、腸積得下而不滯，諸癥由此得解。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，芍藥湯對大鼠血清中Th17相關(guān)細(xì)胞因子的影響明顯，可以明顯降低胃腸濕熱型UC大鼠血清中IL-17水平，并且升高其血清中IFN-γ及IL-27的濃度，對胃腸濕熱型UC大鼠癥狀體征的改善作用顯著，因此本研究認(rèn)為芍藥湯治療胃腸濕熱型UC可能是通過降低血清IL-17的水平及相應(yīng)提高IL-27與IFN-γ的濃度來實(shí)現(xiàn)的。

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Effect of Shaoyao Decoction on Th17 related cytokines of rats with ulcerative colitis of syndrome of dam p-heat in stomach and intestine

LUO Min1WU Qiang2ZHU Rong2LIShuaijun1HU Xiangdang1WANG Xiaoyan1YANG Zongliang1
1.Departmentof Proctology，the Second Affiliated Hospital of Hu'nan University of Chinese Medicine，Hu'nan Province，Changsha 410005，China；2.Hu'nan University of Chinese Medicine，Hu'nan Province，Changsha 410007，China

Objective To study the effect of Shaoyao Decoction on Th17 related cytokines of ratswith ulcerative colitis of syndrome of damp-heat in stomach and intestine，so as to investigate the mechanism of Shaoyao Decoction in the treatment of ulcerative colitis.M ethods Forty rats were random ly divided into blank group，model group，Shaoyao Decoction group，Salazosulfapyridine（SASP）group.Except for the blank group，the rats of the other three groups were built asmodels of syndrome of damp-heat in stomach and intestine，then they weremade into ulcerative colitismodels by trinitro-benzene-sulfonic acid（TNBS）.After 14 days'lavage treatment，all rats were firstly given amark on disease activity index（DAI）before death，then they were narcotized to drew blood from venae cavae formeasuring the interleukins-17（IL-17），γ-interferon（IFN-γ）and interleukins-27（IL-27）in serum by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），finally，the abnormal tissues were chosen to make scores of colon macroscopic damage index（CMDI）. Results On DAIand CMDIscores，compared with the blank group，themodel group was increased，the differenceswere highly statistically significant（P＜0.01），after treatment，the Shaoyao Decoction group was lower than themodel group，the differenceswere highly statistically significant（P＜0.01）；On the levels of IL-17，themodel group was higher than the blank group，while the Shaoyao Decoction group was lower than the model group，the differences were all highly statistically significant（P＜0.01）；On the levels of IFN-γand IL-27，themodel group was lower than the blank group，the differences were highly statistically significant（P＜0.01），while the Shaoyao Decoction group was higher than the model group，the differenceswere statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Shaoyao Decoction can obviously reduce the levels of serum IL-17 in rats with ulcerative colitis of syndrome of damp-heat in stomach and intestine，increase the levels of serum IFN-γand IL-27，which maybe one of themechanisms of Shaoyao Decoction in the treatment of ulcerative colitis.

Shaoyao Decoction；Ulcerative colitis；Syndrome of damp-heat in stomach and intestine；Th17 related cytokines

R574.620.5

A

1673-7210（2016）05（a）-0008-04

2015-11-30本文編輯：張瑜杰）

湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（2015142）；湖南省教育廳重點(diǎn)學(xué)科中醫(yī)外科學(xué)開放基金課題。