多聚左旋賴氨酸對大腦皮層星形膠質(zhì)細胞體外培養(yǎng)的影響

何玲 劉露 陳國俊

1.貴州省黔南州人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州都勻558000；

2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬一；神經(jīng)病學(xué)重點實驗室，重慶400016

多聚左旋賴氨酸對大腦皮層星形膠質(zhì)細胞體外培養(yǎng)的影響

何玲1，2劉露2陳國俊2

1.貴州省黔南州人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州都勻558000；

2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬一；神經(jīng)病學(xué)重點實驗室，重慶400016

目的探討不同濃度多聚左旋賴氨酸（PLL）對體外培養(yǎng)大腦皮層星形膠質(zhì)細胞（AS）的影響。方法采用酶消法、差速貼壁獲得大腦皮層AS細胞，細胞分為四組，分別種植于對照組（未包被PLL）、25μg/mL PLL包被組、50μg/mL PLL包被組、100μg/mL PLL包被組包被的培養(yǎng)瓶或板內(nèi)，運用細胞計數(shù)檢測細胞貼壁率及CCK檢測法繪制原代細胞生長曲線；待細胞鋪滿瓶底，予振蕩及傳代法去除其他類型細胞。第三代AS，通過膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）兔疫熒光計數(shù)細胞純度及CCK檢測細胞活性。結(jié)果細胞貼壁率隨PLL包被濃度的增加而增加；原代AS生長曲線顯示對照組生長速度較三組PLL包被組慢；除100μg/mL PLL包被組［（90±0.53）%］外，其余各組細胞純化率均大于95%；對照組第4、6天細胞活性均明顯低于各PLL包被組，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論PLL能有效地促進AS的貼壁和生長，適宜包被濃度為25～50μg/mL。

星型膠質(zhì)細胞；體外培養(yǎng)；多聚左旋賴氨酸；免疫熒光；膠質(zhì)纖維酸性蛋白

隨著近年對大腦皮層星形膠質(zhì)細胞（AS）的研究發(fā)現(xiàn)，AS以積極主動的方式參與調(diào)控突觸傳遞，在突觸重塑及學(xué)習(xí)記憶過程中起著重要的作用［1-2］。電生理技術(shù)的發(fā)展，也讓人們了解到，AS存在著許多離子通道［3］，與神經(jīng)元之間進行著積極的雙向信息交流［4］。因此，對AS的深入研究在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病中得到了進一步的重視［5-6］。多聚左旋賴氨酸（PLL）是常用的包被基質(zhì)之一，可促進細胞黏附、增生、分化［7］。對體外培養(yǎng)AS中是否使用PLL等促細胞黏附的包被基質(zhì)，以及PLL工作濃度，各文獻報道差異較大，本研究比較了文獻中PLL幾種常用包被濃度［8-10］，并通過檢測細胞貼壁率、純度、活性以進一步探討其對體外培養(yǎng)AS的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新生1～3日齡斯普拉格-杜勒鼠（SD）大鼠（動物合格證號：SCXK渝：2012-0001），雌雄不限，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 儀器及試劑

CO2恒溫敷箱（Thermo fisher science，美國），倒置顯微鏡（Olympus，日本），多功能酶標儀（Tecan，奧地利），恒溫搖床振蕩儀（上海天呈科技有限公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（Leica，德國），熒光顯微鏡（Olympus，日本）；DMEM高糖培養(yǎng)液（Gibco，美國），胎牛血清（Gibco，美國），多聚賴氨酸（Sigma，美國），Primocin（Invitrogen，美國），膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）兔抗大鼠多克隆抗體（Sigma，美國），F(xiàn)ITC山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），CCK-8檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組實驗設(shè)為對照組（無PLL包被）、25μg/mL PLL包被組、50μg/m L PLL包被組、100μg/m L PLL包被組。原代前1 d將不同濃度PLL包被于25 cm2培養(yǎng)瓶或不同規(guī)格孔板中，次日吸出PLL放于無菌超凈臺備用。

1.3.2 星型膠質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)參照文獻［11］的方法并適當(dāng)改進。新生1～3日齡SD大鼠，消毒后斷頭取腦，剪碎腦組織，加入0.25%胰蛋白酶，37℃下消化18 min，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止胰酶反應(yīng)，輕輕反復(fù)吹打成細胞懸液，400目篩過濾，收集該單細胞懸液，800 r/min離心5min，按2.5×105個/mL密度接種至未涂PLL的75 cm2的培養(yǎng)瓶中，移入CO2敷箱，37℃、5%CO2下培養(yǎng)20 min［12］，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶。吸出細胞懸液按密度1.5×105個/mL分別接種到不同濃度PLL包被的25 cm2培養(yǎng)瓶中。自第3天起，予15%胎牛血清培養(yǎng)基（含primocin 100μg/mL），每3 d換液1次，培養(yǎng)至9～12 d，細胞鋪滿瓶底，置于37℃恒溫搖床中，200 r/min振蕩18 h［13］。另按上述細胞接種密度接種于不同濃度PLL包被的24孔板及96孔板中。

1.3.3 臺盼藍活細胞計數(shù)檢測原代各PLL包被組細胞的貼壁率培養(yǎng)3 d后的細胞，消化獲得單細胞懸液，0.4%臺盼藍染色后計數(shù)細胞，每孔重復(fù)3次，取平均值。貼壁率=（貼壁細胞數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%。

1.3.4 CCK檢測法繪制原代細胞生長曲線初次分離的原代細胞，按密度為1×104個/孔接種于96孔板中。分別在2、4、6、8、10、12 d，加入10μL的CCK-8溶液，混勻，孵育2 h后，后用酶標儀在450 nm處掃描吸光度，記錄OD450值。連續(xù)12 d于同一時間點進行觀察，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.3.5 傳代培養(yǎng)過夜振蕩細胞予0.25%的胰酶消化，按5×104個/m L接種后放入敷箱中孵育達85%融合度后再次傳代。

1.3.6 免疫熒光鑒定GFAP是AS的標志性蛋白［14］，第三代AS以2.5×104個/mL接種于放有細胞爬片的24孔板中，孵育48 h，4%多聚甲醛4℃固定30min，山羊血清37℃封閉1 h，滴加一抗兔抗大鼠GFAP多抗（1∶100），4℃過夜，另設(shè)PBS代替一抗作為陰性對照。次日，1∶200山羊抗兔FITC熒光二抗，37℃避光孵育1 h，PBS沖洗3次，每次5 min，予DAPI復(fù)染細胞核3min。抗熒光淬滅液封片，激光共聚焦顯微鏡觀察AS形態(tài)；在熒光顯微鏡下觀察，每組各取4張爬片，每張爬片4個象限分別隨機選取3個200倍視野計數(shù)，取均值，計算綠色熒光陽性細胞百分比，即AS的純化率。

1.4 傳代情況及CCK法檢測不同濃度PLL包被組第三代AS細胞活性

同樣用CCK法檢測傳至第三代各PLL包被組細胞活性，每2天檢測1次，連續(xù)6 d于同一時間點進行觀察，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用x2檢驗；多組間比較采用單因素方差分析；采用Student-Neuman-Keuls（SNK）法進行多重比較；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代細胞貼壁率

對照組細胞貼壁率［（75.15±0.07）%］顯低于25μg/mLPLL包被組［（91.87±0.10）%］、50μg/mL PLL包被組［（94.44±0.07）%］、100μg/mL PLL包被組［（97.79±0.11）%］，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；25μg/mL PLL包被組細胞貼壁率與50μg/mL PLL包被組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；100μg/mL PLL包被組貼壁率最高，與25μg/mL PLL包被組及50μg/mL PLL包被組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示細胞貼壁率隨PLL包被濃度的升高而增大。

2.2 原代培養(yǎng)生長情況及各組細胞生長曲線

初次分離的AS接種后24 h后即可見折光度較好的貼壁細胞，接種后4 d內(nèi)生長緩慢，第6天，25μg/m L PLL包被組、50μg/mL PLL包被組、100μg/mL PLL包被組細胞進入對數(shù)生長期。而對照組在第8天左右進入對數(shù)生長期，各PLL包被組細胞生長曲線見圖1。接種后8～12 d，鏡下見AS呈“毛氈毯”樣，處于底層，其他類型細胞呈點狀分布在該層上。經(jīng)搖床過夜振蕩，AS與其他細胞分離，以梭狀及多角形為主，細胞邊緣較模糊，突起不明顯。見圖2。

圖1 不同濃度PLL包被組AS的生長曲線

圖2 普通光學(xué)顯微鏡下的原代星型膠質(zhì)細胞（200×）

2.3 免疫熒光鑒定AS及不同濃度PLL包被組AS純度的比較

第三代AS，倒置顯微鏡下可見細胞形態(tài)不規(guī)則，胞漿豐富且密度較低，核/漿比例小，胞核呈橢圓形，偏向于胞體一側(cè)；GFAP細胞兔疫熒光法鑒定，激光共聚集顯微鏡下見AS胞質(zhì)呈綠色熒光，核藍染，見圖3。各PLL包被組AS純化率見圖4，100μg/mL PLL包被組純化率［（90.00±0.53）%］低于對照組［（96.00± 0.63）%］、25μg/m L PLL包被組［（97.00±0.57）%］、50μg/m L PLL包被組［（98.00±0.77）%］，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組、25μg/mL PLL包被組、50μg/mL PLL包被組AS純化率兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 AS免疫熒光染色（400×）

圖4 不同濃度PLL包被組AS純化率比較

2.4 AS傳代情況及不同濃度PLL包被組第三代AS細胞活性

傳代后細胞生長速度較原代快，第一代及第二代AS，各PLL包被組細胞均能在4 d進入對數(shù)生長期，6 d達85%～90%的融合度。傳至第三代，對照組細胞貼壁后生長緩慢，各PLL包被組細胞仍保持前兩代的增殖速度。各PLL包被組第三代AS在第2、4、6天活性比較見圖5、表1。

圖5 不同濃度PLL包被組第三代AS活性的比較

表1 不同濃度PLL包被組第三代AS活性的比較，n=3）

表1 不同濃度PLL包被組第三代AS活性的比較，n=3）

注：與對照組同期比較，*P＜0.01；PLL：多聚左旋賴氨酸；AS：星型膠質(zhì)細胞

組別第2天第4天第6天對照組25μg/m L PLL包被組50μg/mLPLL包被組100μg/m L PLL包被組P值0.49±0.07 0.51±0.05 0.50±0.07 0.50±0.05＞0.05 0.64±0.06 0.99±0.06*1.00±0.06*1.04±0.08*＜0.01 0.72±0.06 1.02±0.07*1.04±0.08*1.06±0.07*＜0.01

3 討論

體外培養(yǎng)AS是進行神經(jīng)科學(xué)研究的基礎(chǔ)。本實驗中選取出生1～3 d的新生鼠，一方面因為出生后的神經(jīng)元不再分裂，從而可減少神經(jīng)元的污染［15］，另一方面因出生1～3 d的新生鼠，腦溝腦回形成不明顯，其腦膜及血管較易剝離。實驗中盡可能剝離血管及腦膜，是減少成纖維細胞污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［16］。

預(yù)包被PLL后，細胞貼壁率高且原代生長周期少于無PLL包被組，在8～9 d即呈“毛氈毯”樣鋪滿底層，與文獻中提到的較適宜的時間相一致［17］。原代細胞在前4 d生長緩慢，所需營養(yǎng)相對較少，故本實驗接種血清濃度為10%，以減少對細胞貼壁的影響，3 d后第1次換液，則改為15%血清濃度培養(yǎng)細胞，以滿足快速增殖細胞的營養(yǎng)。

激光共聚焦顯微鏡下清楚的觀察到第三代AS的細胞形態(tài)，與其他文獻中報道的AS形態(tài)一致［18］。通過熒光顯微鏡計算各PLL包被組細胞AS純度，除100μg/mL PLL包被組外，其余三組細胞均能達95%的純化率，其主要原因考慮為高濃度PLL讓原代大腦皮層各類細胞均牢固貼壁，導(dǎo)致在振蕩環(huán)節(jié)中，AS單層上的雜細胞不易被去除。有文獻報道［19］，在每次傳代前均進入搖床，加速振蕩及增加傳代次數(shù)也可進一步去除雜細胞。

利用AS較強的增殖活性，多次傳代可去除少突膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞等細胞，通常用于實驗的AS為傳至第三代及第四代的細胞［20］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，對照組細胞前2次傳代，尚能保持和其他PLL包被組的傳代速率，在傳至第三代時，對照組細胞增殖緩慢且活性較低。因此，通過包被PLL來促進細胞早期貼壁，對傳代后AS細胞活性有著重要的作用。

本研究結(jié)果表明，PLL預(yù)包被能提高AS貼壁和生長狀態(tài)，其中25～50μg/mL PLL包被濃度為適宜濃度，無PLL包被可影響細胞的存活率及活性，較大濃度PLL包被可影響AS的純化率。

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Effection of poly-L-lysine on cultures of cerebral cortical astrocytes in vitro

HE Ling1，2LU Liu2CHEN Guojun2
1.Department of Neurology，the People's Hospital of Qiannan，Guizhou Province，Duyun 558000，China；2.Key Laboratory of Neurology，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

Objective To investigate the effects of different concentrations of poly-L-lysine（PLL）on the cultures of cerebra lcorticalastrocytes（AS）in vitro.M ethods Astrocytes were dissociated from cerebra lcorticeswith themethods of trypsinization and differential adherence.They were divided into four groups and respectively planted in culture flasks or plateswhich coated PLL of different concentrations:control group（non-PLL），25μg/mL PLL envelop group，50μg/mL PLL envelop group，100μg/mL PLL envelop group.Adherent rates were detected by counted number and cell growth curveswere drawn with CCK-8 colorimeter.To remove other cell types，the cellswere shaken and passaged when they were confluent in amonolay on the bottom.Puritieswere assessed by immune of luorescence analysis of glial fibrillate acidic protein（GFAP）and cell viabilitiesweremeasured by CCK-8 colorimeter in the third generation astrocytes.Results Adherent rates were increased in a dose-dependent manner.Growth curves showed that the growth speed of control group was significantly slower than three PLL envelop groups.The purities of all groups were over 95%except 100μg/mL PLL envelop group［（90.00±0.53）%］.The cell activities of control group on the fourth day and the sixth day both were lower than three PLL envelop groups，the differences were statistially signifiant（P＜0.01）. Conclusion PLL-coated technique can effectively promote adhesion and growth of AS，and the best coated concentrations are 25-50μg/mL.

Astrocyte；In vitro；Poly-L-lysine；Immunofluorescence；Glial fibrillary acidic protein

Q 421

A

1673-7210（2016）05（a）-0004-05

2016-02-05本文編輯：任念）

國家自然科學(xué)基金資助項目（812101097）。

何玲（1979-），女，博士；研究方向：阿爾茨海默病。