復(fù)方金銀花外洗液體外抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究

黃開(kāi)遠(yuǎn)，吳群華，謝展雄，劉江紅

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復(fù)方金銀花外洗液體外抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究

黃開(kāi)遠(yuǎn)，吳群華，謝展雄，劉江紅

目的 對(duì)復(fù)方金銀花外洗液的體外抗炎作用進(jìn)行研究。方法 采用MTT法測(cè)定復(fù)方金銀花外洗液對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響；采用ELISA法觀察RAW264.7細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6的分泌情況；采用Western-blot法檢測(cè)TNF-α、IL-6蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示，復(fù)方金銀花外洗液在0～210 μL/mL對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力無(wú)顯著影響(P>0.05)；同時(shí)，金銀花外洗液能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的增殖活性，且呈劑量依賴性。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6含量顯著升高，與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，復(fù)方金銀花外洗液中、高劑量組培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6含量低于模型組(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，模型組中TNF-α、IL-6的蛋白含量明顯高于正常組(P<0.01)，不同濃度外洗液處理后，炎癥因子TNF-α、IL-6的蛋白表達(dá)水平顯著降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 復(fù)方金銀花外洗液在細(xì)胞水平的主要抗炎作用與抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

金銀花外洗液；外用；抗炎作用

0 引言

中藥外洗是中醫(yī)外治法的一個(gè)重要治療手段，主要應(yīng)用集中在足、踝、膝等下肢關(guān)節(jié)部位。外洗液發(fā)揮的藥理藥效作用主要是通過(guò)透皮吸收或是抑制表面真菌的增長(zhǎng)和增殖。

復(fù)方金銀花外洗液(外洗液)是我院在復(fù)方黃柏液的基礎(chǔ)上加減而成，由金銀花、苦參、黃柏、蛇床子、土茯苓五味藥組成。具有清熱解毒、燥濕止癢抗真菌的功效。臨床上主要應(yīng)用于因真菌感染引起的疥癬、腳癢，及足部濕疹等疾病。本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)作為炎癥模型。以炎癥因子TNF-α、IL-6為指標(biāo)，觀察復(fù)方金銀花外洗液在細(xì)胞水平的抗炎抗菌作用。為復(fù)方金銀花外洗液具有燥濕止癢的功效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為下一步的實(shí)驗(yàn)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 儀器 AB16UU型CO培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)；XDS-1B型倒置顯微鏡(重慶光電公司)；PURIFIATION EQUIPMENT超凈臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；RT2100C酶標(biāo)分析儀(深圳雷杜生命科技有限公司)；UW220分析天平(日本島津)。

1.2 試藥 金銀花、苦參、蛇床子、黃柏、土茯苓購(gòu)自廣東康美藥業(yè)有限公司，高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均為Gibco公司產(chǎn)品，培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿等耗材均購(gòu)于美國(guó)Corning公司，噻唑藍(lán)(MTT)、內(nèi)毒素(LPS)均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，其他試劑均為分析純。TNF-α、IL-6 兔抗小鼠多克隆抗體及TNF-α、IL-6 ELISA Kit均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 細(xì)胞 小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)購(gòu)買于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 外洗液的制備 按2份處方量的藥材加蒸餾水提取2次，比例為1∶12、1∶8，第1次1 h、第2次40 min，合并提取液并濃縮成1.0 g/mL，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱備用。

2.2 細(xì)胞分組 將生長(zhǎng)良好的RAW264.7細(xì)胞隨機(jī)分為5組，①空白組：RAW264.7；②模型組：LPS (0.2 μg/mL，下同)；③外洗液低濃度+LPS組；④外洗液中濃度+LPS組；⑤外洗液高濃度+LPS組。

2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 ①將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104個(gè)/mL，在96孔板中每孔加入細(xì)胞10 μL/孔(約5×103個(gè))，置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。②培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，加入適當(dāng)濃度的藥物，每個(gè)處理設(shè)5個(gè)平行組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。③將96孔板在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，每孔加10 μL 5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出上清液，每孔加100 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。④用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光值。⑤結(jié)果分析：細(xì)胞存活率%=(測(cè)試孔OD值-本底OD值)/(對(duì)照組OD值-本底OD值)×100%，本底OD值是在完全培養(yǎng)基加入MTT(無(wú)細(xì)胞)后，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)出其吸光值(OD)。

2.4 ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞分泌上清中TNF-α、IL-6的表達(dá)情況 按照“2.2”項(xiàng)下細(xì)胞分組情況，加入相應(yīng)藥物培養(yǎng)24 h后，吸取細(xì)胞上清液，按試劑盒說(shuō)明操作，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，計(jì)算樣品濃度。

2.5 Western blot分析TNF-α、IL-6的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中，4孔為1個(gè)樣本，按照“2.2”項(xiàng)下細(xì)胞分組情況，在收集上清液后，用PBS沖洗1次，吸棄PBS，胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，4 ℃、12 000 r/min 離心25 min，將所得上清液用Bradford法行蛋白含量測(cè)定后，放-80 ℃冰箱保存。將制備的蛋白樣本進(jìn)行凝膠電泳，電泳后用電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，一抗為TNF-α、IL-6抗體，二抗為羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶的抗體，β-actin蛋白作為對(duì)照。利用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色反應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果以X光膠片曝光。圖片掃描保存為電腦文件，用Image J(NIH 美國(guó))成像系統(tǒng)軟件對(duì)Western blot條帶進(jìn)行灰度值掃描并分析結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方金銀花外洗液對(duì)細(xì)胞活力的影響 各孔OD值大小與細(xì)胞活力呈正比，各組吸光度統(tǒng)計(jì)值見(jiàn)表1。如表1所示，外洗液作用于RAW264.7細(xì)胞24 h后，30～210 μL/mL組的細(xì)胞活力與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同濃度外洗液對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響(n=5)

3.2 復(fù)方金銀花外洗液對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞活力的影響 如表2所示，0.2 μg/mL LPS作用細(xì)胞24 h后，與正常組比較，細(xì)胞活力增加到115.63，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明0.2 μg/mL LPS作用RAW264.7細(xì)胞24 h后，能促進(jìn)細(xì)胞的增殖活力。外洗液作用于LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞后，能夠劑量依賴性地抑制細(xì)胞的增殖活性。其中60、90、120 μL/mL外洗液可基本取消LPS對(duì)細(xì)胞活力的增強(qiáng)作用(細(xì)胞存活率為100%±5%)，因此，選定這3個(gè)劑量濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的給藥濃度。

3.3 復(fù)方金銀花外洗液對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。正常組RAW264.7細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平較低，給予0.2 μg/mL LPS刺激后，模型組中TNF-α、IL-6的含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，外洗液中、高劑量組均能抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α，并呈一定的劑量依賴關(guān)系(P<0.05)，但外洗液低劑量組對(duì)TNF-α的抑制效果不明顯(P>0.05)；金銀花外洗液3個(gè)濃度劑量組均能抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 0.2 μg/mL LPS與不同濃度外洗液對(duì)RAW264.7

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表3 外洗液對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6的影響(n=5)

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.4 蛋白印跡法檢測(cè)TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)結(jié)果 0.2 μg/mL LPS刺激后，TNF-α、IL-6的蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。外洗液各濃度組處理后，炎癥因子TNF-α、IL-6的蛋白表達(dá)水平降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，藥物對(duì)炎癥因子的表達(dá)具有抑制作用。見(jiàn)圖1。

4 討論

清熱類中藥大部分具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒等藥理作用，且多數(shù)在外用方面有較好的治療作用，具有選擇多樣性和明顯抗真菌和殺滅真菌的特點(diǎn)[1]。

圖1 Western blot法檢測(cè)藥物對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞的TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)情況

注：1.模型組，2.正常組，3.外洗液60 μL/mL組，4.外洗液90 μL/mL組，5.外洗液120 μL/mL組。與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.05

本實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞，用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子、促進(jìn)與炎癥有關(guān)的基因的表達(dá)來(lái)制造炎癥模型是現(xiàn)代細(xì)胞研究體系上巨噬細(xì)胞RAW264.7良好的炎癥反應(yīng)模型[2]。嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷或膿毒癥等感染或非感染因素作用于機(jī)體，引起機(jī)體失控的自我持續(xù)放大和自我破壞的全身性炎癥反應(yīng)，如不及時(shí)診治易進(jìn)展為多器官功能障礙綜合征[3]。巨噬細(xì)胞在保護(hù)機(jī)體免受外界病原體侵襲方面具有不可替代的作用[4]。炎癥反應(yīng)是人體各類疾病的發(fā)病基礎(chǔ)，其分泌的細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)瀑布式地放大炎癥效應(yīng)，在炎癥、腫瘤、自身免疫性疾病發(fā)揮關(guān)鍵作用[5-6]。機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)后，最初分泌TNF-α，其核心作用是在炎癥反應(yīng)中激活其他細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)，直接反映炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度[7]。在炎癥反應(yīng)初期，中性粒細(xì)胞吞噬能力減弱與IL-6的大量表達(dá)有關(guān)，可以導(dǎo)致組織細(xì)胞的損害，加劇炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)一步催化炎癥反應(yīng)進(jìn)程[8]。

MTT法簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)，間接反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)[9]。MTT結(jié)果顯示，外洗液在濃度為210 μL/mL范圍內(nèi)對(duì)靜息狀態(tài)的細(xì)胞無(wú)毒害作用，可以用于后繼實(shí)驗(yàn)的研究。LPS作用于RAW264.7細(xì)胞后，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖活力，顯示細(xì)胞處于激活狀態(tài)。與模型組相比，外洗液能夠劑量依賴性地抑制細(xì)胞的增殖活性。其中60、90、120 μL/mL金銀花外洗液可基本取消LPS對(duì)細(xì)胞活力的增強(qiáng)作用(細(xì)胞存活率為100%±5%)，因此，選定這3個(gè)劑量濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的給藥濃度。LPS刺激RAW264.7細(xì)胞后，產(chǎn)生早期炎癥因子(如TNF-α、IFN-γ、IL-6等)[10]。TNF-α、IL-6是最重要的促炎細(xì)胞因子，其中IL-6可以通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞分化，進(jìn)而活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重，TNF-α則可使黏附的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生呼吸爆發(fā)，促進(jìn)其他多種促炎細(xì)胞因子[11]，同時(shí)，TNF-α、IL-6參與進(jìn)展期關(guān)節(jié)破壞的典型的炎性細(xì)胞因子[12]。本研究結(jié)果表明，外洗液中、高劑量組均能抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α、IL-6。提示外洗液的抗炎效應(yīng)與抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)。通過(guò)Western blot結(jié)果顯示，模型組中TNF-α、IL-6的蛋白含量高于正常組，表明LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞作為炎癥模型造模成功。不同濃度外洗液處理后，炎癥因子TNF-α、IL-6的蛋白表達(dá)水平降低，表明藥物對(duì)炎癥因子的表達(dá)具有抑制作用。

綜上所述，復(fù)方金銀花外洗液在細(xì)胞水平的主要抗炎作用與抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的蛋白表達(dá)水平有關(guān)。這為金銀花外洗液在臨床上應(yīng)用于因真菌感染引起的疥癬、腳癢及足部濕疹等疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為金銀花外洗液主要藥效成分的分析提供了理論依據(jù)。

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Study oninvitroanti-inflammatory effect of honeysuckle lotion

HUANG Kai-yuan,WU Qun-hua,XIE Zhan-xiong,LIU Jiang-hong (Department of Pharmacy,Shenzhen Longhua New District Central Hospital,Shenzhen 518110,China)

Objective To evaluate theinvitroanti-inflammatory activities of honeysuckle lotion.Methods After incubating RAW264.7 cells with honeysuckle lotion,the cell viability was determined using an MTT assay.The levels of TNF-α and IL-6 were calculated by ELISA assay.In addition,the expression of them was confirmed by Western Blot.Results MTT assay indicated that honeysuckle lotion at 0～210 μL/mL did not affect the cell viability of RAW264.7 significantly (P>0.05),but it restrained the proliferation activity of RAW264.7 cell induced by LPS in a dose-dependent manner.The result of ELISA showed that the levels of TNF-α and IL-6 increased markedly in model group and dropped more obviously in the middle and high dose groups compared with normal group (P<0.01).Furthermore,Western blot showed the expression of TNF-α and IL-6 in model group was stronger than that of normal group (P<0.01),while after treatment with different concentrations of honeysuckle lotion,they were declined significantly (P<0.05).Conclusion The anti-inflammatory efficacy of honeysuckle lotion is mainly related to inhibiting the expression of TNF-α and IL-6.

Honeysuckle lotion;External usage;Anti-inflammatory effect

2016-03-17

深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，深圳 518110

10.14053/j.cnki.ppcr.201610006