丹槐銀屑濃縮丸治療家兔尋常型銀屑病的機(jī)制研究

馮 萍，黃 萍，吳勝英

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丹槐銀屑濃縮丸治療家兔尋常型銀屑病的機(jī)制研究

馮 萍1，黃 萍1，吳勝英2*

目的 建立兔尋常型銀屑病動(dòng)物模型，探討丹槐銀屑濃縮丸對(duì)其血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及受體表達(dá)的影響。方法 將40只家兔隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、阿維A組、丹槐組。測(cè)定4組家兔耳病變組織VEGF蛋白及VEGF mRNA的表達(dá)，以及受體1(FLT-1)、受體2(KDR)的表達(dá)量，檢測(cè)真皮乳頭血管密度(MVD)、外周血T淋巴細(xì)胞百分率及肝功能三項(xiàng)[膽汁酸(TBA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)]。結(jié)果 治療后，與模型組比較，丹槐組VEGF蛋白及VEGF mRNA、受體FLT-1、受體KDR表達(dá)、MVD、T淋巴細(xì)胞百分率均顯著下降(P<0.05)；與阿維A組比較，丹槐組VEGF蛋白及VEGF mRNA、受體FLT-1、受體KDR表達(dá)明顯下降。丹槐組與阿維A組間MVD、T淋巴細(xì)胞百分率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。丹槐組肝功能指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。結(jié)論 丹槐銀屑濃縮丸在不影響動(dòng)物肝功能的情況下，可降低實(shí)驗(yàn)性尋常型銀屑病家兔耳病變組織VEGF的過度表達(dá)，阻斷VEGF與其受體結(jié)合，抑制病變組織皮下血管新生與重建，并具有與陽(yáng)性阿維A類似的抑制T細(xì)胞增殖的作用，可抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的皮損局部炎癥反應(yīng)，進(jìn)而降低真皮乳頭微血管的異常增生，減輕尋常型銀屑病對(duì)皮膚組織的破壞。

丹槐銀屑濃縮丸；尋常型銀屑?。谎軆?nèi)皮生長(zhǎng)因子；真皮乳頭血管密度；肝功能

0 引言

尋常型銀屑病又稱“白疙”，系外邪化熱入血，血瘀、血燥、血熱病癥并存乃現(xiàn)風(fēng)熱濕之象而發(fā)病[1]。中醫(yī)在治療尋常型銀屑病時(shí)，講究“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅”。丹槐銀屑濃縮丸由槐花、丹參、黃連、雞血藤、柴草、地黃、赤芍、白鮮皮、大青葉等諸藥配伍調(diào)合而成，其主要有效藥理成分為丹參酮、黃連素、小檗堿、丹參素等，具有祛屑止癢、清熱解毒、涼血活血的功效[2]，在臨床治療中取得了肯定的療效。銀屑病患者病變脫落的皮屑中有VEGF (Vascular endothelial growth factor，VEGF)高表達(dá)及T淋巴細(xì)胞異常增殖的現(xiàn)象，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也有類似發(fā)現(xiàn)[3]，故抑制VEGF過度表達(dá)及T淋巴細(xì)胞異常增殖可減輕病變組織微小靜脈血管的通透性，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖；抑制VEGF與其受體FLT-1、受體KDR結(jié)合，可降低VEGF誘導(dǎo)血管再生而起治療作用。本研究系統(tǒng)觀察丹槐銀屑濃縮丸在治療尋常型銀屑病皮損中的作用，探討其作用機(jī)制，為臨床治療尋常型銀屑病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 家兔40只，體重(2.0±0.2) kg，采用隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)隨機(jī)分為對(duì)照組、阿維A組、模型組、丹槐組，每組10只。治療過程中保證動(dòng)物房溫度為22～26 ℃，濕度45%～75%，自然光照，動(dòng)物應(yīng)分籠飼養(yǎng)以免干擾治療，給予家兔自由飲水、普通飼料喂養(yǎng)，及時(shí)清理糞便，每日觀察動(dòng)物進(jìn)食情況。本研究中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。治療過程中觀察動(dòng)物皮損部位病理改變，治療結(jié)束后取病變組織做病理學(xué)檢查，觀察表皮角質(zhì)層是否角化，以及釘突及棘層的病理改變情況。

1.2 儀器及藥品 丹槐銀屑濃縮丸(黑龍江省中醫(yī)研究院醫(yī)院研制，規(guī)格：1 g/丸，批號(hào)：090801)；普萘洛爾片(江蘇常州亞邦制藥有限公司，批號(hào)：040512)；阿維A膠囊(重慶華邦制藥有限公司，10 mg，批號(hào)：20010126)；兔VEGF共調(diào)節(jié)趨化因子1 (VCC1) ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：028457)；提取mRNA試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑(美國(guó)Invitrogen公司)。

1.3 家兔尋常型銀屑病動(dòng)物模型的制備及給藥方法 參照文獻(xiàn)[4]，先將普萘洛爾片研碎加蒸餾水配制成5%溶液造模，阿維A膠囊研碎加蒸餾水配制成5%的溶液，丹槐銀屑濃縮丸配制成10%的溶液備用。造模型時(shí)，剃去4組家兔雙耳背側(cè)兔毛，阿維A組、模型組、丹槐組家兔用5%普萘洛爾均勻涂成直徑約1 cm、厚1 mm的藥物層，以雙耳涂藥處出現(xiàn)尋常型銀屑病樣皮損為造模成功，對(duì)照組涂生理鹽水。四組家兔均1次/d給藥，連續(xù)涂1個(gè)月造模。本研究中，阿維A組、模型組、丹槐組造模1個(gè)月均出現(xiàn)典型的尋常型銀屑病樣皮損，造模成功率為100%。參照文獻(xiàn)[5]，根據(jù)人與動(dòng)物體表面積換算公式[家兔用藥劑量(mg/kg)=w(人與兔體表面積換算系數(shù))×A(人用藥劑量)]，家兔阿維A膠囊用藥量為5 mg/kg [10 mL/(kg·d)]，丹槐銀屑濃縮丸用藥量為10 mg/kg [10 mL/(kg·d)。造模成功后，阿維A組用5%阿維A溶液10 mL/(kg·d)灌胃；丹槐組用10%丹槐銀屑濃縮丸溶液[按10 mL/(kg·d)灌胃]；空白模型組和模型組給予等體積生理鹽水。四組動(dòng)物均連續(xù)治療1個(gè)月。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 參照文獻(xiàn)[6]，取家兔尋常型銀屑病樣皮損部位組織，石蠟包埋、切片，按常規(guī)處理，微波抗原修復(fù)后，用兔抗人CD34單抗(DAKO公司)顯色、蘇木素復(fù)染，在高倍鏡(×400)下觀察被CD34抗體染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，不論管腔內(nèi)有無(wú)紅細(xì)胞，均作為一個(gè)微血管計(jì)數(shù)，計(jì)算5個(gè)高倍鏡(×400)視野下微血管數(shù)平均值為MVD。參照文獻(xiàn)[7]，分別經(jīng)家兔耳緣靜脈取外周血，計(jì)算治療前后T淋巴細(xì)胞百分率。取家兔尋常型銀屑病樣皮損部位組織編號(hào)，采用ELISA法測(cè)定各組兔尋常型銀屑病樣皮損部位組織VEGF蛋白、FLT-1、KDR蛋白表達(dá)的光密度OD值。用SP-Max 3500FL型多功能熒光酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定VEGF蛋白的OD值，提取總RNA，設(shè)計(jì)20 μL體系，以AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中獲得的cDNA模板1 μL、GAPDH 為內(nèi)對(duì)照，設(shè)計(jì)20 μL PCR 擴(kuò)增體系。上游引物：5′-GTTTCTGCTGCCTTGTAT-3′。下游引物：5′-ACTATGTCGCTTTCTTGG-3′。94 ℃預(yù)變性5 min 后，按94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下拍照，根據(jù)各條帶的吸收度，采用GEL-Pro Analyzer軟件分析VEGF的mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 家兔肝功能ALT、AST、TBA比較 見表1。治療前后對(duì)照組、模型組的肝功能三項(xiàng)指標(biāo)(ALT、AST、TBA)均保持在正常水平。治療后1個(gè)月，阿維A組的ALT、AST、TBA升高，與對(duì)照組、丹槐組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 家兔皮損組織VEGF蛋白、VEGF mRNA表達(dá)及外周血T淋巴細(xì)胞百分率比較 見表2。治療前后，對(duì)照組皮損組織VEGF蛋白、VEGF mRNA表達(dá)及T淋巴細(xì)胞增殖百分率維持在較恒定水平(P>0.05)；模型組上述指標(biāo)均高于對(duì)照組(P<0.05)，說明造模型成功。治療后，阿維A組VEGF蛋白、VEGF mRNA表達(dá)略有降低，但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；T淋巴細(xì)胞顯著降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療后，丹槐組VEGF蛋白、VEGF mRNA表達(dá)均明顯降低，與模型組及阿維A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；T淋巴細(xì)胞百分率降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 家兔皮損組織 MVD、KDR及FLT-l比較 見表3。對(duì)照組治療前后MVD、KDR 及FLT-l均較低。模型組MVD、KDR及FLT-l與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療后，阿維A組MVD顯著降低，與對(duì)照組及模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；KDR、FLT-l略有降低，但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，丹槐組FLT-l、KDR均降低，與模型組及阿維A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MVD顯著降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

尋常型銀屑病具有易復(fù)發(fā)性、頑固性、泛發(fā)性的特點(diǎn)，發(fā)病多與遺傳、自身免疫異常有關(guān)，T淋巴細(xì)胞增殖、內(nèi)分泌失調(diào)、炎癥因子、精神神經(jīng)等因素均可誘發(fā)或加重病情[8]。大量研究表明，銀屑病患者VEGF及其受體FLT-1、KDR出現(xiàn)異常表達(dá)，且與尋常型銀屑病病理改變呈正相關(guān)[9]，VEGF過度表達(dá)刺激介導(dǎo)可造成真皮血管(尤其是真皮乳頭微血管)的重構(gòu)與新生，病理檢查顯示，MVD密度增高、毛細(xì)血管擴(kuò)張、表皮細(xì)胞增殖過快和角化不全而加重病理進(jìn)程[10-11]。

表1 家兔肝功能ALT、AST、TBA比較

注：*與阿維A組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05

表2 家兔皮損組織VEGF蛋白、VEGF mRNA表達(dá)及T淋巴細(xì)胞增殖百分率比較(n=10)

注：*與阿維A組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05

表3 丹槐銀屑濃縮丸對(duì)家兔皮損組織FLT-l、KDR及MVD的影響

注：*與阿維A組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05

本研究結(jié)果顯示，模型組家兔VEGF蛋白、VEGF mRNA、FLT-l、KDR、MVD及T淋巴細(xì)胞均明顯高于對(duì)照組，說明VEGF過度表達(dá)及T淋巴細(xì)胞異常增殖與尋常型銀屑病有明確的相關(guān)性。治療后，阿維A組VEGF蛋白、VEGF mRNA、FLT-l、KDR未明顯降低，說明阿維A治療尋常型銀屑病的藥理作用與VEGF表達(dá)無(wú)關(guān)；同時(shí)，由于阿維A的藥理作用主要是抑制T細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，抑制表皮Ⅰ型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分化，且抑制白細(xì)胞趨化性[12]，使得T淋巴細(xì)胞顯著降低。但阿維A會(huì)造成嚴(yán)重的肝功能損害。治療后，丹槐組VEGF蛋白、VEGF mRNA及其受體FLT-l、KDR表達(dá)及MVD明顯降低，且沒有出現(xiàn)明顯的肝功能損害。結(jié)果表明，丹槐銀屑濃縮丸可明顯下調(diào)異常升高的VEGF及其受體FLT-l、KDR表達(dá)。

VEGF蛋白是一種高度特異性、功能最強(qiáng)的促血管形成因子[13]，具有促進(jìn)血管活性物質(zhì)合成、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移及再生的特殊功能[14]。正常情況下，機(jī)體VEGF蛋白及其受體KDR、FLT-l維持一定的平衡關(guān)系，以保證血管內(nèi)皮及功能正常。當(dāng)機(jī)體抵抗力下降或炎癥刺激、免疫異常，尤其是出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，VEGF蛋白及其受體FLT-l、KDR間的平衡可能被破壞，VEGF、FLT-l、KDR均可出現(xiàn)過度表達(dá)，進(jìn)而刺激真皮乳頭微血管的異常增生，加重尋常型銀屑病的發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致嚴(yán)重銀屑病皮損。

本方中，紫草為君藥，味苦性寒，可涼血清熱；黃連、大青葉、白鮮皮為臣藥，可清熱解毒[15]，其中，黃連的有效成分-小檗堿和黃連素具有清熱解毒、抗炎清腫的作用[16]。方中丹參、雞血藤等佐藥均為活血化瘀的良藥，中藥典籍《吳普本草》謂“丹參味辛、性涼”，其主要有效藥理成分-丹參酮及丹參素均具有活血化淤的作用，可拮抗心、腦血管平滑肌細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，改善機(jī)體ATP酶的活性，松弛心、腦血管平滑肌而達(dá)到改善微循環(huán)的作用[17]。另外，白茅根藥性寒，可涼血生津、清熱利水，澤瀉藥性甘寒、可泄熱毒。以上君臣諸藥可清泄熱毒、涼血活血、疏通膚絡(luò)、祛屑止癢，抑制VEGF蛋白及其受體FLT-l和KDR的過度表達(dá)。由于尋常型銀屑病的T淋巴細(xì)胞異常增殖，故其T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的異常增殖也可能是尋常型銀屑病的發(fā)病機(jī)制之一[18]，T細(xì)胞皮膚歸巢與尋常型銀屑病皮損密切相關(guān)[19]。本研究顯示，丹槐組的T淋巴細(xì)胞百分率明顯降低，但作用沒有阿維A明顯，結(jié)果表明，丹槐銀屑濃縮丸可抑制T淋巴細(xì)胞增殖，作用與陽(yáng)性治療藥物阿維A類似。

總之，丹槐銀屑濃縮丸有明確的涼血活血、清熱解毒、祛風(fēng)止癢的功效[20]，在不影響動(dòng)物肝功能的情況下，可阻斷VEGF與其受體結(jié)合，降低尋常型銀屑病模型動(dòng)物病變組織血管內(nèi)皮VEGF的過度表達(dá)和T細(xì)胞增殖介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，通過減少真皮乳頭微血管的異常增生、降低皮損而達(dá)到治療作用。

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Study on the mechanism of Danhuaiyinxie concentrated pill in the treatments of psoriasis vulgaris of rabbits

FENG Ping1,HUANG Ping1,WU Sheng-ying2*(1.Department of Dermatology,Shiyan Taihe Hospital,Shiyan 442000,China;2.Department of Pathophysiology,Hubei Medical College,Shiyan 442000,China)

Objective To establish the animal model of psoriasis vulgaris,and to study the effect of Danhuaiyinxie concentrated pill on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor.Methods Forty rabbits were randomly divided into control group,model group,acitretin group and danhuai group.The VEGF protein and expression of VEGF mRNA,and the receptor 1 (Flt-1) and receptor 2 (KDR) expression were detected in ear tissue of rabbits.Then the dermal papillary vascular density (MVD),percentages of peripheral blood T lymphocyte and three indexes of liver function (TBA,ALT and AST) were recorded.Results After treatment,MVD,percentages of peripheral blood T lymphocyte and the expression of VEGF protein,VEGF mRNA,FLT-1 and KDR in danhuai group were lower than those of model group (P<0.05);the expression of VEGF protein,VEGF mRNA,FLT-1 and KDR in danhuai group was lower than that of acitretin group,but no significant difference was found in MVD and the percentages of peripheral blood T lymphocyte between danhuai group and acitretin group (P>0.05).The indexes of liver function (TBA,ALT and AST) were normal in danhuai group.Conclusion Danhuaiyinxie concentrated pill can reduce the over-expression of VEGF in the ear tissue of experimental rabbit model of psoriasis vulgaris,block the binding of VEGF to its receptors,and inhibit the angiogenesis and reconstruction of the lesion tissue and T cell proliferation with similar effect as acitretin,thus reducing the abnormal proliferation of dermal microvessels and the damage of psoriasis vulgaris to skin tissue.

Danhuaiyinxie concentrated pill;Psoriasis vulgaris;Vascular endothelial growth factor (VEGF);Density of blood vessels in papillary dermis;Liver function

2016-03-01

1.十堰市太和醫(yī)院皮膚科(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院病理生理教研室，湖北 十堰 442000

湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(D20092404)

10.14053/j.cnki.ppcr.201610003

*通信作者