羥基磷灰石-植物聯(lián)合修復(fù)對(duì)Cu/Cd污染植物根際土壤微生物群落的影響①

孫婷婷，徐 磊，周 靜，樊劍波陳 晏

（1 中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008；2 中國(guó)科學(xué)院紅壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)站，江西鷹潭 335211；3 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4 江西省科學(xué)院生物資源研究所，南昌 330096）

羥基磷灰石-植物聯(lián)合修復(fù)對(duì)Cu/Cd污染植物根際土壤微生物群落的影響①

孫婷婷1，3，徐 磊1，3，周 靜1，2，4，樊劍波1，陳 晏1，2*

（1 中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008；2 中國(guó)科學(xué)院紅壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)站，江西鷹潭 335211；3 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4 江西省科學(xué)院生物資源研究所，南昌 330096）

針對(duì)江西貴溪 Cu、Cd 重金屬污染土壤，通過(guò)田間試驗(yàn)，比較無(wú)機(jī)生物材料羥基磷灰石及 3 種植物（海州香薷、巨菌草、伴礦景天）與羥基磷灰石聯(lián)合修復(fù)對(duì)土壤總 Cu、Cd 的吸收及對(duì)活性 Cu、Cd 的鈍化吸收能力差異。采用磷脂脂肪酸（PLFA）分析法，比較不同修復(fù)模式對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，以評(píng)估土壤微生態(tài)環(huán)境對(duì)不同修復(fù)措施的響應(yīng)。研究結(jié)果表明：羥基磷灰石的施加可顯著提高土壤 pH，并有效鈍化土壤活性 Cu、Cd 含量，但對(duì)土壤總 Cu、Cd 的含量影響較小。植物與羥基磷灰石的聯(lián)合修復(fù)在顯著降低土壤活性 Cu、Cd （P＜0.05） 的同時(shí)，減少了植物根際土壤總 Cu、Cd 的含量 （P＜0.05）。不同修復(fù)措施對(duì)土壤微生物群落組成影響差異明顯。單獨(dú)施加羥基磷灰石與土壤真菌群落呈顯著正相關(guān)，使土壤真菌生物量提高，從而引起真菌/細(xì)菌（F/B）的升高。植物與羥基磷灰石的聯(lián)合修復(fù)可有效緩解土壤真菌化的趨勢(shì)，其中巨菌草與羥基磷灰石的聯(lián)合修復(fù)可有效提高土壤革蘭氏陽(yáng)性、革蘭氏陰性細(xì)菌生物量及多樣性，降低 F/B 值，從而降低土壤真菌病害的風(fēng)險(xiǎn)。不同植物根系活性代謝引起有機(jī)質(zhì)的積累促進(jìn)植物與羥基磷灰石處理中根際有機(jī)碳含量顯著提高。聚類增強(qiáng)樹(shù)（Aggregated boosted tree，ABT）分析結(jié)果表明：不同修復(fù)模式是影響土壤微生物群落的重要因素，其次土壤 pH 和 Cu 的含量及活性也是改變重金屬污染區(qū)域微生物群落的因子。該研究從微生物群落結(jié)構(gòu)角度解釋了植物與羥基磷灰石聯(lián)合修復(fù)對(duì)土壤微生態(tài)體系的作用，為開(kāi)展 Cu、Cd 等重金屬污染地植物與無(wú)機(jī)生物材料的聯(lián)合修復(fù)方式的篩選及實(shí)施提供可靠的理論依據(jù)。

銅；鎘；巨菌草；海州香薷；伴礦景天；羥基磷灰石；微生物群落

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和城市化水平的推進(jìn)，我國(guó)土地污染，特別是重金屬污染儼然成為危害土壤生態(tài)環(huán)境和人類健康的關(guān)鍵問(wèn)題而日益受到關(guān)注［1］。以江西省北部貴溪市為例，其冶煉廠周邊至少 260 hm2種植土壤因長(zhǎng)期大氣沉降、水源灌溉、廢渣傾倒而導(dǎo)致銅（Cu）、鎘（Cd）等重金屬含量嚴(yán)重超標(biāo)，土壤生態(tài)體系遭到嚴(yán)重破壞［2］。因此，選擇合理有效的修復(fù)措施，降低重金屬積累的危害風(fēng)險(xiǎn)，是重金屬污染區(qū)亟待解決的問(wèn)題。

相比物理、化學(xué)的傳統(tǒng)修復(fù)技術(shù)，近年來(lái)，采用超積累植物或耐受性植物的修復(fù)技術(shù)因其對(duì)土壤微生態(tài)擾動(dòng)小、治理成本低、原位治理等優(yōu)勢(shì)在國(guó)內(nèi)外許多低、中污染場(chǎng)地得到關(guān)注與應(yīng)用［3］。伴礦景天（Sedum plumbizincicola）、海州香薷（Elsholtzia splendens）是目前國(guó)內(nèi)用于 Cd 與 Cu 污染場(chǎng)地修復(fù)的重要超積累植物。然而，由于其生長(zhǎng)速度和植物生物量的固有缺陷，使其在應(yīng)用過(guò)程中受限［4］。崔紅標(biāo)等［5］針對(duì)江西貴溪地區(qū) Cu、Cd 污染片區(qū)，使用生物量大且生長(zhǎng)快速的重金屬耐受性植物巨菌草（Pennisetum sp.），盆栽模式下分析了重金屬提取修復(fù)效率，發(fā)現(xiàn)其對(duì) Cu、Cd 的吸收量受到土壤 pH 的調(diào)控。Leitenmaier等［3］發(fā)現(xiàn)，多數(shù) HM-積累性及 HM-耐受性植物的修復(fù)效率不同程度地受到土壤環(huán)境，如 pH、土壤其他重金屬含量等的影響。因此，合理優(yōu)化修復(fù)植物生長(zhǎng)土壤環(huán)境，是促進(jìn)植物修復(fù)的有效途徑。

無(wú)機(jī)生物材料羥基磷灰石 （Ca10（PO4）6（OH）2，HAP） 因其高比表面積及優(yōu)良的生物學(xué)特性被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥合成、骨移植作為生物催化劑和吸附劑。基于羥基磷灰石在氧化、還原條件下的高穩(wěn)定性和對(duì)重金屬的廣泛高吸附量的特性，使其在長(zhǎng)期污染水體和土壤中成為理想的重金屬治理材料［6］。Cui 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，羥基磷灰石的添加可提高土壤 pH，一方面有效鈍化有效 Cu、Cd 含量，另一方面改善土壤功能酶活性，促進(jìn)耐 Cu、Cd 類植物地上生物量的提高，從而提高植物對(duì)土壤重金屬的吸收量。

作為土壤質(zhì)量評(píng)價(jià)不可缺少的生物學(xué)指標(biāo)，土壤微生物維持著土壤生物活性，保證土壤養(yǎng)分循環(huán)和土壤結(jié)構(gòu)的形成。微生物群落結(jié)構(gòu)的變化能敏感地反映出土壤質(zhì)量和健康狀況，是評(píng)價(jià)自然或人為干擾引起的土壤變化的重要指示因子。滕應(yīng)等［8］研究指出，土壤微生物群落多樣性能較好地反映紅壤地區(qū)污染場(chǎng)地修復(fù)體系中微生態(tài)體系的穩(wěn)定性。因此，明確微生物群落的作用、深入了解其群落功能和結(jié)構(gòu)變化對(duì)于整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的研究具有重要意義。

本研究擬通過(guò)綜合比較羥基磷灰石與植物（巨菌草、伴礦景天、海州香薷）聯(lián)合修復(fù)江西貴溪 Cu 冶煉廠周邊重金屬 Cu、Cd 污染土地，植物根際土壤中 Cu、Cd 全量及有效 Cu、Cd 的殘留量，不同植物生物量及對(duì)重金屬的吸收量，以及不同聯(lián)合修復(fù)作用對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。綜合以上修復(fù)參數(shù)，評(píng)價(jià)羥基磷灰石與不同植物的聯(lián)合修復(fù)措施對(duì)土壤Cu、Cd 的鈍化效果，為篩選聯(lián)合修復(fù)方式進(jìn)行場(chǎng)地原位修復(fù)重金屬污染土壤提供技術(shù)指導(dǎo)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)地位于江西貴溪某Cu冶煉廠污水和廢氣污染的農(nóng)田，主要污染物是Cu、Cd，而且由于常年污水、廢氣和酸雨的累積污染以及江西地區(qū)土壤酸性較強(qiáng)等特性，該地區(qū)的重金屬污染情況十分嚴(yán)峻，本土植物難以生長(zhǎng)，有些更嚴(yán)重的地方甚至寸草不生，嚴(yán)重危害到了當(dāng)?shù)厝藗兊恼Ｉa(chǎn)生活。在試驗(yàn)開(kāi)始前，測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)為27.34 g/kg，堿解氮為169.5 mg/kg，速效磷為78.2 mg/kg，pH為4.35，速效鉀為142.5 mg/kg，全Cu為596.45 mg/kg，全Cd為1.324 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)材料

所用土壤改良劑為羥基磷灰石（純度＞96%），采購(gòu)于南京埃普瑞納米材料公司，粒徑為3 μm，比表面積45.7 m2/g，pH 為7.71，Ca/P的摩爾比為1.72，Cu 和Cd 含量分別為5.85 mg/kg 和38.3 μg/kg。巨菌草購(gòu)于當(dāng)?shù)卮迕瘢缓Ｖ菹戕?、伴礦景天均在室內(nèi)育苗。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)了5個(gè)處理，分別為不施微米羥基磷灰石（CK）、微米羥基磷灰石+雜草（MW，不種修復(fù)植物，自然生長(zhǎng)的雜草）、微米羥基磷灰石+巨菌草（MP）、微米羥基磷灰石+海州香薷（ME）、微米羥基磷灰石+伴礦景天（MS）。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，隨機(jī)排列，小區(qū)面積為4 m×5 m，每個(gè)小區(qū)用水泥墻隔開(kāi)（水泥墻地上部分20 cm，地下部分30 cm）。除了CK，其他處理小區(qū)植物在種植前統(tǒng)一施加36 t/hm2微米羥基磷灰石。海州香薷和伴礦景天間距為20 cm×20 cm，巨菌草間距為50 cm×50 cm，于2014月5月6日統(tǒng)一栽種，各個(gè)處理田間管理與施肥模式保持一致。

1.4 樣品采集

2014年7月15日收獲伴礦景天，12月5日收獲其他處理植物。在收獲的同時(shí)，取植物聯(lián)合修復(fù)處理組植物地上部分樣品，以及各處理0 ～ 20 cm的土壤樣品。每個(gè)小區(qū)取3個(gè)重復(fù)樣，過(guò)2 mm 篩，一部分用于土壤基本養(yǎng)分測(cè)定，另一部分 -20℃ 冷凍，一周內(nèi)測(cè)定PLFA。植物樣品用蒸餾水洗凈70℃ 烘干至恒重，測(cè)定其生物量以及植株Cu、Cd的測(cè)定。

1.5 基本養(yǎng)分測(cè)定

土壤的基本理化性質(zhì)按照常規(guī)分析測(cè)試方法測(cè)定［9］。土壤pH按1∶2.5土水比，pH計(jì)測(cè)定；Cu、Cd全量前處理為HF-HClO4-HNO3消煮，之后采用原子吸收分光光度法（火焰和石墨爐）測(cè)定［10-11］；有效態(tài)Cu、Cd前處理為首先采用0.1 mol/L CaCl2以1∶5 的土水比振蕩提取2 h，3 000 r/min離心10 min，過(guò)濾后測(cè)定［9］。植物地上部分Cu、Cd含量測(cè)定：采用HNO3-HClO4消煮，原子吸收分光光度法測(cè)定。土壤有機(jī)質(zhì)：采用重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定［9］。

1.6 土壤的PLFA分析

土壤微生物 PLFA 提取主要參考 Bligh 和Dyer 等［12-13］的方法。稱取 2 g 土樣，置于50 ml 三角燒瓶中，加入 15 ml 氯仿∶甲醇∶檸檬酸鹽緩沖液（1∶2∶0.8，v/v/v），震蕩 2 h，3 800 r/min 離心 10 min；將上清液移入一干凈的 50 ml 試管中；再加入 7 ml氯仿∶甲醇∶檸檬酸鹽緩沖液（1∶2∶0.8，v/v/v），混勻，倒入離心管，渦旋，震蕩提取，離心 10 min，倒出上清液，即將兩次上清液合并；加入 3.6 ml 檸檬酸緩沖液和 4 ml 氯仿，振蕩，封口，暗處?kù)o置過(guò)夜；用長(zhǎng)滴管吸出下層液體至 10 ml 螺口管中，用氮?dú)獯蹈?-20℃ 保存。過(guò)硅膠柱：依次用正己烷、氯仿、丙酮、甲醇洗滌柱子。皂化：加入 1 ml NaOH：甲醇∶蒸餾水（1∶3.3∶3.3，m/v/v），渦旋振蕩，沸水浴 5 min，振蕩，再置于沸水浴中 25 min，退火。甲基化：加入 2 ml 鹽酸∶甲醇（1.2∶1，v/v），渦旋振蕩，于 80?C ± 1?C 水浴鍋加熱保溫 10 min ± 1 min，退火。萃?。杭尤?3 ml 正己烷∶甲基叔丁醚（1∶1，v/v），振蕩，吸取上層正己烷相于另一干凈試管。洗滌：加 3 ml NaOH 溶液（1∶83，m/v），上下?lián)u動(dòng) 5 min，吸取 2/3 上層溶液，轉(zhuǎn)入氣相色譜瓶 （GC 瓶，約 1 ml），加入 50 μl 內(nèi)標(biāo)，吹干。用 100 μl 的正己烷溶解 GC瓶中的待測(cè)樣品，轉(zhuǎn)移到內(nèi)插管中，測(cè)定。酯化 C19：0為內(nèi)標(biāo)，用 Agilent 7890 氣相（GC）色譜儀測(cè)定。色譜條件：色譜柱型號(hào)為安捷倫 19091B-102E Ultra 25% Phenyl Methyl Siloxane 25.0 m × 200 μm × 0.33 μm。進(jìn)樣量 2 μl，進(jìn)樣口溫度 250℃，載氣（氫氣）流量為30.0 ml/min。恒壓 21 psi，分流比 30∶1。程序升溫：190℃，0.00 min；10℃/min 升溫至 285℃，0.00 min；60℃/min 升溫至 310℃，2.00 min；190℃，2.00 min；火焰離子檢測(cè)器（FID）檢測(cè)。脂肪酸種類通過(guò)脂肪酸Sherlock 微生物鑒定系統(tǒng) （MIDIInc，Newark，DE，USA） 來(lái)鑒定。PLFAs 總量 （Total PLFA，PLFAT） 及單體脂肪酸的含量基于 19：0 內(nèi)標(biāo)計(jì)算，分析中僅包括碳鏈數(shù)低于 20、摩爾百分比含量大于 1%、且在多數(shù)樣品中都有出現(xiàn)的脂肪酸。細(xì)菌 （Bac） 以i13：0、i14：0、i15：0、a15：0、i16：0、i17：0、i18：0、i19：0、a16：0、a17：0、a19：0、13：1ω3c、16：1ω6c、16：1ω7c、17：1ω8c、18：1ω3c、18：1ω5c、18：1ω6c、18：1ω7c、cy17：0、cy19：0、19：1ω6c、20：1ω9c、21：1ω3c、21：1ω8c、22：1ω3c、22：1ω9c、24：1ω7c 等 28 種脂肪酸表示；真菌 （Fun） 用18：2ω6c、16：1ω5c 脂肪酸來(lái)表示；真菌∶細(xì)菌通過(guò) F/B 來(lái)計(jì)算；放線菌 （Act） 以10Me16：0、10Me17：0、10Me 18：0、10 Me18：1ω7c 表示；革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌 （G+） 用支鏈、飽和脂肪酸 i13：0、i14：0、i15：0、a15：0、i16：0、i17：0、i18：0、i19：0、a16：0、a17：0、a19：0 表示；革蘭氏陰性細(xì)菌 （G-） 用單不飽和脂肪酸和環(huán)式脂肪酸 13：1ω3c、16：1ω6c、16：1ω7c、17：1ω8c、18：1ω3c、18：1ω5c、18：1ω6c、18：1ω7c、cy17：0、cy19：0、19：1ω6c、20：1ω9c、21：1ω3c、21：1ω8c、 22：1ω3c、22：1ω9c、24：1ω7c 表示；革蘭氏陽(yáng)性與陰性細(xì)菌比通過(guò) G+/G－計(jì)算［14-15］。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Excel 2007、SigmaPlot 12.5 和SPSS17.0 進(jìn)行處理和分析。PLFA 數(shù)據(jù)采用 ArcGIS 10 和 VB 程序進(jìn)行整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物與羥基磷灰石聯(lián)合修復(fù)對(duì)土壤Cu、Cd含量的影響

如表 1 所示，植物與羥基磷灰石聯(lián)合修復(fù)對(duì)根際土壤中 Cu、Cd 含量及活性影響巨大。相比于CK，土壤施加磷灰石（MW 處理組），全 Cu 含量下降并不明顯，但當(dāng)與海州香薷、伴礦景天、巨菌草聯(lián)合修復(fù)時(shí)，根際土壤全 Cu 含量分別下降了 52.63、37.67 和 19.38 mg/kg。然而羥基磷灰石對(duì)土壤有效Cu 含量影響明顯：?jiǎn)我皇┘恿谆沂雇寥烙行?Cu含量降低了 54.27%，而 3 種植物和磷灰石聯(lián)合處理中土壤有效 Cu 含量降低了 70.9% ～ 73.04%。不同處理組中全 Cd 及有效 Cd 含量的變化趨勢(shì)類似于 Cu。羥基磷灰石的施加并不顯著改變土壤總 Cd含量，但明顯鈍化了有效 Cd：其活性 Cd 含量為對(duì)照的 65.49%。植物的聯(lián)合修復(fù)在降低根際總 Cd 的同時(shí)，也有效減少了有效 Cd 的含量。其中伴礦景天和巨菌草處理最為顯著，相比對(duì)照，其有效 Cd 含量為對(duì)照的 49.69% 和 51.76%。Raicevic等［16］證明羥基磷灰石強(qiáng)大的吸附及離子交換能力，促使土壤中大量活性 Cu 與 Cd 被吸附絡(luò)合，另外，崔紅標(biāo)等［17］的研究結(jié)果表示羥基磷灰石提高土壤溶液的 pH， 而pH 的升高為Cu、Cd 含量降低的重要驅(qū)動(dòng)因子，從而降低重金屬的污染風(fēng)險(xiǎn)，改良植物根系的生長(zhǎng)環(huán)境，同時(shí)由于不同修復(fù)植物在生長(zhǎng)過(guò)程中，通過(guò)根系吸收并向地上部分轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬離子，從而降低根系周?chē)亟饘俚暮浚?8］。而由于不同修復(fù)植物對(duì) Cu 與Cd 的吸收轉(zhuǎn)化能力不同，導(dǎo)致土壤不同形態(tài) Cu 與Cd 的含量存在差異。

表 1 不同聯(lián)合修復(fù)處理對(duì)土壤Cu、Cd含量影響Table 1 Effects of different combined remodiations on soil Cu and Cd

2.2 不同植物與微米羥基磷灰石聯(lián)合修復(fù)對(duì)植物的影響

如表 2 所示，不同植物單位地上部分分別對(duì)Cu 與 Cd 的吸收能力表現(xiàn)出了一致性，均為 MS＞ME＞MP＞MW。其中伴礦景天處理表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)；其單位地上部吸收的 Cu、Cd 含量分別是生長(zhǎng)雜草 MW 處理的 17.21 和 10.69 倍。伴礦景天作為多種重金屬的超積累植物，單位植物體內(nèi)重金屬含量明顯高于巨菌草非超積累植物和海州香薷［19］。相比較而言，巨菌草地上部分吸收 Cu 含量的能力分別為伴礦景天 （MS） 和海州香薷 （ME） 組的19.41%和 45.37%，吸收 Cd 含量的能力分別是伴礦景天（MS） 和海州香薷 （ME） 組的 9.73% 和 49.06%。但在 3 種植物處理中，巨菌草的生物量?jī)?yōu)勢(shì)顯著，分別比海州香薷和伴礦景天高出 16.03 mg/kg 和41.36 mg/kg。正是基于巨菌草生物量的提高，使其地上部分對(duì) Cu 總吸收量顯著高于 MS 處理組；對(duì)Cd 總吸收量與 MS 組持平。海州香薷地上部分對(duì)Cu、Cd 的吸收量低于伴礦景天，但也因其生物量的優(yōu)勢(shì)，使其地上部分對(duì) Cu、Cd 重金屬的總吸收量在 4 種不同處理中最大。盡管伴礦景天自身對(duì)重金屬的吸收能力強(qiáng)，但因其固有的缺陷：植株矮小、生物量低，給場(chǎng)地實(shí)際的修復(fù)技術(shù)帶來(lái)很大的限制［20］。海州香薷是土壤耐 Cu 指示性植物，其根系細(xì)胞壁中的果膠和纖維素是固定活性 Cu2+的主要組分［21］。姜理英等［22］發(fā)現(xiàn)香薷屬植物對(duì) Zn 也具有較好的積累作用。本研究中，基于羥基磷灰石的施加條件下，海州香薷還具有較好的吸收活性 Cd 的能力。巨菌草具有耐受土壤較高 Cu、Cd 含量的能力，且植株生物量高，因此其根系對(duì)土壤 Cu、Cd 的吸收效果明顯。研究發(fā)現(xiàn)，羥基磷灰石的添加降低了土壤活性重金屬含量，保障了植物的生長(zhǎng)；相對(duì)于 MW處理，植物與羥基磷灰石的聯(lián)合修復(fù)對(duì) Cu、Cd 的吸收效果顯著，而在探究不同聯(lián)合修復(fù)處理對(duì) Cu、Cd 的吸收效果時(shí)，植物吸收重金屬能力特性和植物生物量需要綜合考慮。

表 2 不同聯(lián)合修復(fù)處理對(duì)植物生物量和Cu、Cd含量Table 2 Effects of different combined remediations on biomass and contents of Cu and Cd of different plants

2.3 不同植物與羥基磷灰石聯(lián)合修復(fù)對(duì)土壤 pH影響

如圖 1A 所示，施加羥基磷灰石顯著提高土壤pH 至 5.19，此結(jié)果與 Cui 等［7］研究一致。羥基磷灰石原材料偏堿性（pH 為 7.71），加之其溶解作用可有效提高土壤 pH［6］。羥基磷灰石與植物聯(lián)合修復(fù)對(duì)土壤 pH 的提升程度更大，其中海州香薷 （ME） 處理下 pH 可達(dá)5.37，比 CK 處理的 pH 升高了 1個(gè)單位。植物與無(wú)機(jī)材料的聯(lián)合修復(fù)下土壤 pH 的改變是植物根系分泌物和無(wú)機(jī)材料交互作用的結(jié)果，盡管相比羥基磷灰石提高 pH 程度，不同植物的種植對(duì) pH 的提升空間較小，但其對(duì) pH 的影響是基于根系分泌物對(duì)根際環(huán)境的主動(dòng)改變。根系產(chǎn)生的弱有機(jī)酸離子、糖類、氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)離子（HC、OH-、H+）及活性酶在改變 pH 的同時(shí)，為根際微域提供了豐富的碳、氮類物質(zhì)［23］。這些化合物為改善土壤微生物群落提供了良好的能量物質(zhì)基礎(chǔ)。如圖1B 所示，相比海州香薷與伴礦景天，巨菌草根際土壤中總有機(jī)碳含量明顯升高，意味著植物根際土壤中有利于微生物代謝利用的養(yǎng)分供應(yīng)增加。

2.4 植物與羥基磷灰石聯(lián)合修復(fù)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

微生物群落是土壤生物活性的重要指標(biāo)，且易受環(huán)境因子影響，重金屬含量高低能夠改變微生物群落組成和豐度［24］。謝學(xué)輝等［24］曾采用 PCR-DGGE 方法研究污染土壤微生物多樣性的影響，但由于 PCRDGGE 僅對(duì)特定微生物的優(yōu)勢(shì)菌群檢測(cè)靈敏，因此在應(yīng)用上具有一定的局限性。磷脂脂肪酸（PLFA）是所有活細(xì)胞細(xì)胞膜的重要組成部分，而不同的微生物組群通過(guò)各異的生化途徑合成的 PLFA 也有所差異。此外，由于 PLFA 在有機(jī)體生物量中所占比例保持相對(duì)恒定，因此也作為了一個(gè)至關(guān)重要的生物標(biāo)記物。磷脂圖譜的變化通常與微生物組群豐度變化密切相關(guān)，且可以通過(guò)參考純培養(yǎng)學(xué)和已知生化合成途徑的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。磷脂脂肪酸（PLFA）技術(shù)在分析土壤微生物豐度和群落變化上應(yīng)用廣泛，大量的研究采用 PLFA 技術(shù)分析微生物群落組成對(duì)生物因子的響應(yīng)［25］，吳建軍等［26］就通過(guò) PLFA技術(shù)研究重金屬?gòu)?fù)合污染對(duì)水稻土微生物的生物量和群落組成變化。

為了進(jìn)一步探討 Cu、Cd 重金屬污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)不同植物與羥基磷灰石的聯(lián)合修復(fù)措施的響應(yīng)，本研究采用磷脂脂肪酸分析法（PLFA）對(duì)土壤細(xì)菌、真菌和放線菌進(jìn)行表征（表 3）。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，除了 ME 處理組，污染土壤中羥基磷灰石的施加可提高總 PLFA 的含量，其中 MW 和 MP 處理組最為顯著，這與閻姝等［27］研究污染土壤和未污染土壤 PLFA 總量變化結(jié)果類似。然而，MW 和 MP處理在微生物 PLFA 提高的組分上有著明顯的差異：巨菌草與羥基磷灰石（MP）的聯(lián)合修復(fù)明顯提高了土壤中革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌的 PLFA，而對(duì)真菌 PLFA 的作用甚微，因此表現(xiàn)在真菌/細(xì)菌（F/B）數(shù)值的明顯下降；而羥基磷灰石（MW）處理組主要提高了土壤中真菌群落 PLFA，因此即便其細(xì)菌PLFA 有一定的增加，但真菌/細(xì)菌（F/B）數(shù)值最高，是 MP 處理對(duì)應(yīng)數(shù)值的 2 倍。伴礦景天與羥基磷灰石（MS）及海州香薷與羥基磷灰石（ME）的聯(lián)合修復(fù)在一定程度上，也能促進(jìn)土壤中革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌群落的PLFA 量的提高，引起真菌/細(xì)菌（F/B）數(shù)值降低，但其效應(yīng)沒(méi)有巨菌草處理的作用明顯，Belén Hinojosa等［28］研究結(jié)果也表明污染土壤真菌細(xì)菌比值下降。土壤細(xì)菌與真菌的 PLFA 總量及細(xì)菌/真菌比值是衡量土壤微生物功能的重要指標(biāo)［29］。重金屬污染土壤單獨(dú)施加羥基磷灰石顯著提高土壤 pH，從而引起有效 Cu、Cd 含量的降低，然而這種無(wú)生物體系緩沖的土壤生境會(huì)導(dǎo)致土壤真菌化趨勢(shì)嚴(yán)重，不利于微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的形成（表 3）。植物與羥基磷灰石的聯(lián)合修復(fù)模式有效增加了土壤細(xì)菌群落的多樣性及生物量，緩解了土壤真菌化趨勢(shì)的發(fā)展。相較于海州香薷和伴礦景天，巨菌草植株高大，根系在土壤分布面積大，因此土壤根際效應(yīng)更為明顯，表現(xiàn)為細(xì)菌群落及生物量的提高。Pearson 相關(guān)系數(shù)顯示土壤總有機(jī)碳的含量與土壤細(xì)菌 PLFA 呈顯著相關(guān)（r = 0.714，P = 0.03），說(shuō)明植物的根系代謝分泌，具有富集土壤細(xì)菌微生物群落的潛力。

圖 1 不同聯(lián)合修復(fù)處理對(duì)植物根際土壤pH及有機(jī)碳含量的影響Fig. 1 Effects of different combined remediations on pH and total organic carbon of plant rhizosphere soil

表3 不同聯(lián)合修復(fù)處理對(duì)土壤微生物PLFA的影響Table3 Effects of different combined remediations on soil microbial PLFA

二維的典型對(duì)應(yīng)分析（CCA）更直接地顯示出不同處理組與微生物 PLFA 因子間的相互關(guān)系（圖 2A）。典型對(duì)應(yīng)的坐標(biāo)軸總共解釋了微生物群落 89.3%的變異。單一羥基磷灰石修復(fù)的微生物群落與植物和羥基磷灰石聯(lián)合修復(fù)的微生物群落，以及污染土壤（CK） 的微生物群落產(chǎn)生了明顯的區(qū)分。土壤細(xì)菌和真菌群落對(duì)重金屬污染敏感，與 CK 呈明顯的負(fù)相關(guān)。添加羥基磷灰石的修復(fù)措施與土壤真菌群落呈顯著正相關(guān)。植物與羥基磷灰石的聯(lián)合修復(fù)可改變土壤微生物群落，特別是巨菌草與羥基磷灰石的聯(lián)合修復(fù)方式，與土壤革蘭氏陽(yáng)性、陰性細(xì)菌呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明在羥基磷灰石修復(fù)基礎(chǔ)上巨菌草的種植可有效緩解土壤真菌化趨勢(shì)，而促進(jìn)細(xì)菌群落和生物量的提高，從而豐富土壤生態(tài)功能。ABT （Aggregated boosted tree） 聚類分析結(jié)果表明（圖 2B），不同的修復(fù)措施對(duì)土壤微生物群落的影響比例超過(guò) 50%，成為主導(dǎo)因子；其次為土壤 pH 及 Cu 的含量及活性，共同對(duì)土壤微生物群落影響解釋量達(dá) 33.13%，而土壤 Cd的含量及活性對(duì)微生物群落影響程度較小。作為能源植物，耐 Cu、Cd 的巨菌草因其地上地下部分巨大的生物量，其用于重金屬修復(fù)潛力越加受到關(guān)注［30］，本研究發(fā)現(xiàn)巨菌草對(duì)污染土壤微生態(tài)體系的恢復(fù)效果顯著。因此，篩選合適的植物例如巨菌草與羥基磷灰石聯(lián)合修復(fù)重金屬，更有利于土壤微生物多樣性的構(gòu)成。

圖2 典型對(duì)應(yīng)分析PLFA組分對(duì)不同修復(fù)措施的響應(yīng)（A）及環(huán)境因子對(duì)微生物PLFA的影響度（B）Fig. 2 CCA of PLFAs composition response to different remediations （A） and influence of environmental factors on microbe PLFAs （B）

3 結(jié)論

針對(duì)我國(guó)南方Cu、Cd等重金屬污染區(qū)域，土壤施加無(wú)機(jī)生物材料羥基磷灰石，可顯著提高土壤pH，并降低土壤活性Cu、活性Cd的含量。但無(wú)機(jī)材料對(duì)土壤化學(xué)特性的擾動(dòng)易導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的失衡，使得真菌生物量顯著提升。修復(fù)植物巨菌草和海州香薷分別與羥基磷灰石的聯(lián)合修復(fù)表現(xiàn)出較好的對(duì)重金屬的吸收效果：不僅可降低土壤Cu、Cd活性，并可通過(guò)植株地上部分的生長(zhǎng)吸收總Cu、Cd，以減少土壤Cu、Cd的積累。磷脂脂肪酸分析顯示，巨菌草與羥基磷灰石的聯(lián)合修復(fù)方式更有利于土壤微生物特別是細(xì)菌群落多樣性的形成和微生態(tài)體系的恢復(fù)。因此，選擇并推廣合適的環(huán)境友好型植物與無(wú)機(jī)生物材料進(jìn)行聯(lián)合修復(fù)，可視為改善重金屬污染地區(qū)土壤微生態(tài)環(huán)境的有效途徑。同時(shí)，該研究也還存在一定問(wèn)題需要繼續(xù)挖掘，由于本試驗(yàn)為種植一季結(jié)果，植物與羥基磷灰石的持續(xù)性Cu、Cd污染修復(fù)效果仍未可知，在今后的研究中，需要開(kāi)展長(zhǎng)期試驗(yàn)，研究不同植物與羥基磷灰石聯(lián)合修復(fù)對(duì)土壤Cu、Cd污染的長(zhǎng)期修復(fù)作用。

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Effects of Combined Remediation of Hydroxyapatite-Plants on Rhizosphere Microbial Community of Cu/Cd Contaminated Soil

SUN Tingting1，3， XU Lei1，3， ZHOU Jing1，2，4， FAN Jianbo1， CHEN Yan1，2*
（1 Institute of Soil Science， Chinese Academy of Sciences， Nanjing 210008， China； 2 Red Soil Ecological Experiment Station，Chinese Academy of Sciences， Yingtan， Jiangxi 335211， China； 3 University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049，China； 4 Institute of Biological Resources， Jiangxi Academy of Sciences， Nanchang 330096， China）

Via field experiments， the different effects of inorganic biological material hydroxyapatite and the combined remediations of three kind of plants （Elsholtzia Splendens， Pennisetum sp.， Sedum plumbizincicola） with hydroxyapatite on the absorption of soil total Cu and Cd， the passivation and absorptive ability for available Cu amd Cd derived from Cu and Cd contaminated soils in Guixi was compared. PLFA method was used to study the effects of different remediations on soil microbial community， aiming to assess the response of soil micro-ecological environment to various remediations. The results showed that the application of hydroxyapatite increased soil pH value significantly and passivate available Cu and Cd in soil， while had little influence on total Cu and Cd contents in soil. The combined remediations of plants and hydroxyapatite not only reduced soil available Cu and Cd significantly （P＜0.05）， but also decreased soil total Cu and Cd contents in plant rhizosphere （P＜0.05）， mainly due to plant tissues absorption and fixation for metals， particularly the aboveground fractions. The effects of different remediations were significantly different on the composition of soil microbial community， sole hydroxyapatite application was positively correlated with soil fungi community and increased soil fungi biomass， which increased fungi/bacteria ratio， while the combined remediation of plant and hydroxyapatite could alleviate the trend of soil fungi enrichment effectively， the combined remediation of Pennisetum sp. and hydroxyapatite increased the biomass and diversity of soil Gram positive and Gram negative bacteria and decreased F/B ratio， thus reduced the risk of soil fungi diseases. In addition， organic matter accumulation caused by different plants root metabolism significantly improved rhizosphere organic C of the combined remediation treatments. ABT analysis indicated that different remediations were most important influential factor on soil microbial community， other factors included soil pH value， the content and availability of Cu. The above results explained the combined remediation of plant and hydroxyapatite on soil micro-ecosystem from the perspective of microbial community composition， thus can provide reliable theory bases for the screening and conducting of combined remediation of plant and inorganic biological materials in Cu and Cd contaminated regions.

Cu； Cd； Pennisetum sp.； Elsholtzia Splendens； Sedum plumbizincicola； Hydroxyapatite； Microbial community

X53

10.13758/j.cnki.tr.2016.05.016

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41471237）和中國(guó)科學(xué)院STS項(xiàng)目（KFJ-EW-STS-016）資助。

*通訊作者（chenyan@issas.ac.cn）

孫婷婷（1990—），女，安徽安慶人，碩士研究生，主要從事土壤微生物生態(tài)學(xué)研究。E-mail： ttsun@issas.ac.cn