苜蓿植株及根際土壤中主要酚酸和香豆素物質(zhì)含量測(cè)定①

榮思川，師尚禮*，孫燦燦

（1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，蘭州 730070；2 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心，蘭州 730070）

苜蓿植株及根際土壤中主要酚酸和香豆素物質(zhì)含量測(cè)定①

榮思川1，2，師尚禮1，2*，孫燦燦1

（1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，蘭州 730070；2 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心，蘭州 730070）

通過(guò)高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定不同試驗(yàn)地間18個(gè)苜蓿（Medicago sativa L.）品種植株及根際土壤中主要酚酸和香豆素物質(zhì)的含量，分析其在不同品種苜蓿植株中的分布特征及不同試驗(yàn)地間差異。經(jīng)過(guò)ASE 350型加速溶劑萃取儀萃取苜蓿植株及根際土壤中酚酸類和香豆素物質(zhì)，萃取液存放于2oC冰箱，并用0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后通過(guò)HPLC測(cè)定自毒物質(zhì)含量。結(jié)果顯示，18個(gè)苜蓿品種中香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸的含量存在差異，其中香豆素、綠原酸含量顯著高于阿魏酸、咖啡酸含量。各苜蓿品種間單一自毒物質(zhì)含量差異顯著（P＜0.05），香豆素、阿魏酸、綠原酸和咖啡酸的總含量差異明顯。武威試驗(yàn)地酚酸和香豆素物質(zhì)平均含量比會(huì)寧試驗(yàn)地低4.01%。研究表明：不同苜蓿品種間香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸物質(zhì)總含量差異顯著；苜蓿植株中香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸物質(zhì)總含量與根際土壤中含量差異極顯著。

加速溶劑萃取法；HPLC；紫花苜蓿；香豆素；酚酸

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）在種植4年以上會(huì)出現(xiàn)田間密度下降幅度較大、草地生產(chǎn)力也急劇下降的現(xiàn)象，并且補(bǔ)種和修復(fù)也鮮有成功［1-3］。研究證實(shí)，造成這種現(xiàn)象的主要原因是苜蓿自毒性作用［4-6］。苜蓿自毒性是一種特殊的種內(nèi)化感作用，即一個(gè)種的苜蓿植株產(chǎn)生的某些次生代謝物通過(guò)揮發(fā)、淋溶和分泌等方式對(duì)周圍苜蓿植株產(chǎn)生有益或有害的影響［7-8］。通常這些物質(zhì)會(huì)從莖、葉、根部和種子等器官釋放到周圍環(huán)境中來(lái)影響幼苗的根系統(tǒng)，主要表現(xiàn)為抑制幼苗胚軸細(xì)胞伸長(zhǎng)和胚根生長(zhǎng)、幼苗根系統(tǒng)中某些酶的活性，進(jìn)而抑制了苜蓿根部對(duì)水分的吸收［9-11］。許多研究發(fā)現(xiàn)，自毒物質(zhì)并不是某單一物質(zhì)，而是多種物質(zhì)的混合物，且自毒效應(yīng)是多種物質(zhì)的綜合作用［12］。自紫花苜蓿中三十烷醇對(duì)其他作物具有刺激作用的文章發(fā)表后，關(guān)于苜蓿自毒物質(zhì)的相關(guān)研究便在各學(xué)術(shù)雜志上陸續(xù)報(bào)道。Wyman-Simpson 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿中普遍存在苜蓿酸大豆皂苷B（soyasapogenol glycoside B），且隨著濃度的增大，其化感抑制作用越強(qiáng)。Birkett等［14］認(rèn)為苜蓿皂苷（medicagenic acid glycosides）是苜?；凶饔玫闹饕镔|(zhì)。但Miller［15］認(rèn)為苜蓿皂苷并不是苜蓿自毒物質(zhì)，對(duì)苜蓿自身不能造成傷害。而后Miller［16］采用外源添加試驗(yàn)的方法驗(yàn)證了苜蓿素（medicarpin）和異黃酮類（isoflavonoid）對(duì)苜蓿種子發(fā)芽的毒害作用，使發(fā)芽率降低至41%。Abdul-Rahman和Habib［17］研究發(fā)現(xiàn)苜蓿植株可以釋放綠原酸（chlorogenic acid）、阿魏酸（ferulic acid）、對(duì)羥基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）、咖啡酸（caffeic acid）等酚酸類物質(zhì)。Hall和Henderlong［12］、李占玉等［18］也有關(guān)于酚酸類物質(zhì)自毒性的研究報(bào)道。Chung等［19］研究苜蓿植株浸提液中酚酸含量及化感效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)綠原酸與苜蓿自毒性密切相關(guān)，且自毒效應(yīng)與浸提液濃度呈正相關(guān)。隨著研究的深入，越來(lái)越多的自毒物質(zhì)被研究者發(fā)現(xiàn)并證明了其自毒性，如Miersch和Jiihlke［20］研究發(fā)現(xiàn)苜蓿刀豆氨酸也具有自毒效應(yīng)，含量高于1% 時(shí)，其自毒效應(yīng)較強(qiáng)；低于某濃度時(shí)，反而有促進(jìn)作用。盧成等［21］、李志華等［22］利用液相色譜方法測(cè)定苜蓿中酚酸類、香豆酸、香豆素等自毒物質(zhì)的含量，測(cè)定結(jié)果顯示香豆素、咖啡酸的含量較高。卜偉等［23］、唐玲麗等［24］利用高效液相色譜法測(cè)定土壤中有機(jī)物質(zhì)含量。近年來(lái)國(guó)內(nèi)雖有報(bào)道關(guān)于檢測(cè)苜蓿植株中自毒物質(zhì)含量的研究，但總體上對(duì)于苜蓿自毒物質(zhì)含量測(cè)定方法方面的研究仍然十分稀少，因此本研究是在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)不同品種苜蓿植株、根際土壤中自毒物質(zhì)含量的測(cè)定，對(duì)于更深入地了解苜蓿自毒效應(yīng)和苜蓿連作障礙提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣地概況

試驗(yàn)材料采樣地分別位于甘肅省武威市黃羊鎮(zhèn)（37°55′N，102°40′E，海拔1 530 m，氣候類型屬于溫帶干旱荒漠氣候，年平均溫度7.2℃，年降水量150 mm左右，年蒸發(fā)量約2 010 mm，無(wú)霜期154 天，土壤類型為灌淤土，具備灌溉條件）和甘肅省會(huì)寧縣（35°72′N，105°08′E，平均海拔2 025 m，年均降水量332.6 mm，年均氣溫7.9℃，年均無(wú)霜期155 天，屬于中溫帶半干旱氣候，土壤類型為灰鈣土，很少具備灌溉條件）。

于2011年4月10日播種，試驗(yàn)小區(qū)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)小區(qū)面積5 m × 3 m，每個(gè)品種4次重復(fù)，小區(qū)間隔0.5 m。采用條播方式，行距0.4 m，小區(qū)間走道1 m，試驗(yàn)地周邊1.5 m保護(hù)行。

1.2 材料與試劑

供試材料編號(hào)A ～ F是取自甘肅省會(huì)寧縣樣地，G ～ R是取自甘肅省武威市黃羊鎮(zhèn)樣地。苜蓿材料品種及來(lái)源見表 1。試驗(yàn)中用到的主要試劑：阿魏酸（純度≥99.0%），咖啡酸（純度≥98.0%），綠原酸（純度≥95.0%），香豆素（純度≥99.0%），均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；甲醇（色譜純），德國(guó)CNW Technologies 有限公司；乙酸（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

表1 供試材料及其來(lái)源Table1 Tested materials and their sources

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理 浸提液提取材料（苜蓿植株及根際土壤）在2015年5月20日即在苜蓿第一茬分枝期（4年齡苜蓿）時(shí)刈割采集樣本，自封袋收集帶回實(shí)驗(yàn)室。采集的苜蓿植株，先晾曬48 h，然后37℃條件下烘干，粉碎機(jī)粉碎后收集，2℃ 儲(chǔ)存?zhèn)溆?；根際土壤采用抖落法［25-26］收集，采用自然風(fēng)干的方法風(fēng)干后，過(guò)直徑2 mm篩子，存放于2℃冰箱中。天平準(zhǔn)確稱取18個(gè)苜蓿品種的植株（5.00 g）和根際土壤（20.00 g）樣放于萃取池（內(nèi)口徑2.7 cm × 5.2 cm）中，放于ASE 350型加速溶劑萃取儀中萃取。首先對(duì)樣品的萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇的萃取溶劑為80% 甲醇，萃取爐的溫度調(diào)整為50℃，熱平衡時(shí)間和靜態(tài)萃取時(shí)間均為5 min，溶劑流速為2.5 ml/min，氮?dú)獯祾邥r(shí)間為120 s，循環(huán)2次，最終萃取液總體積為30.0 ml。萃取液保存在2℃冰箱備用，測(cè)定前過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸4種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品各10.00 mg 于100.00 ml 容量瓶中，分別用50% 甲醇（色譜級(jí)）溶解并定容至刻度，配制成 100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品母液，存放于棕色試劑瓶中，-20℃ 保存?zhèn)溆?。上液相色譜儀前，用甲醇溶液采用逐級(jí)稀釋法將標(biāo)準(zhǔn)品母液配制成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液（2、5、10、20、40和80 mg/L）。

1.4 儀器與設(shè)備

Thermo Fisher ASE 350型加速溶劑萃取儀，美國(guó)Thermo Scientific 公司；Agilent 1260 Infinity HPLC液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；ELGA超純水儀ULTRA，英國(guó)ELGA公司；SCALTEC電子天平（SBC 22，當(dāng)量0.01 mg），德國(guó)SCALTEC公司；Spectrum SP-756P型分光光度計(jì)，美國(guó)RGB Spectrum公司；0.45 μm有機(jī)相針式濾器，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.5 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18分析柱（4.6 mm × 150 mm，3.0 μm）；流動(dòng)相：0.3%乙酸水溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脫，洗脫程序見表2；流速：0.50 ml/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量為10.0 μl；波長(zhǎng)掃描范圍 190 ～ 400 nm，定量檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。

表2 流動(dòng)相配比與洗脫時(shí)間Table2 Gradient phase and elution time

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

ASE 350型加速溶劑萃取儀制得苜蓿植株浸提液和根際土壤浸提液，0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后用HPLC儀，采用表 2 中的方法定量檢測(cè)18個(gè)苜蓿品種植株及根際土壤中4種自毒物質(zhì)（香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸）的含量。通過(guò)上述方法和條件測(cè)得 4種自毒物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（圖1）。

2.2 苜蓿植株中自毒物質(zhì)含量分析

苜蓿植物中自毒物質(zhì)高效液相色譜見圖2。圖中顯示，4種自毒物質(zhì)（綠原酸、咖啡酸、阿魏酸和香豆素）能夠完全分離，說(shuō)明1.5中色譜條件能夠達(dá)到分離、測(cè)定這4種自毒物質(zhì)的目的，且4種物質(zhì)定量檢測(cè)形成的色譜峰峰型良好，沒有干擾峰。

由表 3 可知，經(jīng)過(guò)HPLC定量測(cè)定并與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照后，18個(gè)苜蓿品種植株中4種自毒物質(zhì)（香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸）的含量存在差異。其中4種自毒物質(zhì)總含量最高的品種是H，總含量最低的品種為K，18個(gè)品種平均總含量為462.61 mg/kg，其中K品種4種自毒物質(zhì)總含量?jī)H為H品種的41.7%。其余單一自毒物質(zhì)含量差異性分析如下。HPLC測(cè)定18個(gè)苜蓿品種中香豆素含量最高的是O，含量最低的為Q，Q品種含量?jī)H為O品種的9.64%，18個(gè)品種平均含量為183.57 mg/kg，各苜蓿品種間香豆素含量差異均顯著（P＜0.05）。阿魏酸含量最高的品種是N，含量最低的品種為D，D品種含量?jī)H為N品種的15.98%，各品種平均含量為0.83 mg/kg，且各品種間阿魏酸含量差異僅有I和Q，E和F，C和D之間差異不顯著，其余品種間差異均顯著（P＜0.05）。對(duì)于綠原酸，含量最高的品種為D，含量最低的品種為K，K品種含量?jī)H為D品種的24.11%，18個(gè)品種平均含量273.36 mg/kg，各品種間綠原酸含量除了D和R，G、J和L，H和N，A和O，C和F，E、M和Q之間差異不顯著外，其余品種間含量差異均顯著（P＜0.05）?？Х人岷孔罡叩能俎Ｆ贩N為N，含量最低的為C品種，C品種含量?jī)H為N品種的2.66%，18個(gè)品種平均含量為4.45 mg/kg；且各品種間含量差異均顯著（P＜0.05）。

圖1 4種自毒物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液高效液相色譜圖（320 nm）Fig. 1 HPLC Chromatogram of the standards mixing solution containing 4 autotoxins at 320 nm

圖2 樣品液相色譜圖 （320 nm）Fig. 2 HPLC Chromatogram of a sample at 320 nm

表3 苜蓿植株中自毒物質(zhì)的含量Table3 Autotoxins contents in alfalfa plant

2.3 根際土壤中自毒物質(zhì)含量分析

由表 4 可知，18個(gè)苜蓿品種根際土壤中4種自毒物質(zhì)含量也存在差異。其中根際土壤中自毒物質(zhì)總含量最高的品種是A，而含量最低的為L(zhǎng)品種，18個(gè)品種平均總含量為12.33 mg/kg，其中L品種4種自毒物質(zhì)總含量?jī)H為A品種的33.3%。

表4 苜蓿根際土壤中自毒物質(zhì)含量Table4 Autotoxins contents in alfalfa rhizosphere soil

表4中還顯示，各種自毒物質(zhì)的含量差異顯著。如香豆素的含量，最高的為A品種，含量最低的為L(zhǎng)品種，L品種含量?jī)H為A品種的21.31%，18個(gè)品種平均含量為4.61 mg/kg，除了I和P品種，B和J品種，H和O品種，C、K、F和R，D和G品種含量差異不顯著外，其余品種之間含量差異均顯著（P＜0.05）。阿魏酸含量最高的品種為B，最低的為I品種，I品種含量?jī)H為B品種的6.17%，平均含量為0.59 mg/kg，除了C、E、H和Q，J和R，K、M和R，D和F，D和N，G和L，A和I品種差異不顯著外，其余品種之間差異均顯著（P＜0.05）。對(duì)于綠原酸，18個(gè)品種中含量最高的品種為A，含量最低的為G，G品種含量?jī)H為A品種的32.99%，平均含量為5.34 mg/kg，除了I和P，B、J和Q，H和O，E和H，E和M，D和G，L和N含量差異不顯著外，其余品種間含量差異均顯著（P＜0.05）?？Х人岷孔罡叩臑镽，最低的為J，J品種含量?jī)H為R的42.91%，平均含量為1.79 mg/kg，其差異除了F和R，C和K，A、I和P，B和O，D、E、G、H、L、M和N不顯著外，其余品種間差異均顯著（P＜0.05）。

2.4 苜蓿植株與根際土壤中自毒物質(zhì)含量比較

由表3和表4可知，18個(gè)苜蓿品種植株中4種自毒物質(zhì)（香豆素、阿魏酸、綠原酸和咖啡酸）平均總含量為462.61 mg/kg，根際土壤中平均總含量為12.33 mg/kg，根際土壤中含量?jī)H為苜蓿植株中的2.67%。單一自毒物質(zhì)含量方面，18個(gè)苜蓿品種植株中香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸的平均含量分別為183.57、0.83、273.76和4.45 mg/kg，根際土壤中4種物質(zhì)平均含量分別為4.61、0.59、5.34和1.79 mg/kg，4種物質(zhì)在根際土壤中含量分別為苜蓿植株中含量的2.51%、71.08%、1.95% 和40.22%。上述數(shù)據(jù)顯示，苜蓿植株中自毒物質(zhì)總含量遠(yuǎn)高于根際土壤中含量，苜蓿植株中單一自毒物質(zhì)含量也顯著高于根際土壤中含量。

2.5 采樣地差異比較

對(duì)兩個(gè)采樣地之間比較發(fā)現(xiàn)，黃羊鎮(zhèn)采樣地苜蓿品種自毒物質(zhì)總含量的平均值為469.32 mg/kg，比會(huì)寧縣采樣地（平均值488.95 mg/kg）低了4.01%。各單一自毒物質(zhì)兩個(gè)樣地間比較，會(huì)寧樣地阿魏酸、咖啡酸、綠原酸和香豆素含量分別為1.13、4.90、289.52和180.81 mg/kg，黃羊鎮(zhèn)樣地4種物質(zhì)含量分別為0.78、4.22、265.88 和184.95 mg/kg，數(shù)據(jù)顯示會(huì)寧樣地阿魏酸、咖啡酸和綠原酸含量分別比威武樣地高30.97%、13.88% 和8.17%，而香豆素含量卻低2.29%。

2.6 18個(gè)苜蓿品種聚類分析

根據(jù)18個(gè)苜蓿品種間4種自毒物質(zhì)含量差異進(jìn)行Pearson聚類分析。由圖 3 知，以香豆素、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸及4種物質(zhì)總含量作為聚類變量，將18個(gè)苜蓿品種分成4 大類。由右向左第一個(gè)豎箭頭線處，將其分成4大類，第一類為Q，第二類為I和K，第三類為O，其余為第四類。第二個(gè)豎箭頭處，可將18個(gè)苜蓿品種進(jìn)一步分成7小類，即E、F、C、P、D、J、A、R、L、M為第一小類，B為第二小類，H為第三小類，G和N為第四小類，O為第五小類，I和K為第六小類，Q為第七小類。

圖3 18個(gè)苜蓿品種自毒物質(zhì)含量的聚類分析圖Fig. 3 The clustering analysis diagram of autotoxins in 18 alfalfa varieties

3 討論

對(duì)18個(gè)苜蓿品種分枝期的植株及根際土壤浸提液中4種自毒物質(zhì)（香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸）含量進(jìn)行HPLC檢測(cè)和分析后，發(fā)現(xiàn)不同品種間苜蓿植株和根際土壤中4種自毒物質(zhì)含量存在差異，即自毒物質(zhì)含量因品種不同而存在差異，這與多數(shù)研究結(jié)果一致［21-22，27-28］。通過(guò)聚類分析后，發(fā)現(xiàn)苜蓿品種間自毒物質(zhì)含量差異大小不一，可將自毒物質(zhì)含量相近或差異較小的品種歸為一類，方便直觀地表述自毒物質(zhì)分布特征在品種間的相似程度。

鄭潔等［29］利用超高液相色譜法同時(shí)測(cè)定柑橘中主要酚酸和類黃酮物質(zhì)的含量，建立了快速檢測(cè)柑橘中這些物質(zhì)的方法。張娜等［30］利用UPLC-MS法測(cè)稻米中酚酸化合物組分及含量，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出稻米中酚酸化合物含量，并對(duì)其他谷物中酚酸化合物含量測(cè)定及HPLC法檢測(cè)苜蓿植株及根際土壤中酚酸類及其他自毒物質(zhì)含量測(cè)定提供了參考。鄔彩霞等［31］研究黃花草木犀水浸提液中化感物質(zhì)的分離與鑒定，檢測(cè)到香豆素含量最高，且對(duì)黑麥草的抑制作用明顯，推測(cè)香豆素是黃花草木樨水提液中主要化感物質(zhì)，這也為本研究中4種自毒物質(zhì)的篩選提供了理論支持。周凱等［32］研究菊花不同部位及根際土壤水浸提液處理對(duì)光合作用的自毒效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)浸提液可抑制菊花葉片光合、呼吸速率，對(duì)葉片葉綠素含量也有抑制作用，尤其菊花地上部分水浸提液的抑制作用顯著，這也間接地說(shuō)明植株地上部分自毒物質(zhì)含量要高于地下部分，而根際土壤中的自毒物質(zhì)主要來(lái)源尚不清楚，這也是本研究想要探討的問(wèn)題。董曉寧等［33］研究多年生黑麥草的化感物質(zhì)（GC-MS鑒定）及其抑草潛力，發(fā)現(xiàn)與抑制作用關(guān)系密切的物質(zhì)主要為苯酚類和酸類物質(zhì)。張文明等［34］關(guān)于連作馬鈴薯根系分泌物成分及其自毒效應(yīng)的研究，表明棕櫚酸和鄰苯二甲酸二丁酯是馬鈴薯根系分泌的主要自毒物質(zhì)。胡遠(yuǎn)彬等［35］研究黃芪水浸提液化感作用，發(fā)現(xiàn)“低促高抑”的化感作用特點(diǎn)。肖靖秀等［36］研究間作小麥蠶豆不同生長(zhǎng)期根際有機(jī)酸和酚酸變化發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)期的有機(jī)酸和酚酸含量存在差異。以上研究可見自毒物質(zhì)種類繁多，不同種的植物其自毒物質(zhì)的種類及其含量均存在差異，而自毒物質(zhì)對(duì)于植物的影響也是多方面的，包括生理［32，34］、表型性狀［31，33］等。

本研究通過(guò)HPLC測(cè)定苜蓿植株及根際土壤中4種自毒物質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)苜蓿植株中總含量顯著高于根際土壤，以R品種為例，根際土壤中總含量?jī)H為植株總含量的2.1%。研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)部分品種單一自毒物質(zhì)在苜蓿植株中含量低于根際土壤。如阿魏酸，G品種植株中含量為0.56 mg/kg，而根際土壤中含量為0.74 mg/kg，可見根際土壤中自毒物質(zhì)含量不僅來(lái)源于苜蓿植株（葉和莖），還來(lái)源于根部，這與Staman等［37］、Sene等［38］、Seal等［39］的研究結(jié)論相一致。另外，4種自毒物質(zhì)的自毒性強(qiáng)弱比較，還需要采用外源添加試驗(yàn)來(lái)探討。

比較兩個(gè)采樣地自毒物質(zhì)平均含量（A ～ F品種取自甘肅省會(huì)寧縣樣地，G ～ R品種取自甘肅省武威市黃羊鎮(zhèn)樣地），發(fā)現(xiàn)會(huì)寧采樣地苜蓿中自毒物質(zhì)總含量平均值高于黃羊鎮(zhèn)樣地。除了香豆素外，其余單一自毒物質(zhì)含量會(huì)寧樣地均大于黃羊鎮(zhèn)樣地，比較兩個(gè)樣地自然條件、土壤類型和灌溉條件后，可能有以下原因：①會(huì)寧樣地不具備灌溉條件而黃羊鎮(zhèn)樣地具備，黃羊鎮(zhèn)樣地進(jìn)入土壤中的自毒物質(zhì)會(huì)因澆灌水的沖刷滲透作用將自毒物質(zhì)帶入地下深處，而采集的土樣多在地表層（0 ～ 20 cm），所以HPLC測(cè)定量較小；②會(huì)寧樣地土壤為灰鈣土，是一種弱淋溶干旱土，而黃羊鎮(zhèn)樣地為灌淤土且疏松多孔、淋溶系數(shù)大，因此通過(guò)淋溶的方式將自毒物質(zhì)轉(zhuǎn)移至土壤下層，因此黃羊鎮(zhèn)樣地HPLC測(cè)定量較小。

4 結(jié)論

18個(gè)苜蓿品種中4種自毒物質(zhì)（香豆素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸）含量存在顯著差異。4種自毒物質(zhì)在苜蓿植株中總含量遠(yuǎn)高于根際土壤，但部分品種根際土壤中某單一自毒物質(zhì)（如阿魏酸）含量高于植株中含量。

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Determination of Coumarins and Major Phenolic Acids in Plant and Rhizosphere Soil of Alfalfa （Medicago sativa L.）

RONG Sichuan1，2， SHI Shangli1，2*， SUN Cancan1
（1 College of Grassland Science， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China； 2 Key Laboratory of Ecosystem of Ministry of Education， Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province， Sino-US Center for Grazingland Ecosystem Sustainability， Lanzhou 730070， China）

To find out the distribution characteristics of major phenolic acids and coumarins in 18 alfalfa （Medicago sativa L.） varieties from different testing fields， the contents of these substances in plant and rhizosphere soil were determined by HPLC method. The coumarins and major phenolic acids in plant and rhizosphere soil were extracted using ASE 350 accelerated solvent extractor， and the extracts were stored at 2℃. After filtered through 0.45 μm organic filtration membrane， the autotoxins contents in the extracts were determined by HPLC. Results showed that the contents of coumarin， ferulic acid， chlorogenic acid and caffeic acid in 18 alfalfa varieties varied with plant varieties. Among these substances， the contents of coumarin and chlorogenic acid were dramatically higher than those of ferulic acid and caffeic acid. The differences of single autotoxin content among varieties were significant （P＜0.05）， and total contents of coumarin， ferulic acid， chlorogenic acid and caffeic acid varied with plant varieties as well. In addition， the average contents of phenolic acids and coumarins from Huining testing field were 4.01% higher than these from Wuwei testing field. In conclusion， the total contents of coumarin， ferulic acid， chlorogenic acid and caffeic acid were significantly different among various alfalfa varieties （P＜0.05）， and the total contents of these substances in alfalfa plant were remarkably different from those in rhizosphere soils.

Accelerated solvent extraction （ASE）； HPLC； Medicago sativa L.； Coumarins； Phenolic acids

S326

10.13758/j.cnki.tr.2016.05.014

國(guó)家現(xiàn)代牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARA-35）和全國(guó)牧草種質(zhì)資源保種項(xiàng)目（NB2130135）資助。

*通訊作者（shishl@gsau.edu.cn）

榮思川（1987— ），男，山東單縣人，碩士研究生，主要從事牧草種質(zhì)資源及育種研究。E-mail： rongsc100@126.com