西林火姜健康組培苗快繁體系的建立

黃皓　周生茂　尚小紅　郭元元　文俊麗　班美玲　王玲平　陶偉　車江旅　陳振東

西林火姜健康組培苗快繁體系的建立

黃皓周生茂尚小紅郭元元文俊麗班美玲王玲平陶偉車江旅陳振東

為了篩選出西林火姜健康組培苗快繁體系，以西林火姜的莖尖為組培材料，對(duì)其組培苗分化、增殖和生根同步培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選，并對(duì)組培苗進(jìn)行了病菌和病毒檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，適合西林火姜分化、增殖和生根一步成苗的培養(yǎng)基配方為MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；在組培苗后期壯苗時(shí)加入蔗糖、活性炭和多效唑的濃度分別以4%、0.10%和0.05%最佳；目前生產(chǎn)中對(duì)于常用的生姜健康組培苗還不能完全脫除病菌和脫毒，表明生姜健康組培苗快繁體系因生姜基因型而異，而且目前的脫病菌和脫毒技術(shù)還需改進(jìn)。

生姜（Zingiber officinale Roscoe）為姜科姜屬多年生草本宿根單子葉植物，富含揮發(fā)油和姜辣素等功能性有效成分，以地下肥大的肉質(zhì)根狀莖為食用器官，是典型的藥食兩用的經(jīng)濟(jì)作物，在我國中部、東南部和西南部各省廣泛種植［1，2］。我國生姜常年種植面積達(dá)63萬hm2，年產(chǎn)量已達(dá)1 000萬t，約占世界產(chǎn)量的45%，出口量居世界第一［3］。廣西是我國生姜的主要產(chǎn)區(qū)之一，據(jù)農(nóng)業(yè)部門統(tǒng)計(jì)，常年種植面積達(dá)5萬hm2，主要分布在桂西北的石山區(qū)和鄰近云貴高原的縣市區(qū)域，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶的主要收入來源。因此，生姜產(chǎn)業(yè)對(duì)于廣西乃至我國生姜種植戶增收和實(shí)現(xiàn)小康極為關(guān)鍵。

生姜依照姜塊大小和品質(zhì)優(yōu)劣可分為小姜型、中姜型和大姜型［4］，在廣西上述3種類型都有種植，其中小姜型種植面積最大，因?yàn)槠渌幨澈图庸ぜ嬗谩Ｒ驗(yàn)樯谖覈耘鄷r(shí)極少開花，即使開花，也常常無花粉，無法進(jìn)行雜交種生產(chǎn)，所以，長(zhǎng)期以來生產(chǎn)上主要靠塊根進(jìn)行無性繁殖，但無性繁殖會(huì)導(dǎo)致姜體積累大量的病菌和病毒［5］。其中，姜瘟病和花葉病毒病是生姜栽培中最主要的病害，一般產(chǎn)量損失可達(dá)20%～30%，重則50%～70%［5，6］，嚴(yán)重制約了生姜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

植物組培快繁技術(shù)快速發(fā)展，并成功應(yīng)用于生姜組培苗的脫菌、脫毒，其作用明顯，不僅提高了生姜的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且降低了姜種成本，獲得了較好的經(jīng)濟(jì)效益［7］。但是在生姜組培苗生產(chǎn)過程中，也存在許多因素制約了產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，比如組培分化繼代的時(shí)間過長(zhǎng)、后期移栽成活率不高、種塊生產(chǎn)成本過高等［8］。而且培養(yǎng)基還存在生姜基因型差異，比如先前利用萊蕪大肉姜組培苗生產(chǎn)所用培養(yǎng)基進(jìn)行西林火姜繼代，但未獲得理想的繼代系數(shù)。為了解決這些問題，許多研究者根據(jù)試材特性，篩選更適合組培苗生長(zhǎng)的配方，例如分化、增殖和生根一步成苗的配方；為提高后期移栽成活率，進(jìn)一步摸索更好的壯苗配方；為繼續(xù)壓低組培苗生產(chǎn)過程中的成本，利用木薯粉替代蔗糖［9］或使用液體培養(yǎng)基［10］，取得了很好的效果。

為了建立廣西地方生姜品種西林火姜健康組培苗快繁體系，生產(chǎn)更多脫菌脫毒的姜種，促進(jìn)西林火姜健康組培苗產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，以西林火姜為組培材料，開展了西林火姜分化、增殖和生根一步成苗和培育健壯組培苗的培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

西林火姜姜種由廣西西林匯浤工貿(mào)有限責(zé)任公司提供。西林火姜又名細(xì)肉姜、小黃姜，株高80 cm，分枝較多，姜球較小，個(gè)體勻稱，呈雙層排列，根、莖、皮、肉皆為淡黃色，嫩芽紫紅色，肉質(zhì)致密，辛辣味濃，是制作烤姜塊（片）的主要原料。

1.2試驗(yàn)方法

①分化、增殖和生根同步培養(yǎng)基的篩選a.培養(yǎng)基配制。為篩選出脫毒姜的分化、增殖和生根同步化培養(yǎng)基，首先，以MS培養(yǎng)基為組培的基本培養(yǎng)基，向MS中分別添加6-BA（以A表示，下同）、NAA（以B表示，下同）和IBA（以C表示，下同）3種激素，每種激素設(shè)4個(gè)濃度，然后，按正交設(shè)計(jì)表L16（43）確定組合處理數(shù)為 16個(gè)，除 1號(hào)處理為對(duì)照1外，另分別以僅加0.2 mg/L NAA（17號(hào)）、0.2 mg/L IBA（18號(hào)）和MS培養(yǎng)基（即無激素，19號(hào)）作為其他3個(gè)對(duì)照（表1）。

b.外植體培養(yǎng)與接種。西林火姜姜塊用50%多菌靈800倍液浸泡處理30 min后撈出晾干，置于催芽盒中，在25℃條件下恒溫催芽。當(dāng)姜芽長(zhǎng)到1～2 cm及時(shí)切下，先表面清洗，再用0.1%HgCl2溶液消毒并沖洗干凈，在解剖鏡下剝?nèi)〈笮?.2～0.5 mm的莖尖，接種于培養(yǎng)基上。

每個(gè)處理10瓶，每瓶 2個(gè)單芽，60 d后統(tǒng)計(jì)并計(jì)算每個(gè)處理的平均分化率、芽增殖倍數(shù)和生根率，以此確立西林火姜芽尖分化、增殖和生根同步培養(yǎng)基。

②病原檢測(cè)a.細(xì)菌檢測(cè)。在超凈工作臺(tái)上選取每瓶組培苗根部組織和附近瓊脂的混合樣本約0.5 g，用總土壤DNA提取試劑盒 （美國Mpbio公司）提取樣本總DNA。以提取的總DNA為模板，大腸桿菌活化菌株為陽性對(duì)照，用篩選出來的細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，并電泳檢測(cè)其條帶的大小，以判斷樣品是否含有細(xì)菌。

b.病毒檢測(cè)。利用ELISA試劑盒（購自上海裕平生物科技有限公司），對(duì)組培苗中的煙草花葉病毒進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)方法依照試劑盒說明進(jìn)行，根據(jù)酶聯(lián)板樣品的顯色情況，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中煙草花葉病毒（TMV）濃度。

③不同因素對(duì)組培苗后期壯苗的影響為培育壯苗，提高后期移栽的成活率，分別探討了蔗糖、活性炭和多效唑濃度3個(gè)因素對(duì)西林火姜組培苗生根后期生長(zhǎng)發(fā)育的影響。基本培養(yǎng)基為MS+ 4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，蔗糖濃度設(shè)0、4%、6%、8%4個(gè)梯度；活性炭濃度設(shè)0、0.05%、0.10%、0.20%4個(gè)梯度；多效唑濃度設(shè)0、0.5%、1.0%、1.5% 4個(gè)梯度。將通過檢測(cè)的健康組培苗的芽分別接到含有不同濃度蔗糖、活性炭和多效唑的培養(yǎng)基中，每個(gè)芽長(zhǎng)3 cm左右，每個(gè)處理20瓶，每瓶2個(gè)單芽，至第30天測(cè)定增殖數(shù)、株高、單株質(zhì)量、單株生根率、單株生根數(shù)和單株平均根長(zhǎng)等指標(biāo)。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用SSR法進(jìn)行方差分析。

表1　西林火姜分化、增殖和生根同步培養(yǎng)基激素篩選的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16（43）表

2　結(jié)果與分析

2.1不同濃度6-BA、NAA和IBA對(duì)西林火姜平均分化率的影響

從表2結(jié)果可知，在3種激素不同濃度組合的處理中，6-BA濃度為3、4、5 mg/L組合處理的平均分化率均較高，都達(dá)到60%以上，而含2 mg/L 6-BA組合處理的平均分化率低于50%，不含6-BA的對(duì)照17、18、19號(hào)處理的平均分化率更是低于10%。且方差分析顯示，6-BA濃度為3、4、5 mg/L的處理組合與濃度0、2 mg/L的組合處理差異顯著，后2個(gè)處理間差異也達(dá)顯著水平，說明培養(yǎng)基中添加6-BA顯著促進(jìn)姜芽分化；在6-BA濃度為3、4、5 mg/L的組合處理中，3、4 mg/L濃度組合處理的平均分化率普遍比5 mg/L的組合處理的高，處理5、6、9、11號(hào)的平均分化率超過70%，6號(hào)的最高，達(dá)75.05%，說明添加6-BA的濃度超過5 mg/L，組培西林火姜的分化率反而降低。當(dāng)6-BA濃度在一定范圍內(nèi)，盡管NAA和IBA濃度不同，組培西林火姜的分化率差異變化不大，其中，以0.1 mg/L NAA的分化率較高，而不同IBA濃度誘導(dǎo)的分化率間不存在顯著差異。說明3種激素中6-BA對(duì)西林火姜分化誘導(dǎo)作用最大，而NAA和IBA誘導(dǎo)作用較小，其中6號(hào)（A2B2C1）處理（MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）的誘導(dǎo)作用最優(yōu)。

2.2不同濃度6-BA、NAA和IBA對(duì)西林火姜平均芽增殖倍數(shù)的影響

表2結(jié)果顯示，在3種激素不同濃度組合處理中，6-BA濃度為0、2 mg/L的組合處理的芽增殖倍數(shù)均小于3（2號(hào)除外）；而6-BA濃度為3、4、5 mg/L的組合處理的芽增殖平均倍數(shù)都大于4，在其他條件相同時(shí)，4 mg/L 6-BA組合處理的芽增殖倍數(shù)偏高；各處理間方差分析結(jié)果顯示，3、4、5 mg/L組合處理的芽增殖倍數(shù)顯著高于0、2 mg/L的組合處理，說明在培養(yǎng)基中添加6-BA有利于西林火姜組培的芽增殖。在相同6-BA濃度處理下，11號(hào)（A3B2C1）有最高的芽增殖平均倍數(shù)。這些結(jié)果說明，與NAA和IBA相比，6-BA對(duì)西林火姜組培芽增殖平均倍數(shù)的促進(jìn)作用最大。

2.3不同濃度6-BA、NAA和IBA對(duì)西林火姜平均生根率的影響

從表2分析知道，除了1、19號(hào)組合處理外，其他組合處理的平均生根率均超過90%外；與對(duì)照19號(hào)相比，盡管1號(hào)處理與其促進(jìn)生根作用的差異不顯著，但是在培養(yǎng)基中添加NAA和IBA后，6-BA具有輔助促進(jìn)生根的作用。在相同6-BA濃度條件下，西林火姜組培的平均生根率隨著NAA濃度的增加而增加；在相同NAA濃度條件下，西林火姜組培的平均生根率也隨著6-BA濃度的增加而增加；在相同的IBA濃度下，低濃度的NAA表現(xiàn)出低的平均生根率，但高濃度的NAA并不表現(xiàn)出高的平均生根率；上述結(jié)果說明，在促進(jìn)西林火姜組培苗的生根作用上，NAA起主導(dǎo)作用，作用最大，6-BA與NAA起協(xié)調(diào)正向作用，而IBA的作用因濃度及其與不同濃度的6-BA和NAA組合而異。

綜合分析認(rèn)為，對(duì)西林火姜組培分化、增殖和生根影響最主要的因素為6-BA，其次是NAA，IBA雖然對(duì)后期生根有一定的影響，但作用的效果有抑有促，且不顯著，另外，IBA對(duì)前期分化和增殖都起抑制作用，因此，研究認(rèn)為西林火姜組培分化、增殖和生根同步培養(yǎng)基的適宜配方為 MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

表2　西林火姜分化、增殖和生根同步培養(yǎng)基中不同濃度激素組合處理的結(jié)果

2.4病原檢測(cè)

①細(xì)菌檢測(cè)圖1顯示，以提取的樣本總DNA為模板，用篩選出來的細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，陽性對(duì)照擴(kuò)增出大概1 500 bp左右的單一目的帶，空白對(duì)照（陰性對(duì)照）沒有條帶，部分樣品也出現(xiàn)目的帶，說明部分樣品可能帶有內(nèi)生菌。此檢測(cè)方法可以快速方便地檢測(cè)出組培苗是否含有細(xì)菌，達(dá)到快速篩選的目的。

②病毒檢測(cè)用ELISA試劑盒對(duì)組培苗中的煙草花葉病毒進(jìn)行檢測(cè)。目前檢測(cè)了部分組培苗煙草花葉病毒的含量，每1 g樣品超過閾值4 ng TMV的有5個(gè)，占全部送樣的30%左右，說明病毒脫毒率在70%左右。用莖尖培養(yǎng)出來的組培苗少部分還帶有病毒，可能和莖尖大小、操作方法等因素有關(guān)。

2.5不同因素對(duì)組培苗后期壯苗的影響

①蔗糖濃度對(duì)組培苗壯苗的影響從表3可以看出，經(jīng)過30 d培養(yǎng)后，隨著蔗糖濃度的升高，平均增殖數(shù)和平均株高呈逐漸降低的趨勢(shì)，這可能和較高濃度的蔗糖抑制芽的生長(zhǎng)速率有關(guān)，但是平均單株質(zhì)量、根長(zhǎng)、根粗和生根數(shù)卻先增加后減少，說明適當(dāng)濃度的蔗糖能夠促進(jìn)根的生長(zhǎng)。綜合來說，添加4%、6%蔗糖的培養(yǎng)基中組培苗的平均單株質(zhì)量、根長(zhǎng)、根粗和生根數(shù)比其他蔗糖濃度高，其中添加4%蔗糖的培養(yǎng)基中組培苗增殖數(shù)相對(duì)較高，組培苗比較粗壯，而且根系較發(fā)達(dá)，葉色濃綠，說明4%是培育健壯組培苗的最佳蔗糖濃度。

②活性炭濃度對(duì)組培苗壯苗的影響從表4可以看出，加了不同濃度活性炭的培養(yǎng)基的組培苗平均增殖數(shù)都低于基本培養(yǎng)基，這可能與活性炭吸附部分激素導(dǎo)致激素不夠有關(guān)。添加0.2%活性炭培養(yǎng)基的芽增殖數(shù)最低，但株高最高，較細(xì)弱。加了0.1%活性炭的培養(yǎng)基的平均根長(zhǎng)、根粗和生根數(shù)都最高，說明0.1%活性炭可以適當(dāng)促進(jìn)組培苗根的生長(zhǎng)，且苗粗壯、翠綠。

③多效唑濃度對(duì)組培苗壯苗的影響從表5可以看出，隨著多效唑濃度的升高，平均增殖數(shù)和株高呈逐漸降低的趨勢(shì)，可能和多效唑促進(jìn)側(cè)芽生長(zhǎng)從而降低生長(zhǎng)速率有關(guān)。平均單株質(zhì)量、根長(zhǎng)和根粗隨著多效唑濃度升高而增加，但平均生根數(shù)卻逐漸減少，說明較高濃度的多效唑促進(jìn)根增粗、增長(zhǎng)，但高濃度抑制根數(shù)的增多，也不利于根系的發(fā)育。添加0.05%多效唑培養(yǎng)基的組培苗相對(duì)較壯實(shí)，根系也較長(zhǎng)、較粗，但較脆且易斷，可能和多效唑促進(jìn)橫向增長(zhǎng)且纖維減少有關(guān)，還需要進(jìn)一步的研究。

圖2　西林火姜組培苗脫菌檢測(cè)示意

3　討論與結(jié)論

隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，生姜健康種苗得到很好的開發(fā)，脫菌、脫毒效果明顯，但是在組培培養(yǎng)基的利用上存在基因型的差異［5，11］。與韋坤華等［12］通過正交試驗(yàn)研究出萊蕪大姜的繁殖生根同步化培養(yǎng)基為MS+2.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+0.2～0.3 mg/L ABT相比，本研究利用西林火姜為試材，結(jié)果是 MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA更適合增殖和生根，而過高濃度的6-BA反而抑制分化且容易使芽產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象，且過高濃度NAA也不能顯著促進(jìn)根的生長(zhǎng)發(fā)育，反而會(huì)降低芽的增殖倍數(shù)。齊蘭等［14］以海南小黃姜的莖尖為外植體，摸索出適合外植體增殖和生根的培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，而Sathyagowri等［13］以本地生姜莖尖為材料，認(rèn)為適合繼代和生根的培養(yǎng)基為MS+5.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。研究結(jié)果的不一致可能和生姜基因型和培養(yǎng)方式不同等因素有關(guān)。

表3　不同濃度蔗糖處理30 d后對(duì)生姜組培苗增殖和生根的影響

表4　不同濃度活性炭處理30 d后對(duì)生姜組培苗增殖和生根的影響

表5　不同濃度多效唑處理30 d后對(duì)生姜組培苗增殖和生根的影響

組培苗后期壯苗的培養(yǎng)也是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，培養(yǎng)出健壯的組培苗不僅能大大提高煉苗和移栽成活率，還可進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。生姜組培主要用蔗糖作為碳源，不同時(shí)期需要的蔗糖濃度不一樣。隨著蔗糖濃度的增加，組培苗前期生長(zhǎng)受到明顯的抑制，部分表現(xiàn)出葉偏黃、生長(zhǎng)緩慢等現(xiàn)象，但后期逐漸變壯，塊根質(zhì)量、根長(zhǎng)和根數(shù)明顯增加［14］。本研究結(jié)果表明，以4 mg/L蔗糖濃度為宜，過高濃度的蔗糖會(huì)抑制組培苗生長(zhǎng)，因?yàn)榻M培苗難以承受過高的滲透壓，這與周遜等［15］和Abbas等［16］的研究結(jié)果一致?；钚蕴恳彩怯绊憠衙绲囊粋€(gè)因素，它能吸附有害物質(zhì)并提供暗環(huán)境促進(jìn)根部發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，加入0.05%活性炭的培養(yǎng)基培育的苗最健壯且根部發(fā)達(dá)，適宜后期煉苗移栽，張華峰［17］研究表明，組培苗生根培養(yǎng)基中加入活性炭最合適的濃度為0.03%，而郭英華［18］研究則認(rèn)為活性炭對(duì)根狀莖誘導(dǎo)沒有明顯作用，因?yàn)檫^高濃度的活性炭會(huì)吸附過多的激素造成激素不足。多效唑大多用于培養(yǎng)試管姜，陳傳紅等［19］和王志敏等［20］研究多效唑?qū)ιM培苗和試管姜形成的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，一定濃度范圍內(nèi)的多效唑有利于組培苗的生長(zhǎng)，并能提高組培苗的抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加了0.05%多效唑，組培苗更壯實(shí)，根系更粗，但相對(duì)不加多效唑的培養(yǎng)基，組培苗根數(shù)減少，根系也相對(duì)脆，不太利于后期的移栽，這些問題有待于進(jìn)一步的研究。綜合來看，本研究的結(jié)論是生姜健康組培苗快繁體系因生姜基因型而異，而且目前的脫病菌和脫毒技術(shù)還需改進(jìn)。

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10.3865/j.issn.1001-3547.2016.20.012

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科轉(zhuǎn)14125003-2-10）；廣西農(nóng)業(yè)重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目（NY2014004）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（農(nóng)成轉(zhuǎn)2015008）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)項(xiàng)目（2015YZ03）；物種資源保護(hù)費(fèi)項(xiàng)目（1120162130135252038）

黃皓，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，南寧，530007，

電話：0771-3247318，E-mail：804667483@qq.com

周生茂，通信作者，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，

E-mail：maomaozhou70@gxaas.net

尚小紅，郭元元，文俊麗，陳振東，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所

班美玲，廣西環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院

王玲平，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所

陶偉，車江旅，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院

2016-06-21