艱難梭菌毒素A/B、BD-PCR毒素基因及GDH檢測對艱難梭菌相關性腹瀉的診斷價值

邵 婧，丁 宸，徐萍萍

（徐州市中心醫(yī)院檢驗科，徐州221009）

艱難梭菌毒素A/B、BD-PCR毒素基因及GDH檢測對艱難梭菌相關性腹瀉的診斷價值

邵 婧，丁 宸，徐萍萍

（徐州市中心醫(yī)院檢驗科，徐州221009）

目的 探討艱難梭菌毒素A/B及其相關毒素基因檢測對艱難梭菌相關性腹瀉的診斷價值。方法 收集2015年1月至2015年10月我院ICU病房腹瀉疑似艱難梭菌感染患者的糞便標本133例作為研究對象，分別采用艱難梭菌培養(yǎng)法、CDAB法、PCR毒素基因檢測法及艱難梭菌毒素GDH檢測法進行檢測，以艱難梭菌培養(yǎng)法結果為金標準，計算各方法的診斷指標所包含有的特異度、敏感度、陰性預測值和陽性預測值等。結果 本研究收集的133例糞便標本中，經過金標準糞便樣本厭氧培養(yǎng)法檢出陽性結果20例，陰性結果113例。CDAB法具有低敏感度（0.550）和高特異度（0.912），診斷符合率為0.932，BD-PCR毒素基因檢測法具有高敏感度（0.950）和高特異度（0.929），診斷符合率為0.932，艱難梭菌毒素GDH檢測法的高敏感度（0.900）和低特異度（0.779），診斷符合率為0.797。結論 對于疑似艱難梭菌感染，可聯(lián)合艱難梭菌GDH、艱難梭菌毒素A/B（CDAB）或進行熒光定量PCR毒素基因共同檢測，有效降低檢測時間，為臨床醫(yī)師及時提供準確的診斷依據，并制定行之有效的治療措施。

艱難梭菌毒素A/B； 毒素基因； 靈敏度； 診斷價值

艱難梭菌是一種厭氧性細菌，是引起抗菌藥物相關腹瀉及假膜性結腸炎的主要原因［1］。近年來，在醫(yī)院引發(fā)的艱難梭菌感染逐漸被人重視，早期艱難梭菌相關性腹瀉快速準確的診斷對于有效預防及治療醫(yī)院微生物感染非常重要［2］。檢測艱難梭菌的金標準方法為細菌培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)毒素實驗，其檢測條件較為苛刻，需專業(yè)性厭氧培養(yǎng)箱和組織培養(yǎng)條件，且操作復雜，檢測周期長，難以在臨床推廣和普及［3］。為了探討艱難梭菌毒素A/B及其相關毒素基因檢測對艱難梭菌相關性腹瀉的診斷價值，本文以糞便樣本厭氧培養(yǎng)法為金標準，選取2015年1月至2015年10月我院ICU病房133例腹瀉患者的糞便標本，采用不用的檢測方法進行研究，現(xiàn)將結果報道如下。

材料和方法

1 標本來源

收集2015年1月至2015年10月我院ICU病房腹瀉疑似艱難梭菌感染患者的糞便標本133例，其中65歲以上56例，50至65歲之間患者43例，50歲以下患者34例。納入標準：患者在24h內出現(xiàn)3次或3次以上腹瀉；糞便性狀為稀便、糊狀便或水樣便；腹瀉前3個月內使用過抗生素。首先采集腹瀉患者的糞便作為檢測標本，并將標本置于干凈無防腐劑的無菌杯中，在2～8℃環(huán)境中保存，24 h內檢測。每例患者留取2份標本，一份進行厭氧培養(yǎng)，另一份進行艱難梭菌GDH、艱難梭菌毒素A/B（CDAB）、熒光定量PCR毒素基因檢測。

2 試劑和儀器

細菌培養(yǎng)所需的厭氧培養(yǎng)基、厭氧產氣劑、ANC鑒定卡以及細菌鑒定儀VITEK2等購買于法國生物梅里埃公司；采用酶聯(lián)熒光測定法（ELFA）檢測艱難梭菌毒素A/B（CDAB），CDAB檢測試劑盒及VIDAS分析儀均來自法國生物梅里埃公司；采用PCR法檢測CDAB毒素基因，檢測試劑盒購買于美國BD公司，PCR擴增儀型號為ABI 9700型（美國）。

3 方法

對所有標本進行編號，同時進行艱難梭菌毒素A/B（CDAB）檢測、艱難梭菌培養(yǎng)、艱難梭菌毒素GDH及PCR毒素基因檢測。

3.1艱難梭菌培養(yǎng) 挑取適量糞便標本于肉湯中充分震蕩混勻后接種于厭氧培養(yǎng)基和艱難梭菌選擇性培養(yǎng)基（CCFA），于35℃厭氧環(huán)境持續(xù)培養(yǎng)5d，每天都對菌落生長情況進行仔細觀察，根據艱難梭菌菌落形態(tài)以及革蘭染色鏡下典型形態(tài)進行鑒別，使用梅里埃ANC鑒定卡進行鑒定。

3.2艱難梭菌毒素A/B（CDAB）檢測 采用兩步夾心法與終點熒光檢測相結合的酶聯(lián)免疫熒光法技術（ELFA）。取均一化的糞便標本200μL于1000μL樣本稀釋液中充分混勻，離心時間設置為5min。每個CDAB SPR與CDAB試劑條對應每份質控品與標本。將300μL標本上清液加入標本孔中，于固相管（SPR）內外數次循環(huán)反應液，每步反應后開始對循環(huán)進行清洗有利于未結合成分的去除。在4個檢測步驟自動完成后，儀器自動分析結果。結果判讀：按照試劑盒說明書，檢測值＜0.3，為陰性結果；0.13～0.37，為可疑陽性；≥0.37，為陽性結果。

3.3BD-PCR毒素基因檢測［4］采用實時定量PCR儀（美國ABI 9700），BD Gene Ohm實時熒光定量PCR檢測試劑盒購買自美國BD公司。將較多的樣本蘸取于無菌干棉棒上，并懸于樣本緩沖液中進行充分混合，然后取10μL加入至裂解緩沖液中進行核酸的提取。將試劑混合物（包含內質特異性探針與毒素B基因）與裂解液（3μL）混合加入至專用的試管中，并使用PCR擴增儀完成DNA擴增，在每次擴增過程中，均包含陽性與陰性質控。對于擴增的DNA靶序列，分別使用針對性的分子信標進行標記。

3.4艱難梭菌毒素GDH檢測［5］艱難梭菌毒素GDH采用膠體金法檢測，檢測卡由德國Nadal公司提供。檢測前，先用稀釋液對糞便樣品進行稀釋，再加入4滴糞便稀釋液于檢測卡上，若樣本中含有GDH，檢測卡會顯示出紅色。

4 統(tǒng)計學處理

檢測結果用SPSS20.0軟件進行分析處理。以艱難梭菌培養(yǎng)法為判定艱難梭菌感染的金標準，計算各方法的特異度、敏感度、陰性預測值和陽性預測值等診斷指標。

結果

1 三種檢測方法與金標準檢測結果

本研究收集的133例糞便標本中，經過金標準糞便樣本厭氧培養(yǎng)法檢出陽性結果40例，陰性結果93例；CDAB檢測陽性樣品為21例，陰性樣品為112例；PCR方法檢測陽性樣品為27例，陰性樣品為106例（圖1）；GDH方法檢測陽性樣品為43例，陰性樣品為90例（圖2）。結果見表1。

表1　CDAB，PCR及GDH檢測與金標準檢測結果的比較

2 三種檢測方法結果診斷學指標

PCR毒素基因方法在敏感性、特異性方面顯著優(yōu)于CDAB和艱難梭菌毒素GDH（P＜0.001），在診斷符合率方面CDAB和PCR毒素基因均顯著優(yōu)于艱難梭菌毒素GDH（P＜0.05），結果見表2。

表2　三種檢測方法結果診斷學指標的比較

討論

臨床上抗生素相關腹瀉與艱難梭菌緊密相關，該細菌感染具有非特異性表現(xiàn)，病情較輕時僅為自限性腹瀉，嚴重情況下可出現(xiàn)中毒性巨結腸與偽膜性腸炎［6］。全球流行病學研究結果表明，艱難梭菌感染發(fā)病率、復發(fā)率、病死率（尤其在北美與歐洲）呈急劇上升趨勢［7］。另外，該疾病在社區(qū)也具有較高的發(fā)病率。然而，由于缺乏較好的診斷方法，使得目前艱難梭菌感染的診斷特異性差、敏感性低、周期長，且要求技術也較高［8］。

艱難梭菌是一種嚴格的專性厭氧菌，用實驗室常規(guī)的厭氧培養(yǎng)法非常困難。現(xiàn)有的檢測艱難梭菌的方法有、厭氧培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫法、PCR檢測及GDH檢測等。其中組織培養(yǎng)細胞毒素試驗和糞便標本厭氧培養(yǎng)是檢測艱難梭菌的金標準，但這兩種檢測方法花費時間長，經濟成本大，同時操作復雜，難以在臨床應用中推廣［9］。PCR檢測法具有較高的特異度與靈敏度，同時花費時間短，簡單易操作，唯一缺點是經濟成本較大。GDH檢測是近年來檢測艱難梭菌的一種新方法，其敏感度較高，操作快捷簡單。酶聯(lián)免疫檢測方法是目前比較成熟且應用較為廣泛的檢測方法，不僅操作簡潔，成本較低，可與GDH檢測聯(lián)合應用［10］。

本文133例腹瀉患者中有20例糞便標本檢出艱難梭菌，陽性率15.0%（20/133）。本文研究結果表明相比于金標準艱難梭菌培養(yǎng)法，酶免疫學法CDAB法雖然具有高特異度（0.912），具但敏感度（0.550）較低，因此酶免疫法不宜單獨用于臨床檢測艱難梭菌。艱難梭菌毒素GDH檢測法雖具有高敏感度（0.900），但特異度較低（0.779），可與酶免疫學法CDAB聯(lián)合使用。其中BD-PCR毒素基因檢測法效果最佳，具有高敏感度（0.950）和高特異度（0.929）。

綜上所述，疑似艱難梭菌相關性腹瀉患者在沒有培養(yǎng)出致病菌的情況下，可采用多個實驗技術相結合的方法，先檢測艱難梭菌GDH，用于細菌定植篩查GDH。再檢測艱難梭菌毒素A/B（CDAB）或進行熒光定量PCR毒素基因檢測，用于毒素確認診斷。以上方法可大大降低檢測時間，為臨床醫(yī)師及時提供準確的診斷依據，并制定行之有效的治療措施。同時能及時報告艱難梭菌院內爆發(fā)，促進感控措施，減輕患者痛苦，降低死亡率。

［1］嚴其容，李文革，許文榮，等.25株艱難梭菌多位點序列分型.臨床檢驗雜志，2012，30（3）：183-186.

［2］姜國俊，王學艷，張曼，等.腹瀉型腸易激綜合征患者食物特異性IgG抗體的檢測及意義.標記免疫分析與臨床，2008，15（6）：402-403.

［3］張春瑩，康梅，何超，等.艱難梭菌腹瀉及實驗室診斷.寄生蟲病與感染性疾病，2012，10（2）：68-72.

［4］周麗民，雷永良，王小光，等.實時熒光定量 PCR技術在致病菌檢測中的應用.標記免疫分析與臨床，2012，19（5）：296-299.

［5］劉元元，劉文恩，簡子娟，等.住院腹瀉患者艱難梭菌檢測與分析.中國感染控制雜志，2012，11（4）：293-296，299.

［6］吳微珍.艱難梭菌實驗室檢測方法的比較.浙江大學，2012：31-32.

［7］孫立穎，黃磊，嚴巖，等.酶聯(lián)熒光免疫分析技術檢測糞便中艱難梭菌毒素A/B.臨床檢驗雜志，2012，30（2）：95-97.

［8］楊雪妹，吳允孚.艱難梭菌的生物學特性與實驗室診斷.中國感染與化療雜志，2013，13（3）：232-234.

［9］Gallegos-Orozco J F，Paskvan-Gawryletz C D，Guradu S R，et al. Successful colonoscopic fecal transplant for severe acute clostridium difficile pseudomembranous colitis.Rev Gastroenterol Mex，2012，77（1）：40-42.

［10］唐海先，肖洪廣，楊玉靜，等.腹瀉患者艱難梭菌的檢測及分析.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2013，23（17）：3328-3231.

（潘子昂編輯）

Detection of Clostridium Botulinum Toxin A/B，BD-PCR Toxin Gene and GDH in the Diagnosis of Clostridium Botulinum Associated Diarrhea

SHAO Jing，DING Chen，XU Ping-ping
（Department of Clinical Laboratory，Central Hospital of Xuzhou，Xuzhou 221009，China）

Objective To study the diagnostic value of Clostridium Botulinum toxin A/B and its associated toxin gene in the diagnosis of Clostridium Botulinum associated diarrhea.Methods A total of 133 patients with diarrhea stool specimens suspected having Clostridium difficile infection were selected as the research objects.Clostridium difficile culture method for stool specimens，Clostridium difficile toxin A/B（CDAB），PCR toxin gene detection，and Clostridium difficile toxin GDH detection were used for the study.We took Clostridium difficile culture as a gold standard and calculated sensitivity，specificity，positive/negative predictive value for each method.Results Out of 133 cases stool specimens，20 cases were positive for Clostridium difficile infection，113 cases were negative based on the gold standard of stool samples anaerobic culture.The CDAB method had low sensitivity（0.550）and high specificity（0.912），the diagnostic accordance rate was 0.932.BD-PCR toxin gene detection method had high sensitivity（0.950）and high specificity（0.929），the diagnostic accordance rate was 0.932.Clostridium difficile toxin GDH detection method had high-sensitivity sense（0.900）and low specificity（0.779），diagnostic coincidence rate was 0.797.Conclusion Clostridium difficile GDH can be combined with Clostridium difficile toxin A/B（CDAB）or PCR toxin gene detection for suspected Clostridium difficile infection.It can effectively reduce the detection time，provide accurate diagnosis for clinicians in order to develop effective treatment measures.

Clostridium botulinum toxin A/B； Toxin Gene； Sensitivity； Diagnostic value

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.09.013

2016-03-27；

2016-04-14

徐萍萍。