多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分布及耐藥性觀察

錢超

[摘要] 目的 探討多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分布及耐藥性情況。 方法 收集2014年1月～2015年4月長(zhǎng)興縣中醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室248例患者銅綠假單胞菌臨床標(biāo)本，采用培養(yǎng)鑒定和藥敏試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果 分離銅綠假單胞菌210株，其中，多重耐藥菌60株，多重耐藥菌檢出率為28.6%。60株多重耐藥銅綠假單胞菌主要分布在痰液（40株，66.7%），其次為傷口分泌物（11株，18.3%）、尿液（9株，15.0%）。耐藥情況分析結(jié)果顯示，頭孢他啶（41.7%）、頭孢吡肟（38.3%）、哌拉西林（48.3%）、替卡西林（58.3%）、哌拉西林/他唑巴坦（58.3%）、替卡西林/克拉維酸（58.3%）、氨芐西林/舒巴坦（100.0%），耐藥率均較高；氨曲南（33.3%）、亞胺培南（30.0%）、美羅培南（30.0%）、慶大霉素（40.0%）、阿米卡星（26.7%）、環(huán)丙沙星（33.3%）、左氧氟沙星（33.3%），耐藥率均較低。檢出10株泛耐藥菌株，檢出率為16.7%，通過補(bǔ)充藥敏實(shí)驗(yàn)，6株（60.0%）對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦耐藥，對(duì)于多黏菌素B無耐藥發(fā)生。結(jié)論 對(duì)于多重耐藥銅綠假單胞菌可以采用青霉烯類、喹諾酮類聯(lián)合用藥治療，對(duì)于泛耐藥菌株可以應(yīng)用多黏菌素B進(jìn)行治療。

[關(guān)鍵詞] 多重耐藥銅綠假單胞菌；臨床分布；耐藥性

[中圖分類號(hào)] R378.991 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）02（a）-0121-04

Clinical distribution of multiple drug resistant pseudomonas aeruginosa and its drug resistance observation

QIAN Chao

Department of Laboratory， Hospital of Traditional Chinese Medicine of Changxing County， Zhejiang Province， Changxing 313100， China

[Abstract] Objective To discuss the clinical distribution of multiple drug resistant pseudomonas aeruginosa and its drug resistance. Methods Clinical specimens of pseudomonas aeruginosa from 248 patients in ICU of Hospital of Traditional Chinese Medicine of Changxing County from January 2014 to April 2015 were selected， which were detected by culture identification and drug sensitive test. Results There were 210 plants of pseudomonas aeruginosa separated， 60 plants had multiple drug resistance， the detection rate was 28.6%. 60 plants of multiple drug resistant pseudomonas aeruginosa mainly distributed in sputum （40 cases， 66.7%）， following by wound secretion （11 cases， 18.3%）， urine （9 cases， 15.0%）. Drug resistance results analysis showed that the drug resistance rates of Ceftazidime （41.7%）， Cefepime （38.3%）， Piperacillin （48.3%）， Ticarcillin （58.3%）， Piperacillin/Tazobactam （58.3%）， Ticarcillin/Clavulanic Acid （58.3%）， Ampicillin/Sulbactam （100.0%） were higher； the drug resistance rates of Aztreonam （33.3%）， Imipenem （30.0%）， Meropenem （30.0%）， Gentamicin （40.0%）， Amikacin （26.7%）， Ciprofloxacin （33.3%）， Levofloxacin （33.3%） were lower. There were 10 plants of generic drug resistant strains， the detection rate was 16.7%； through complementary medicine sensitive experiment， there were 6 plants （60.0%） had drug resistance to Cefoperazone/Sulbactam， there was no drug resistance to Polymyxin B. Conclusion The penicillium alkene， quinolones combination therapy can be used for multiple drug resistant pseudomonas aeruginosa treatment， generic drug resistant strains should be given Polymyxin B treatment.

[Key words] Multiple drug resistant pseudomonas aeruginosa； Clinical distribution； Drug resistance

銅綠假單胞菌是引起院內(nèi)感染的條件致病菌，同時(shí)也是革蘭陰性桿菌的一種，其氧化酶陽性[1-2]。在患者機(jī)體免疫功能低下的情況下，銅綠假單胞菌可能造成呼吸道、皮膚、血液和泌尿系統(tǒng)等一系列的感染發(fā)生[3]。近年來隨著抗生素在臨床廣泛應(yīng)用，抗生素可能對(duì)于銅綠假單胞菌有一定的誘導(dǎo)作用，造成銅綠假單胞菌耐藥性增高，出現(xiàn)多重耐藥銅綠假單胞菌發(fā)生率明顯增高現(xiàn)象，促使患者的病情進(jìn)一步發(fā)展和惡化，影響預(yù)后治療效果，死亡率明顯增加，嚴(yán)重影響臨床治療效果。本研究通過對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分布及耐藥性情況進(jìn)行分析，為指導(dǎo)臨床合理用藥提供可靠的理論參數(shù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年1月～2015年4月浙江省長(zhǎng)興縣中醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室248例患者銅綠假單胞菌臨床標(biāo)本作為觀察對(duì)象，來源為痰液、尿液、分泌物等，同一例患者在同一取材部位進(jìn)行多次檢測(cè)。

1.2 細(xì)菌的培養(yǎng)鑒定和藥敏試驗(yàn)

痰液標(biāo)本采集前，通過清洗咽喉可以排除正常菌群攜帶污染的可能，采用無菌性操作吸痰，菌落計(jì)數(shù)>1×104 cfu/mL具有診斷意義。尿液標(biāo)本采集采用中段尿，通過無菌尿杯盛放，菌落計(jì)數(shù)>1×104 cfu/mL具有診斷意義。

通過DL-96細(xì)菌檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)。細(xì)菌的培養(yǎng)和分離參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第3版）中的要求進(jìn)行[4]。參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2011年版標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定。銅綠假單胞菌株ATCC27853來自于衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心?？咕幬锛埰饕衼啺放嗄?、頭孢他啶、阿米卡星、頭孢吡肟、哌拉西林、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨曲南、美羅培南、慶大霉素、替卡西林、多黏菌素B、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦。

1.3 觀察指標(biāo)

①多重耐藥銅綠假單胞菌來源。②多重耐藥銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)情況，主要包括對(duì)頭孢類、青霉素類、β內(nèi)酰胺酶/β內(nèi)酰胺酶抑制劑、單環(huán)內(nèi)酰胺類、青霉烯類、氨基糖苷類、喹諾酮類的耐藥情況。③觀察泛耐藥銅綠假單胞菌補(bǔ)充藥敏試驗(yàn)情況，補(bǔ)充藥物為頭孢哌酮/舒巴坦和多黏菌素B。

2 結(jié)果

2.1 多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分布情況

248例患者中分離銅綠假單胞菌210株，其中，多重耐藥菌60株，檢出率為28.6%；60株多重耐藥銅綠假單胞菌主要分布在痰液，其次為傷口分泌物、尿液。見表1。

表1 多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分布情況

2.2 多重耐藥銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)情況

多重耐藥銅綠假單胞菌對(duì)氨芐西林/舒巴坦耐藥率最高，為100.0%；其次為替卡西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林，均為58.3%；再次為哌拉西林、頭孢他啶、慶大霉素、頭孢吡肟、氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、美羅培南、亞胺培南及阿米卡星。見表2。

表2 60株多重耐藥銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)情況

2.3 泛耐藥銅綠假單胞菌補(bǔ)充藥敏實(shí)驗(yàn)情況

60株多重耐藥銅綠假單胞菌中檢出10株泛耐藥菌株，檢出率為16.7%，通過補(bǔ)充藥敏實(shí)驗(yàn)，6株（60.0%）對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦耐藥，對(duì)于多黏菌素B無耐藥發(fā)生。

3 討論

銅綠假單胞菌是自然界中常見的致病菌，其存在于正常人體的皮膚、腸道和呼吸道，多見于因感染造成的機(jī)體免疫功能低下和機(jī)體免疫缺陷患者，屬于醫(yī)源性病原菌[5-6]。銅綠假單胞菌可誘發(fā)菌血癥、肺炎、泌尿系統(tǒng)感染等疾病，其在醫(yī)院內(nèi)感染的率達(dá)30%左右，其中呼吸道感染率最高[7-8]。本研究標(biāo)本采集自重癥監(jiān)護(hù)室，重癥監(jiān)護(hù)患者均需要建立人工氣道、機(jī)械通氣，會(huì)對(duì)患者呼吸系統(tǒng)天然屏障造成損傷，細(xì)菌在氣管插管的表面聚集，從而形成生物膜，防止其受到抗生素和宿主自身防御系統(tǒng)的攻擊，造成呼吸道銅綠假單胞菌感染和多重耐藥性增高。重癥監(jiān)護(hù)室患者在治療過程中，嚴(yán)格把握好有創(chuàng)操作的無菌制度，在一定程度上可以降低因創(chuàng)傷性操作和治療造成的感染，但是盲目應(yīng)用多種抗生素，也可能造成多重耐藥銅綠假單胞菌的出現(xiàn)。近年來銅綠假單胞菌治療無效率明顯增高，主要由于銅綠假單胞菌產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致，如果患者出現(xiàn)多重耐藥情況，會(huì)造成治療難度明顯增加。

銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，主要包括以下幾項(xiàng)：DNA拓樸異構(gòu)酶突變、主動(dòng)外排系統(tǒng)、產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶及氨基糖苷修飾酶等。長(zhǎng)期以來對(duì)于銅綠假單胞菌耐藥性的研究較多，但是關(guān)于多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分布及耐藥性的研究卻相對(duì)較少。本研究通過觀察多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分布及對(duì)不同種類抗生素的耐藥率，擬為臨床合理應(yīng)用抗生素提供可靠的理論依據(jù)。

本研究共分離銅綠假單胞菌210株，其中，多重耐藥菌60株，檢出率為28.6%，與以往研究結(jié)果基本一致[9-10]。60株多重耐藥銅綠假單胞菌主要分布在痰液，其次為傷口分泌物、尿液，說明其來源于呼吸系統(tǒng)的比例較高，原因主要是本研究標(biāo)本多來自重癥監(jiān)護(hù)室患者，氣管切開比例較高，氣管插管屬于有創(chuàng)性的操作，加上長(zhǎng)期大量應(yīng)用抗生素和激素治療，很容易促使患者發(fā)生菌群失調(diào)，出現(xiàn)多重耐藥銅綠假單胞菌感染。

本研究藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多重耐藥銅綠假單胞菌對(duì)頭孢類（頭孢他啶、頭孢吡肟）、青霉素類（哌拉西林）、β內(nèi)酰胺酶/β內(nèi)酰胺酶抑制劑（替卡西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦）耐藥率均較高，頭孢他啶耐藥率為41.7%，頭孢吡肟為38.3%，哌拉西林為48.3%，替卡西林為58.3%，哌拉西林/他唑巴坦為58.3%，替卡西林/克拉維酸為58.3%，氨芐西林/舒巴坦為100.0%。其原因主要與銅綠假單胞菌耐藥性形成的機(jī)制有關(guān)：①銅綠假單胞菌編碼喹諾酮類藥物作用靶位的DNA旋轉(zhuǎn)酶和Ⅳ類拓樸異構(gòu)酶基因發(fā)生突變，酶的結(jié)構(gòu)受到影響，促使喹諾酮類藥物不能和酶-DNA復(fù)合物牢固結(jié)合，發(fā)生逃避抗菌藥物現(xiàn)象，即出現(xiàn)耐藥[11-12]。②膜屏障和主動(dòng)外排，為藥物到達(dá)作用靶位時(shí)，銅綠假單胞菌對(duì)各類抗生素形成天然性多重耐藥或獲得多重耐藥性的一種機(jī)制[13-14]。有資料顯示，在銅綠假單胞菌中，發(fā)現(xiàn)4類主動(dòng)外排系統(tǒng)，主要是MexAB-OprM、MesCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM[15-16]。其中，MexAB-OprM是促使野生型銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要因素之一。而MesCD-OprJ、MexEF-OprN只有在過度表達(dá)時(shí)，才會(huì)發(fā)生獲得性多重耐藥[17-18]。③銅綠假單胞菌可以形成一種細(xì)菌生物膜，具有比較強(qiáng)的耐藥性和抵抗免疫系統(tǒng)能力，促使銅綠假單胞菌獲得耐藥性[19-20]。

本研究中多重耐藥銅綠假單胞菌對(duì)單環(huán)內(nèi)酰胺類（氨曲南）、青霉烯類（亞胺培南、美羅培南）、氨基糖苷類（慶大霉素、阿米卡星）、喹諾酮類（環(huán)丙沙星、左氧氟沙星）耐藥率相對(duì)較低，氨曲南耐藥率為33.3%，亞胺培南為30.0%，美羅培南為30.0%，慶大霉素為40.0%，阿米卡星為26.7%，環(huán)丙沙星為33.3%，左氧氟沙星為33.3%。多重耐藥銅綠假單胞菌可能通過以下方式增加耐藥的發(fā)生：①促使產(chǎn)生抗菌活性酶，比如增加了β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷純化酶、金屬酶類等，典型代表是氨基糖苷類慶大霉素、阿米卡星等。②改變抗生素作用的靶位，比如促使青霉素結(jié)合蛋白和DNA旋轉(zhuǎn)酶的基本結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而造成抗生素抗菌無效。③降低外膜通透性，促進(jìn)膜微孔蛋白編碼基因發(fā)生缺失，造成基因編碼的膜通道蛋白丟失，阻止亞胺培南等一類藥物進(jìn)入菌體，降低了抗菌藥物作用效果，造成特異性的耐藥。④增強(qiáng)了主動(dòng)泵出系統(tǒng)表達(dá)程度，造成糖蛋白構(gòu)成改變，形成了黏附性較高的生物膜，逃避抗生素的殺傷作用。因此，對(duì)于多重耐藥銅綠假單胞菌最好采用聯(lián)合用藥的方式進(jìn)行治療，主要是頭孢類、青霉烯類、β內(nèi)酰胺酶/β內(nèi)酰胺酶抑制劑聯(lián)合氨基糖苷類。

本研究還發(fā)現(xiàn)10株泛耐藥菌株，檢出率為16.7%，通過補(bǔ)充藥敏實(shí)驗(yàn)，有6株（60%）對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦耐藥，對(duì)于多黏菌素B無耐藥發(fā)生，此結(jié)果和以往研究結(jié)果類似[21-22]。多黏菌素B是多肽類抗生素的一種，其表面有活性較強(qiáng)、帶有陽性電荷的游離氰基，可以和革蘭陰性桿菌細(xì)胞磷脂內(nèi)帶陰性電荷的磷酸根結(jié)合，擴(kuò)大細(xì)菌細(xì)胞膜面積，增加膜的通透性，形成磷酸鹽、核苷酸等成分，從而造成細(xì)菌的死亡，起到抗菌的效果。多黏菌素B在細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖期、靜止期效果更加明顯。

綜上所述，臨床上為了更好地提高抗感染治療效果，需要加強(qiáng)多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分布和耐藥性情況的掌握，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，有針對(duì)性地、合理性地選擇抗生素進(jìn)行治療。對(duì)于多重耐藥銅綠假單胞菌的出現(xiàn)，應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)院的衛(wèi)生環(huán)境和無菌操作，切斷傳播途徑，避免多重耐藥銅綠假單胞菌交叉性感染，降低醫(yī)院感染的發(fā)生率。對(duì)于已經(jīng)出現(xiàn)的多重耐藥銅綠假單胞菌可以采用青霉烯類聯(lián)合喹諾酮類治療，對(duì)于泛耐藥菌株可以應(yīng)用多黏菌素B進(jìn)行治療。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 張傳飛.多重耐藥銅綠假單胞菌產(chǎn)ESBLs酶與高產(chǎn)AmpC酶情況及藥物敏感性研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2015，27（1）：76-79.

[2] Uwate M，Ichise YK，Shirai A，et al. Two routes of MexS-MexT-mediated regulation of MexEF-OprN and MexAB-OprM efflux pump expression in pseudomonas aeruginosa [J]. Microbiol Immunol，2013，57（4）：263-272.

[3] 王娟，王前，蘭海麗，等.多重耐藥銅綠假單胞菌氨基糖苷類修飾酶基因的檢測(cè)及分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（3）：266-268.

[4] 葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜.全國(guó)臨床經(jīng)驗(yàn)操作過程[M].3版.南京：東南大學(xué)出版社，2006：736-753.

[5] 鄧芳，張健，張世勇，等.多重耐藥銅綠假單胞菌感染的危險(xiǎn)因素及耐藥性分析[J].重慶醫(yī)學(xué)，2013，42（35）：4304-4306.

[6] Yoneyama H，Akiba K，Hori H，et al. Tat pathway-mediated translocation of the sec pathway substrate protein Mex A，an inner membrane component of the MexAB-OprM xenobiotic extrusion pump in pseudomonas aeruginosa [J]. Antimicrob Agents Chemother，2010，54（4）：1492-1497.

[7] 朱荔清，邱廣斌.多重耐藥銅綠假單胞菌的臨床分布特征及耐藥性分析[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志：電子版，2015，9（6）：352-354.

[8] Drusano GL，Liu W，F(xiàn)regeau C，et al. Differing effects of combination chemotherapy with meropenem and tobramycin on cell kill and suppression of resistance of wild-type Pseudomonas aeruginosa PA01 and its isogenic MexAB efflux pump-overexpressed mutant [J]. Antimicrob Agents Chemother，2009，53（6）：2266-2273.

[9] 孫建芝，封建凱，李杰，等.醫(yī)院感染多重耐藥性銅綠假單胞菌耐藥性分析及預(yù)防對(duì)策[J].中華實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2013， 17（8）：1391-1393.

[10] Farra A，Islam S，Stralfors A，et al. Role of outer membrane protein OprD and penicillin binding proteins in resistance of pseudomonas aeruginosa to imipenem and meropenem [J]. Int J Antimicrob Agents，2008，31（5）：427-433.

[11] 蘇美玲.ICU多重耐藥銅綠假單胞菌外排泵基因表達(dá)分子流行趨勢(shì)及其危險(xiǎn)因素[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015，25（5）：702-704.

[12] Suarez C，Pena C，Tubau F，et al. Clinical impact of imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa bloodstream infections [J]. J infect，2009，58（4）：285-290.

[13] 吳國(guó)營(yíng)，楊洪江，林書祥，等.銅綠假單胞菌主要 RND外排泵表達(dá)與β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性的相關(guān)性研究[J].臨床兒科雜志，2013，31（5）：459-464.

[14] Boo TW，Walsh F，Crowley B. First report of OXA-23 carbapenemase in clinical isolates of Acinetobacter species in the Irish Republic [J]. J Antimicrob Chemother，2006， 58（2）：1101-1102.

[15] 厲世笑，周鵬，朱珊珊，等.丹參酮聯(lián)合頭孢他啶、哌拉西林鈉他唑巴坦對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌的體外抗菌作用的研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015，25（7）：1096-1098.

[16] Turon JF，Woodford N，Glover J，et al.Identifi cation of Acinetobacter baumannii by detection of the carbapenemase gene intrinsic to this species [J]. J Clin Microbiol， 2006，44（8）：2974-2976.

[17] 張金川，董全紅，潘濤.重癥監(jiān)護(hù)室多重耐藥銅綠假單胞菌耐藥基因分型探究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，10（20）：2735-2736.

[18] Woodford N，Ellington MJ，Coelho JM，et al. Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp [J]. Int J Antimicrob Agents，2006， 27（4）：351-353.

[19] 彭詠麟，楊良勇，劉立君.重癥監(jiān)護(hù)室多重耐藥銅綠假單胞菌產(chǎn)OXA酶基因的研究[J].中國(guó)抗生素雜志，2013， 38（10）：791-794.

[20] 吳朝陽，黃婷，譚穗茹.多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分布及耐藥性分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，35（23）：3222-3223.

[21] Buyck JM，Guenard S，Plesiat P，et al. Role of MexAB-OprM in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa to temocillin and impact on the susceptibility of strains isolated from patients suffering from cystic fibrosis [J]. J Antimicrob Chemother，2012，67（3）：771-775.

[22] Landman D，Bratu S，Alam M，et al. City emergence of pseudom onas aerugnos a strains with reduced susceptibility to polymyxin B [J]. J Antimierob Chemother，2005， 55（6）：954.

（收稿日期：2015-11-02 本文編輯：程 銘）