芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響

陳寧

[摘要] 目的 研究芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響。 方法 將實驗用大鼠120只隨機分為正常對照組、模型組、芹菜素（20、40、80 mg/kg）預(yù)處理組和辛伐他汀（1.8 mg/kg）預(yù)處理組。除正常對照組外，其余各組大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)加注射VD3的方法制備大鼠早期動脈粥樣硬化模型，造模過程中芹菜素預(yù)處理組和辛伐他汀預(yù)處理組每天灌胃給藥1次，而正常對照組和模型組以等量生理鹽水灌胃。12周后，測定各組大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）的活性和丙二醛（MDA）、一氧化氮合酶（NOS）、活性氧簇（ROS）的含量以及血漿中炎癥細(xì)胞因子[C反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）]的水平，通過HE染色觀察主動脈形態(tài)學(xué)變化并進行主動脈病變分級。 結(jié)果 與模型組比較，芹菜素40、80 mg/kg預(yù)處理組大鼠血清中SOD、CAT活性顯著升高（P < 0.05或P < 0.01），MDA、NOS、ROS含量顯著降低（P < 0.05或P < 0.01），芹菜素80 mg/kg預(yù)處理組GSH-Px活性顯著升高（P < 0.01）；芹菜素40、80 mg/kg預(yù)處理組血漿中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著降低（P < 0.05或P < 0.01），且芹菜素80 mg/kg預(yù)處理組IL-10水平顯著升高（P < 0.01）。主動脈病理性形態(tài)學(xué)變化顯著改善，主動脈病變分級顯著降低，以芹菜素80 mg/kg預(yù)處理組效果最為顯著（P < 0.01）。 結(jié)論 芹菜素具有抑制動脈粥樣硬化大鼠氧化應(yīng)激損傷和炎性反應(yīng)的作用。

[關(guān)鍵詞] 芹菜素；動脈粥樣硬化；氧化應(yīng)激；炎性反應(yīng)

[中圖分類號] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（a）-0025-04

Effect of apigenin on oxidative stress and inflammatory response in rats with atherosclerosis

CHEN Ning

Department of Emergency， Handan Central Hospital， Hebei Province， Handan 056001， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of apigenin on oxidative stress and inflammatory response in rats with atherosclerosis. Methods One hundred and twenty experimental rats were randomly divided into six groups： normal control group， model group， apigenin （20， 40， 80 mg/kg） pretreatment group and Simvastatin （1.8 mg/kg） pretreatment group. Except the rats in normal control group， the rats of the other groups were taken the method of feeding with high fat and injecting VD3 so as to make the model of rats with early atherosclerosis. During the experiment， the apigenin pretreatment group and Simvastatin pretreatment group were given drugs by intragastric administration， once a day， while the rats in the normal control group and model group were given equal volumed normal saline by intragastric administration. Twelve weeks later， the activity of superoxide dismutase （SOD）， glutathion peroxidase （GSH-Px）， catalase （CAT） and the contents of malondialdehyde （MDA）， nitric oxide synthase （NOS）， reactive oxygen species （ROS） and the levels of inflammatory cytokines [C-reactive protein （CRP）， tumour necrosis factor α （TNF-α）， interleukin 1β （IL-1β）， interleukin 6 （IL-6）， interleukin 10 （IL-10）] in serum were determined； the morphological changes of aorta was observed by HE staining and aortic lesions were graded. Results Compared with model group， the activity of SOD， CAT in serum of apigenin 40， 80 mg/kg pretreatment group was significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）， the contents of MDA， NOS， ROS in serum were significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the activity of GSH-Px in serum of apigenin 80 mg/kg pretreatment group was significantly increased （P < 0.01）； the levels of CRP， TNF-α， IL-1β， IL-6 in plasma of apigenin 40， 80 mg/kg pretreatment group were all significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the level of IL-10 in apigenin 80 mg/kg pretreatment group was significantly increased （P < 0.01）； the histopathological changes were significantly improved， and the aortic lesions were significantly decreased， especially in apigenin 80 mg/kg pretreatment group （P < 0.01）. Conclusion Apigenin has inhibiting effects on oxidative stress damage and inflammatory response in atherosclerosis rats.

[Key words] Apigenin； Atherosclerosis； Oxidative stress； Inflammatory response

動脈粥樣硬化（arteriosclerosis）的發(fā)生與多種因素有關(guān)[1-3]，病理機制復(fù)雜，隨著近年來研究的深入，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷和炎性反應(yīng)是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的核心機制[4-5]。王爽等[6]和沈建飛等[7]通過動脈粥樣硬化大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，通過藥物抑制氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)能夠有效改善動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。芹菜素（apigenin）是天然存在的一種黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜和水果中，具有明顯的抗氧化作用，可消除自由基，保護細(xì)胞膜[8]；此外，芹菜素還具有抗炎、抗凋亡等多種藥理學(xué)作用[9-10]。本實驗通過建立動脈粥樣硬化大鼠模型，研究芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

芹菜素（陜西慧科植物開發(fā)有限公司，批號：140217，純度≥98%）；辛伐他汀片（山東方明藥業(yè)股份有限公司，批號：H21023726）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、一氧化氮合酶（NOS）、活性氧簇（ROS）檢測指標(biāo)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；C反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）試劑盒和蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒均購自北京博奧森科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠，180～220 g，6周齡，購自河北省實驗動物中心，動物合格證號：20140524，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～25℃，相對濕度65%～70%，光照周期12 h∶12 h。

1.3 儀器

UV762型紫外-可見分光光度計（上海楚定分析儀器有限公司）；倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；離心機（德國eppendorf公司）；WD-2102A型全自動酶標(biāo)儀（北京六一生物科技有限公司）；RM-2135型石蠟切片機（德國Leica公司）。

1.4 方法

1.4.1 動物模型制備[11]與分組 將120只實驗用SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組、芹菜素（20、40、80 mg/kg）預(yù)處理組和辛伐他?。?.8 mg/kg）預(yù)處理組，每組20只。正常對照組給予正常飼料喂養(yǎng)，其余各組大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)加注射VD3的方法制備大鼠早期動脈粥樣硬化（動脈粥樣硬化）模型；造模開始后，各治療組分別每天灌胃給藥1次，而正常對照組和模型組以等量生理鹽水灌胃，共12周。

1.4.2 血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定 經(jīng)腹腔注射烏拉坦實施麻醉，開腹經(jīng)腹主動脈取血，經(jīng)2000 r/min離心（離心半徑4.9 cm），10 min后取血清，按照試劑盒操作方法步驟，通過紫外-可見分光光度計平行測定各組大鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT的活性和MDA、NOS、ROS的含量。

1.4.3 血漿中炎癥細(xì)胞因子含量的測定 取“1.4.2”所制備的血清，按照酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒操作步驟，通過酶標(biāo)儀測定各組大鼠血漿中炎癥細(xì)胞因子CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量。

1.4.4 病理組織學(xué)觀察及主動脈病變分級 經(jīng)“1.4.2”取血完成后，剝離全長主動脈，置于4%多聚甲醛液中進行固定，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（厚度約5 μm）、展片處理后，行常規(guī)HE染色，然后于光鏡下觀察主動脈病變，并參照王偉等[12]研究報道進行分級評分。分級標(biāo)準(zhǔn)：0級：結(jié)構(gòu)正常；1級：內(nèi)膜有少量泡沫細(xì)胞積聚，無明顯的凸起斑塊；2級：內(nèi)膜可見大量泡沫細(xì)胞積聚，有明顯的粥樣斑塊，部分斑塊融合成片；3級：內(nèi)膜表面幾乎全被粥樣斑塊覆蓋，斑塊內(nèi)可見組織壞死、鈣化，斑塊底部肌層萎縮變薄。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用軟件SPSS 15.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，等級資料比較采用秩和檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性均顯著降低（P < 0.01）；而芹菜素40、80 mg/kg預(yù)處理組大鼠血清中SOD、CAT活性較模型組顯著升高（P < 0.05或P < 0.01），且芹菜素80 mg/kg預(yù)處理組GSH-Px活性顯著升高（P < 0.05）。見表1。

表1 芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠血清中SOD、GSH-Px、

CAT活性的影響（U/mL，x±s，n = 20）

注：與正常對照組比較，*P < 0.01；與模型組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；SOD：超氧化物歧化酶；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶；CAT：過氧化氫酶；“-”表示無數(shù)據(jù)

2.2 芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠血清中MDA、NOS、ROS含量的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中MDA、NOS、ROS含量均顯著升高（P < 0.01）；芹菜素40、80 mg/kg預(yù)處理組大鼠血清中MDA、NOS、ROS含量均較模型組顯著降低（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

表2 芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠血清中MDA、NOS、ROS含量的影響（x±s，n = 20）

注：與正常對照組比較，*P < 0.01；與模型組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；MDA：丙二醛；NOS：一氧化氮合酶；ROS：活性氧簇；“-”表示無數(shù)據(jù)

2.3 芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠血漿中炎癥細(xì)胞因子含量的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血漿中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著升高且IL-10含量顯著降低（P < 0.01）；與模型組比較，芹菜素40、80 mg/kg預(yù)處理組大鼠血漿中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著降低（P < 0.05或P < 0.01），且芹菜素80 mg/kg預(yù)處理組IL-10含量顯著升高（P < 0.01）。見表3。

2.4 芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠主動脈形態(tài)學(xué)變化及主動脈病變分級的影響

經(jīng)HE染色并通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組大鼠主動脈形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常：內(nèi)皮完整，平滑肌細(xì)胞呈長梭形，胞核無碎片，未見空泡變性和膠原纖維增生；而模型組大鼠主動脈呈明顯病變：內(nèi)皮細(xì)胞受損，可見慢性炎癥過程及泡沫細(xì)胞形成，可見細(xì)胞空泡變性，伴有動脈粥樣硬化斑塊形成；經(jīng)芹菜素預(yù)處理12周后，動脈粥樣硬化大鼠主動脈病變明顯改善，其中以80 mg/kg效果最為顯著，見圖1。經(jīng)主動脈病變分級發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠主動脈病變分級2級以上的占85%，較正常對照組病變分級顯著升高（P < 0.01），芹菜素80 mg/kg預(yù)處理組主動脈病變分級較模型組顯著降低（P < 0.05或P < 0.01），見表4。

A：正常對照組；B：模型組；C：芹菜素20 mg/kg預(yù)處理組；D：芹菜素40 mg/kg預(yù)處理組；E：芹菜素80 mg/kg預(yù)處理組；F：辛伐他汀預(yù)處理組

圖1 芹菜素對動脈粥樣硬化大鼠主動脈形態(tài)學(xué)變化的影響

（HE染色，400×）

3 討論

動脈粥樣硬化的病理機制非常復(fù)雜，與多種因素有關(guān)，但隨著研究的深入，近年來“氧化反應(yīng)學(xué)說”和“炎癥學(xué)說”已經(jīng)成為動脈粥樣硬化發(fā)病機制的主流學(xué)說。Fatar等[13]研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化的發(fā)生與氧化應(yīng)激損傷關(guān)系密切，其在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中具有非常重要的作用。ROS有多種類型，血管細(xì)胞中最重要的是超氧陰離子，它本身不破壞血管，但由它生成的其他活性氧以及NO將造成血管壁的損傷，導(dǎo)致斑塊的形成、破裂與血栓形成[14-16]。正常生理狀態(tài)下，活性氧的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，但當(dāng)活性氧生成過多或機體抗氧化酶活性降低時，就會造成活性氧的過剩，進而導(dǎo)致動脈血管的損傷。SOD能夠催化還原活性氧生成過氧化氫，并在GSH-Px和CAT的催化作用下進一步還原生成對人體無害的水和氧[17-18]，SOD、GSH-Px和CAT共同構(gòu)成了機體的抗氧化酶防御系統(tǒng)，它們的活性能夠直接反映機體的抗氧化能力。

動脈粥樣硬化的另一個重要病理機制為“炎癥學(xué)說”，Ross[19]研究發(fā)現(xiàn)，炎癥可以通過多種途徑和一系列病理生理變化促進動脈粥樣硬化整個過程的發(fā)生發(fā)展，其中關(guān)于細(xì)胞免疫參與的炎性反應(yīng)研究最多，T淋巴細(xì)胞廣泛存在于動脈粥樣硬化斑塊處，促進巨噬細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，包括促炎癥細(xì)胞因子CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6，而誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的凋亡，促進動脈粥樣硬化發(fā)展，并且能夠抑制具有機體保護作用的IL-10的分泌[20]。

芹菜素是一種黃酮類化合物，具有明顯的抗氧化、抗炎、抗凋亡等多種藥理學(xué)作用。本研究通過高脂飲食加注射VD3的方法誘導(dǎo)制備動脈粥樣硬化大鼠模型進行研究發(fā)現(xiàn)，通過芹菜素預(yù)處理能夠有效抑制主動脈病變，降低主動脈病變級別，改善抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性，降低ROS以及炎癥細(xì)胞因子CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，并提高IL-10含量，提示芹菜素具有抑制動脈粥樣硬化大鼠氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的作用，從而起到抑制動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的作用。

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（收稿日期：2015-10-17 本文編輯：張瑜杰）