子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中Aurora—A、MCM7和HPV16 E7的表達(dá)及病理學(xué)分析

蔡明霞 鄧再興

[摘要] 目的 探討子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中Aurora-A、MCM7和HPV16 E7的表達(dá)及病理學(xué)情況。 方法 分析2013年2月～2015年4月浙江省湖州市德清縣中醫(yī)院病理科收集的手術(shù)切除宮頸新鮮標(biāo)本90例的病理學(xué)情況，依據(jù)宮頸病變分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組：正常組（20例）、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅰ組（20例）、CIN Ⅱ組（15例）、CIN Ⅲ組（15例）、宮頸鱗癌組（20例）。采用免疫組化法檢測(cè)Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白表達(dá)情況；觀察并比較Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白在宮頸不同病變、臨床分期、病理情況的宮頸組織中的表達(dá)；觀察Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白與宮頸鱗癌病理分期的相關(guān)性。 結(jié)果 鱗癌組Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。Ⅱa～Ⅱb期宮頸鱗癌組織中Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于Ⅰa～Ⅰb期宮頸鱗癌組織，低分化宮頸鱗癌組織中Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于高分化、中分化宮頸鱗癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均與宮頸鱗癌病理分期呈正相關(guān)（r=0.305、0.306、0.304，均P < 0.05）。 結(jié)論 Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白在宮頸癌、癌前病變中具有重要的意義，各蛋白聯(lián)合檢測(cè)可以為宮頸癌診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)提供可靠的理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌；Aurora-A；MCM7；HPV16 E7；表達(dá)；病理學(xué)

[中圖分類號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）02（a）-0020-05

Expression and pathology analyze of Aurora-A， MCM7 and HPV16 E7 in cervical squamous cell carcinoma

CAI Mingxia1 DENG Zaixing2

1.Department of Pathology， Deqing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Zhejiang Province， Deqing 313200， China； 2.Department of Pathology， Huzhou Maternal and Child Health-Care Hospital， Zhejiang Province， Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To approach expression and pathology conditions of Aurora-A， MCM7 and HPV16 E7 in cervical squamous cell carcinoma. Methods Pathological conditions of 90 fresh cervical specimens excison from February 2013 to April 2015 in Department of Pathology of Deqing Traditional Chinese Medicine Hospital were analyzed. According cervical lesions classification standard， they were divided into cervical normal group （20 cases）， CIN Ⅰ group （20 cases）， CIN Ⅱ group （15 cases）， CIN Ⅲ group （15 cases）， cervical squamous cell carcinoma group （20 cases）. The expression of Aurora-A， MCM7 and HPV16 E7 protein were detected by immunohistochemical method； the expression of Aurora-A， MCM7 and HPV16 E7 protein in tissues with different cervical lesions， clinical stages and pathological stages of cervical squamous cell carcinoma were observed and compared； the correlation between expression of Aurora-A， MCM7 and HPV16 E7 protein and pathological staging of cervical squamous cell carcinoma were analyzed. Results The positive expression rate of Aurora-A， MCM7 and HPV16 E7 protein in cervical squamous cell carcinoma group was higher than those of the normal group， CIN Ⅰ group， CINⅡ group， CIN Ⅲ group， the differences were statistically significant （all P < 0.05）； the positive expression rate of Aurora-A， MCM7 and HPV16 E7 protein in cervical squamous cell carcinoma with Ⅱa-Ⅱb stage was higher than Ⅰa-Ⅰb stage， the positive expression rate of Aurora-A， MCM7 and HPV16 E7 protein in tissues with low differentiated cervical squamous carcinoma were higher than those tissues with high and middle differentiated cervical squamous carcinoma， the differences were statistically significant （all P < 0.05）； the positive expression rate of Aurora-A， MCM7 and HPV16 E7 protein was positively correlated with the pathological staging of cervical squamous cell carcinoma （r = 0.305， 0.306， 0.304， all P < 0.05）. Conclusion The Aurora-A， MCM7 and HPV16 E7 protein have important significance in the cervical squamous cell carcinoma， precancerous lesions， joint detection of three proteins can provide reliable theory basis for diagnosis and prognosis evaluation of cervical cancer.

[Key words] Cervical squamous cell carcinoma； Aurora-A； MCM7； HPV16 E7； Expression； Pathology

宮頸癌是全球范圍內(nèi)的女性惡性腫瘤，其發(fā)生率僅次于乳腺癌，居第二位，目前國(guó)內(nèi)每年有13萬(wàn)例宮頸癌新發(fā)患者，其占全世界總發(fā)生率的28.2%，成為威脅我國(guó)女性生殖健康和生命安全的惡性腫瘤[1-2]。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，因此宮頸癌及癌前病變的及早發(fā)現(xiàn)和有效防治對(duì)于避免其惡化和轉(zhuǎn)移是至關(guān)重要的[3-4]。本研究通過(guò)對(duì)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者手術(shù)新鮮標(biāo)本進(jìn)行分析，擬探討子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中Aurora-A、MCM7和HPV16 E7的表達(dá)及病理學(xué)情況，為更好地指導(dǎo)臨床診斷子宮頸鱗狀細(xì)胞癌提供可靠地理論依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年2月～2015年4月浙江省湖州市德清縣中醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）病理科收集的手術(shù)切除宮頸新鮮標(biāo)本90例作為觀察對(duì)象，依據(jù)宮頸病變分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組，正常：宮頸無(wú)典型增生；宮頸上皮內(nèi)瘤變（CINⅠ）：宮頸輕度非典型增生，異型細(xì)胞局限于上皮層的下1/3區(qū)，CIN Ⅱ：宮頸中度非典型增生，異型細(xì)胞占上皮層的1/3～2/3，異型性比CIN Ⅰ明顯；CIN Ⅲ：宮頸重度非典型增生，異型細(xì)胞占上皮層2/3以上，宮頸鱗癌：異型細(xì)胞達(dá)到上皮全層，出現(xiàn)病理性核分裂象。其中正常組20例，CIN Ⅰ組20例，CIN Ⅱ組15例，CIN Ⅲ組15例，鱗癌組20例，組織標(biāo)本患者年齡36～51歲，平均（41.5±6.6）歲，各個(gè)標(biāo)本均通過(guò)組織病理學(xué)證實(shí)，均沒(méi)有通過(guò)化療、放療和免疫性治療。20例宮頸鱗癌病理分級(jí)：低分化鱗癌6例，中分化鱗癌7例，高分化鱗癌7例。臨床分期：Ⅰa～Ⅰb期：8例，Ⅱa～Ⅱb期12例。本研究中的患者均經(jīng)相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者在知情同意情況下參與本項(xiàng)調(diào)查。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 主要儀器：德國(guó)蔡司Axio Lab A1顯微鏡，無(wú)錫朗珈PAS9000病理圖像分析系統(tǒng)。主要試劑：兔抗人MCM7單克隆抗體（武漢博士德生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)），1∶100 Anti-HPV16 E7兔源、多抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），Aurora-A原液試劑（Abcam香港公司）。

1.2.2 免疫組化方法觀察Aurora-A、MCM7和HPV16 E7的表達(dá)情況 收集宮頸新鮮組織標(biāo)本在10%福爾馬林中浸泡進(jìn)行組織固定，將宮頸組織從固定液中取出來(lái)之后，通過(guò)自來(lái)水沖洗24 h，依次浸入75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行脫水，然后依次移入二甲苯進(jìn)行透明處理。在包埋模具中加入到液態(tài)石蠟，加蓋液體石蠟，形成蠟塊。將包埋好蠟塊放置在切片上，促使切面和刀口保持平行，切片厚度為4 μm，將切片放入恒溫水箱，在切片表面褶皺自然展開之后保持其貼附在防脫載玻片上進(jìn)行烘干。將防脫載玻片放在載片架上，放在60℃恒溫箱進(jìn)行烤片，烤片時(shí)間為45～60 min。將載玻片逐步加入二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）、二苯（Ⅲ）進(jìn)行脫蠟，每種試劑各需要15 min，隨后逐步的放入無(wú)水乙醇（Ⅰ）、無(wú)水乙醇（Ⅱ）、無(wú)水乙醇（Ⅲ）、95%乙醇、85%乙醇進(jìn)行水化，最后再放入蒸餾水沖洗5 min。將標(biāo)本組織完全進(jìn)入到PBS緩沖液進(jìn)行漂洗3次，每次持續(xù)漂洗5 min。取800 mL檸檬酸緩液放至高壓鍋中進(jìn)行加熱，保持溫度1700℃，等到鍋底冒水氣泡，將載玻片放到鍋內(nèi)加蓋，排氣后停止加熱，加蓋保持10 min，逐步冷卻到常溫狀態(tài)下。修復(fù)之后標(biāo)本組織放到PBS緩沖液進(jìn)行漂洗3次，每次漂洗5 min。每張切片上滴加50 μL的3%H2O2，保證對(duì)宮頸組織進(jìn)行完全覆蓋，在濕盒內(nèi)室溫下避光放置20 min，將內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶去掉，然后再用蒸餾水進(jìn)行沖洗3遍。分別加入一抗，4℃冰箱孵育16 h，通過(guò)PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。孵育16 h，放入37℃溫箱中進(jìn)行復(fù)溫45 min。PBS緩沖液進(jìn)行漂洗3次，加入二抗，在室溫下孵育20 min，PBS緩沖液進(jìn)行漂洗3次，加入SABC試劑將宮頸組織完全覆蓋，室溫下孵育20 min。PBS緩沖液進(jìn)行漂洗4次，滴加DAB混合溶液，室溫下進(jìn)行顯色反應(yīng)，通過(guò)顯微鏡觀察，染色程度。將顯色終止后的切片，蒸餾水浸泡，然后浸泡在蘇木精進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染，3～5 min，然后用自來(lái)水沖洗，在鹽酸酒精溶液中浸泡2次，進(jìn)行分化，在自來(lái)水下沖洗，促使其返藍(lán)，保持切片濕潤(rùn)，通過(guò)光鏡觀察細(xì)胞核。將組織切片吹干，逐步放入乙醇進(jìn)行脫水。二甲苯等進(jìn)行透明處理，然后進(jìn)行封片，通過(guò)圖像采集系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行拍照采圖。

1.2.3 Aurora-A、MCM7和HPV16 E7結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) Aurora-A、MCM7和HPV16 E7在宮頸組織中的陽(yáng)性表達(dá)均在細(xì)胞核中，均呈現(xiàn)棕黃色，空白陰性對(duì)照細(xì)胞不會(huì)顯色。分別根據(jù)三者在宮頸不同病變組織中陽(yáng)性細(xì)胞百分率和染色程度進(jìn)行判定評(píng)價(jià)。每張玻片在高倍鏡（400倍）下選擇≥5個(gè)宮頸組織結(jié)構(gòu)完整、染色背景清晰程度、陽(yáng)性細(xì)胞最集中的視野進(jìn)行觀察，每個(gè)視野內(nèi)分別觀察100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算平均陽(yáng)性率。陽(yáng)性表達(dá)按照細(xì)胞著色程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，1分：細(xì)胞著色淺，稍高于背景顏色；2分：細(xì)胞著色，明顯高于背景；3分：細(xì)胞著色強(qiáng)染，著色呈現(xiàn)深棕色。按照陽(yáng)性細(xì)胞所占比例劃分，0分：0≤陽(yáng)性率<10%；1分：10%≤陽(yáng)性率≤50%；2分：陽(yáng)性50%<陽(yáng)性率≤75%；3分：75%<陽(yáng)性率≤100%。兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)相加進(jìn)行分級(jí)：（-）：分?jǐn)?shù)范圍0～1分；（+）：分?jǐn)?shù)為2分；（++）：分?jǐn)?shù)范圍3～4分；（+++）：分?jǐn)?shù)≥5分[5-6]。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白在不同宮頸病變中的表達(dá)情況；觀察Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白表達(dá)在不同臨床、病理分期的宮頸鱗癌組織中的表達(dá)情況；分析Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白與宮頸鱗癌病理分期的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用直線相關(guān)分析進(jìn)行變量間的相關(guān)性分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白在宮頸不同病變中的表達(dá)情況

鱗癌組Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白表達(dá)和宮頸鱗癌臨床病理情況

Ⅱa～Ⅱb期宮頸鱗癌組織中Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于Ⅰa～Ⅰb期宮頸鱗癌組織，低分化宮頸鱗癌組織中Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于高分化、中分化宮頸鱗癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白和宮頸鱗癌病理分期相關(guān)性

Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均與宮頸鱗癌病理分期呈正相關(guān)（r = 0.305、0.306、0.304，均P < 0.05）。

2.4 Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白在宮頸鱗癌表達(dá)情況

通過(guò)免疫組化法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，在高倍鏡下宮頸鱗狀細(xì)胞癌癌細(xì)胞核內(nèi)均可見(jiàn)Aurora-A、MCM7和HPV16 E7的蛋白。見(jiàn)圖1。

3 討論

近年來(lái)隨著宮頸癌患病率明顯增高，尤其是年輕化趨勢(shì)越來(lái)越明顯，宮頸癌的早期診斷和有效治療顯得尤為重要。探尋準(zhǔn)確的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，為指導(dǎo)臨床治療提供可靠的理論依據(jù)，并已成為目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[7-8]。免疫組化法是通過(guò)抗原-抗體特異性結(jié)合的基本原理，通過(guò)特異性抗體標(biāo)記顯色劑發(fā)生顯色，對(duì)組織或者細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行定性，甚至進(jìn)一步進(jìn)行定位、定性或者定量分析[9-10]。

本研究通過(guò)分析我院病理科2013年2月～2015年4月收集的手術(shù)切除宮頸新鮮標(biāo)本90例病理學(xué)情況，通過(guò)免疫組化法分別對(duì)Aurora-A、MCM7和HPV16 E7的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。觀察Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白在宮頸不同病變、不同臨床病理的宮頸鱗癌組織中的表達(dá)情況，并分析Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白與宮頸鱗癌病理分期的相關(guān)性。結(jié)果表明，鱗癌組Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組，提示宮頸鱗癌Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白表達(dá)明顯升高，可以用于正常人群和宮頸病變的鑒別。宮頸鱗癌Ⅱa～Ⅱb期Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于Ⅰa～Ⅰb期，提示隨著臨床分期的變化，宮頸鱗癌Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高。宮頸鱗癌低分化患者Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于高分化、中分化者，Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和宮頸鱗癌病理分期呈正相關(guān)，提示Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白表達(dá)和宮頸鱗癌病理分期變化可能有著密切的關(guān)系，可以作為臨床評(píng)價(jià)宮頸鱗癌病理分期的敏感指標(biāo)。Aurora-A是Aurora激酶中的一種，屬于調(diào)節(jié)中心體、微管功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，其在正常生理狀態(tài)下主要功能是對(duì)細(xì)胞分裂過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)，保證G2/M的正常轉(zhuǎn)變，中心體發(fā)生分離、成熟，紡錘體裝配和穩(wěn)定胞質(zhì)分裂[11-12]。在上皮性惡性腫瘤中，如結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌等均有不同程度的表達(dá)，與惡性腫瘤預(yù)后不良密切相關(guān)，其往往在多種惡性腫瘤細(xì)胞系中有異常高表達(dá)，并且可以引起細(xì)胞非整倍體和中心體異常變化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[13-14]，在正常小鼠NH3-T3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Aurora-A基因，可能造成裸鼠形成惡性腫瘤。有資料顯示[15-16]，宮頸癌細(xì)胞株中Aurora-A的基因、蛋白水平均有異常高表達(dá)，提示Aurora-A過(guò)度表達(dá)可能屬于宮頸癌發(fā)生過(guò)程中的早期事件。Aurora-A在細(xì)胞中的高度表達(dá)會(huì)對(duì)中心體形成擴(kuò)增，造成中心體功能缺失，形成了多級(jí)別的紡錘體，Aurora-A促使微管聚集，造成中心體和胞漿異常分裂，從而形成紡錘體、微管動(dòng)粒。研究表明[17]，Aurora-A可以調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路、通過(guò)磷酸化對(duì)底物PP1、RASGAP和TPX2進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展變化。微小染色體維持蛋白7（MCM7）是啟動(dòng)DNA復(fù)制重要蛋白質(zhì)，其和腫瘤發(fā)生、發(fā)展及惡化轉(zhuǎn)移均有者密切的關(guān)系。MCM7其是MCMs蛋白家族中的一員，還包括MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6，這些蛋白均具有相似的結(jié)構(gòu)，相互之間可以形成多聚復(fù)合體，其可以參與DNA復(fù)制和延伸，具有解鏈酶作用，調(diào)控DNA復(fù)制。MCM7是連接細(xì)胞周期中進(jìn)行多種調(diào)控機(jī)制的橋梁，與細(xì)胞增殖分化、腫瘤形成均有著密切的關(guān)系。有研究表明[18-19]，MCM7參加G1期和S期對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控，與細(xì)胞的生成、細(xì)胞增殖和腫瘤形成有著密切的關(guān)系。人乳頭瘤病毒（HPV）在宮頸癌、癌前病變的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有著始動(dòng)因素作用。HPV屬于雙鏈DNA病毒，其具有親膚和親黏膜的特性，HPV亞型比較多，其中HPV16型屬于一種高危險(xiǎn)型人乳頭瘤病毒，其是目前最常見(jiàn)的類型，約占高危險(xiǎn)型人乳頭瘤病毒的50%[20-24]。HPV持續(xù)存在會(huì)引起細(xì)胞出現(xiàn)各種不同的轉(zhuǎn)化，從而最終發(fā)展成為癌，高危險(xiǎn)型HPV合成的E5、E6、E7蛋白在體外實(shí)驗(yàn)過(guò)程中能夠誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在人體內(nèi)也可能造成腫瘤發(fā)生和發(fā)展，因而又被稱為致瘤蛋白。這些致瘤蛋白不僅保持高危險(xiǎn)型HPV自身復(fù)制以外，還會(huì)對(duì)正常細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性的調(diào)控，從而造成組織細(xì)胞發(fā)生異常性的增生、轉(zhuǎn)化，病毒的持續(xù)性存在會(huì)造成CIN，最終引起癌變發(fā)生。HPV16 E7參與宮頸癌的機(jī)制比較復(fù)雜：①和野生型Rb蛋白結(jié)合，對(duì)Rb蛋白和轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合造成干擾，進(jìn)而促使細(xì)胞生長(zhǎng)嚴(yán)重失控；②消除TGF-β對(duì)于C-myc啟動(dòng)子的遏制效果；③對(duì)P21活性造成直接或者間接的影響；④P170、P130、cyclin A、cyclin E、cyclin D、cdk2等不同的細(xì)胞增殖周期相關(guān)性因子相結(jié)合，造成細(xì)胞分裂周期紊亂。HPV16 E7蛋白對(duì)于HPV復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活化狀態(tài)可以直接反應(yīng)，因而成為宮頸瘤變的生物標(biāo)志物之一。

綜上所述，Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白在宮頸癌、癌前病變中具有重要的意義，各蛋白聯(lián)合檢測(cè)可以為宮頸癌診斷及預(yù)后判斷提供可靠的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2015-11-01 本文編輯：任 念）