大豆根腐病拮抗菌枯草芽孢桿菌8—32抗菌物質(zhì)性質(zhì)的初步研究

胡云云 高同國 張冬冬 等

摘要：對(duì)致病菌—尖孢鐮刀菌（Fusrium oxysporum）具有較強(qiáng)拮抗作用的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）8-32產(chǎn)生的理化性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，該抗菌物質(zhì)80 ℃處理30 min，拮抗活性仍保持在90.00%，100 ℃以上會(huì)完全喪失活性；在pH 7.0～11.0范圍內(nèi)抑菌活性較穩(wěn)定，最適pH為8.0；高濃度（25 mmol/L）EDTA使其拮抗活性降低62%；該抗菌物質(zhì)對(duì)Cu2+、Fe3+敏感，對(duì)蛋白酶K不敏感?？莶菅挎邨U菌8-32產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)具有一定的耐熱、耐堿（pH 11.0）、對(duì)蛋白酶不敏感等特性。

關(guān)鍵詞：大豆根腐??； 生物防治； 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）8-32； 抗菌物質(zhì)； 理化性質(zhì)

中圖分類號(hào)：S476+.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）04-0917-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.026

A Preliminary Study on Physicochemical Properties of Antibacterial Substances

from Bacillus subtilis 8-32 against Soybean Root Rot

HU Yun-yun1，GAO Tong-guo1，ZHANG Dong-dong1，LI Shu-na1，GUO Xiao-jun1，JIANG Jun-po1，

ZHU Bao-cheng1，WANG Ling-min2

（1.College of Life Sciences，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，Hebei，China；

2.Mumeihuading Biological Fertilizer Co.， Ltd.，Tangshan 063000，Hebei， China）

Abstract： The physicochemical properties of antibacterial substances secreted by Bacillus subtilis 8-32 which had strong antagonistic against Fusarium oxysporum were studied. The results showed that the antibacterial materials had good heat resistance， antagonist activity remained at 90.00% after 30 min treatment with 80 ℃ and completely lost above 100 ℃；The inhibitory activity of the antibacterial substances was stable in pH 7.0～11.0， and the best pH was 8.0； The antagonist activity reduced by 62% after added 25 mmol/L EDTA； The antibacterial substances were sensitive to Cu2+、Fe3+，but not sensitive to protease K. The experimental results showed that antibacterial substances extracted from B. subtilis 8-32 were heat-resistant， alkali resistant （pH 11.0）， and they were not sensitive to protease K.

Key words： soybean root rot； biological control； Bacillus subtilis 8-32； antagonistic substances； physicochemical properties

大豆是重要的油料作物和糧食作物，近年來由于大豆重茬、迎茬種植比例不斷增加，導(dǎo)致大豆根腐病日趨嚴(yán)重，成為制約中國大豆生產(chǎn)的重要病害之一。中國大豆根腐病主要分布于東北和黃淮地區(qū)，每年發(fā)病面積占大豆播種面積的1/3以上，根腐病造成的產(chǎn)量損失一般在10%～30%，嚴(yán)重的可達(dá)50%～60%，甚至絕產(chǎn)，每年造成數(shù)億元的經(jīng)濟(jì)損失。因此，大豆根腐病防治技術(shù)的研究成為生產(chǎn)中急需解決的問題[1，2]。

大豆根腐病是由多種病原真菌引起的[2]，而尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是大豆根腐病的主要致病菌[3]。目前對(duì)大豆根腐病的防治主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥。近年來，化學(xué)農(nóng)藥殘毒和對(duì)環(huán)境的污染問題越來越引起人們的關(guān)注，生物防治技術(shù)逐漸引起人們的重視[4]。芽孢桿菌具有抗菌譜廣、抗輻射、熱穩(wěn)定性好、易生產(chǎn)和儲(chǔ)存等特點(diǎn)，在生物防治中表現(xiàn)出很好的發(fā)展前景[5，6]。

前期工作中，以病原菌尖孢鐮刀菌為指示菌，篩選得到一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）8-32，該菌株對(duì)大豆根腐病表現(xiàn)出較強(qiáng)的生防效果。本研究擬進(jìn)一步對(duì)該菌株拮抗物質(zhì)進(jìn)行初步分離，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步應(yīng)用于大豆根腐病的生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：枯草芽孢桿菌 8-32由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院篩選得到；尖孢鐮刀菌由中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究院王光華教授提供。

培養(yǎng)基：①NB培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min；②PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 抗菌物質(zhì)的初步分離 挑取一環(huán)菌種接入NB培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h作為種子液，將種子液以2%接種量轉(zhuǎn)接于NB培養(yǎng)基，相同條件下振蕩培養(yǎng)72 h。將發(fā)酵液在4 ℃，8 000 r/min離心10 min棄菌體收集上清液備用。

采用硫酸銨分級(jí)沉淀法對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行分離，添加硫酸銨飽和度為20%、50%、80%，置于4 ℃冰箱中過夜。4 ℃下10 000 r/min離心30 min，沉淀用無菌水溶解，將收集的粗提液裝入透析袋中，透析過夜。將透析液冷凍干燥后，用適量的無菌水溶解，即初步分離到枯草芽胞桿菌8-32拮抗真菌物質(zhì)。

1.2.2 抗菌物質(zhì)濃度的測定 采用Bradford檢測法進(jìn)行測定[7]。

1.2.3 抗菌物質(zhì)活性的測定 挑取直徑約為0.6 cm的指示菌菌塊，接種于PDA平板中央，25 ℃培養(yǎng)5 d用于活化尖孢鐮刀菌。

將約20 mL滅菌PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中作為底層培養(yǎng)基。取5 mL無菌水倒入病原菌平板并用接種針刮取孢子制成菌懸液，倒入45 ℃左右的滅菌PDA培養(yǎng)基，混勻鋪板，冷卻后制成含有病原菌的PDA培養(yǎng)平板。用直徑6 mm的打孔器選擇合適的間距打孔。然后取80 μL的枯草芽胞桿菌8-32拮抗物質(zhì)溶液注入小孔內(nèi)。培養(yǎng)2 d后，測量并記錄抑菌圈直徑。

1.2.4 抗菌物質(zhì)理化性質(zhì)的研究

1）金屬離子對(duì)拮抗物質(zhì)抗菌活性的影響。將抗菌物質(zhì)粗提液分成等體積的若干份，分別加入CaCl2、CuSO4、MnCl2、FeCl3、KCl、NaCl溶液，使金屬離子終濃度達(dá)到25 mmol/L和50 mmol/L兩個(gè)水平，同時(shí)以無菌水作空白對(duì)照，每處理3次重復(fù)。

2）EDTA對(duì)拮抗物質(zhì)抗菌作用的影響。在抗菌物質(zhì)粗提液中分別加入不同終濃度（3.125、6.250、12.500、25.000 mmol/L）的EDTA溶液，同樣以無菌水作為空白對(duì)照，每處理3次重復(fù)。

3）pH對(duì)菌株拮抗物質(zhì)活性的影響。在上述抗菌物質(zhì)粗提液中分別加入0.05 mol/L pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的緩沖液。pH 3.0～8.0采用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH 9.0～11.0采用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，以無菌水為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。

4）熱處理對(duì)菌株拮抗物質(zhì)活性的影響。將上述抗菌粗溶液經(jīng)40、60、80、100、121 ℃處理30 min，測定熱處理后拮抗物質(zhì)抑菌活性的變化，以未經(jīng)熱處理的拮抗物質(zhì)作為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。

5）抗菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性。向抗菌物質(zhì)溶液中加入蛋白酶K溶液，使蛋白酶終濃度為1 mg/mL。蓋緊離心管，反應(yīng)混合物在37 ℃孵育2 h后將其放入80 ℃的水浴鍋內(nèi)，維持10 min以使酶失活終止反應(yīng)。以未經(jīng)蛋白酶處理的等濃度的拮抗物質(zhì)作為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌物質(zhì)含量的測定結(jié)果

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品測定蛋白質(zhì)濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。由圖1可知，R2=0.990 8，線性相關(guān)性較好，曲線方程為y=0.004 6x+0.009 5，可作為蛋白質(zhì)濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

用考馬斯亮藍(lán)G250測定了飽和度為20%、50%和80%的硫酸銨析出的拮抗物質(zhì)的濃度，其濃度分別為0.742、6.399、11.060 μg/μL。

2.2 抗菌物質(zhì)的抑菌試驗(yàn)

采用飽和度為20%、50%和80%的硫酸銨鹽析抗菌粗提物，抑菌試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，枯草芽胞桿菌8-32菌株發(fā)酵液經(jīng)飽和度為50%硫酸銨鹽析后的沉淀物抑菌活性最高，對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)的研究。

2.3 抗菌物質(zhì)的理化性質(zhì)測定結(jié)果

2.3.1 金屬離子對(duì)拮抗物質(zhì)抗菌活性的影響 金屬離子對(duì)拮抗物質(zhì)抗菌活性的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖3。由圖3可以看出，不同金屬離子對(duì)枯草芽孢桿菌8-32拮抗物質(zhì)的活性具有不同影響?？莶菅挎邨U菌8-32拮抗物質(zhì)經(jīng)25 mmol/L的Ca2+、Mn2+、K+、Na+處理后，抑菌活性分別維持在對(duì)照品的100.00%、86.21%、82.76%、100.00%。經(jīng)50 mmol/L的Ca2+、Mn2+、K+、Na+處理后，抑菌活性分別維持在對(duì)照品的93.93%、81.82%、96.97%、103.03%。經(jīng)25 mmol/L的Cu2+、Fe3+處理后，活性維持在對(duì)照品的20.69%、6.96%。50 mmol/L的Cu2+處理后枯草芽孢桿菌8-32拮抗物質(zhì)活性維持在對(duì)照品的6.06%，50 mmol/L的Fe3+處理后抑菌活性完全喪失。

2.3.2 EDTA對(duì)拮抗物質(zhì)抗菌活性的影響 EDTA對(duì)拮抗物質(zhì)抗菌活性的影響見圖4。由圖4可以看出，不同濃度的EDTA溶液對(duì)枯草芽孢桿菌8-32拮抗物質(zhì)的活性具有不同影響，濃度為3.125、6.250、12.500 mmoL/L的EDTA使枯草芽孢桿菌8-32拮抗物質(zhì)的活性稍微有些降低，分別為對(duì)照品的80.13%、70.51%和80.13%。而經(jīng)25.000 mmoL/L EDTA處理后抗菌物質(zhì)活性明顯降低，為對(duì)照品的38.46%?？梢娸^高濃度的EDTA溶液可降低枯草芽孢桿菌8-32拮抗物質(zhì)的活性。

2.3.3 酸堿度對(duì)菌株拮抗物質(zhì)抗菌活性的影響 枯草芽孢桿菌8-32拮抗物質(zhì)對(duì)pH的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，枯草芽孢桿菌8-32拮抗物質(zhì)在pH 7.0～11.0范圍內(nèi)活性變化不大，pH 7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的緩沖液分別處理后，拮抗物質(zhì)活性分別為對(duì)照品的96.15%、100.00%、92.30%、88.46%、80.77%。但當(dāng)pH降至6.0時(shí)，拮抗物質(zhì)活性開始迅速減弱，為對(duì)照品的73.07%，pH 3.0時(shí)抑菌活性完全喪失。由此可知枯草芽孢桿菌8-32抗菌物質(zhì)具有較強(qiáng)的耐堿性（pH 11.0），其最適pH為8.0。

2.3.4 熱處理對(duì)菌株抗菌物質(zhì)活性的影響 溫度對(duì)抗菌物質(zhì)活性的影響見圖6。由圖6可以看出，溫度不高于60 ℃時(shí)，對(duì)拮抗物質(zhì)活性沒有影響，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)拮抗物質(zhì)的活性開始略微下降，分別經(jīng)40、60、80 ℃處理30 min后拮抗物質(zhì)的抑菌活性為對(duì)照品的100.00%、100.00%、90.00%。當(dāng)經(jīng)100 ℃和121 ℃分別處理30 min后，拮抗物質(zhì)的抑菌活性完全喪失?？芍莶菅挎邨U菌8-32拮抗物質(zhì)具有一定的耐熱性。

2.3.5 蛋白酶對(duì)菌株拮抗物質(zhì)活性的影響 抗菌活性物質(zhì)對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性結(jié)果見圖7。從圖7可以看出，蛋白酶K對(duì)枯草芽孢桿菌8-32拮抗物質(zhì)的活性沒有顯著影響，拮抗物質(zhì)經(jīng)1 mg/mL的蛋白酶K經(jīng)37 ℃處理2 h后，其抑菌活性為等濃度拮抗物質(zhì)的92.86%?？芍莶菅挎邨U菌8-32拮抗物質(zhì)對(duì)蛋白酶K不敏感。

3 小結(jié)與討論

本研究對(duì)尖孢鐮刀菌拮抗菌株枯草芽孢桿菌8-32進(jìn)行了抗菌物質(zhì)的提取，活性檢測發(fā)現(xiàn)飽和度為50%的硫酸銨析出的拮抗物質(zhì)活性最佳，并對(duì)其進(jìn)行了理化性質(zhì)的研究。該物質(zhì)對(duì)溫度有一定的穩(wěn)定性，溫度不高于80 ℃時(shí)，對(duì)拮抗物質(zhì)活性幾乎沒有影響，當(dāng)溫度高于100 ℃時(shí)，拮抗物質(zhì)活性完全喪失；對(duì)蛋白酶K不敏感。

對(duì)枯草芽孢桿菌8-32拮抗物質(zhì)的上述研究表明，大豆根腐病拮抗菌枯草芽孢桿菌8-32抗菌物質(zhì)具有一定的耐熱、耐堿（pH 11.0）、對(duì)蛋白酶K不敏感等特性，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

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