多層紙芯片乳腺癌組織微陣列用于抗腫瘤藥物測(cè)試

劉未平 林錦瓊 杜燕 齊明月 梁廣鐵 楊娜 劉大漁

摘 要 [HTSS]開(kāi)發(fā)了一種多層紙芯片細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)， 將乳腺癌細(xì)胞分別接種于多層的圖形化紙芯片的親水區(qū)，折疊后構(gòu)建了仿真實(shí)體腫瘤。多層紙芯片覆以微孔薄膜，用以仿真血管內(nèi)皮層。培養(yǎng)不同時(shí)間后，拆解多層紙芯片檢測(cè)乳腺癌組織內(nèi)各層面的細(xì)胞形態(tài)、存活率、細(xì)胞周期分布以及細(xì)胞內(nèi)乳酸含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各層紙芯片培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞存活率均高于80%，并形成了類(lèi)組織結(jié)構(gòu)。芯片乳腺癌組織內(nèi)部呈酸化傾向，且酸化程度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。與二維（2D）培養(yǎng)細(xì)胞相比較，紙芯片乳腺癌組織內(nèi)細(xì)胞增殖比例顯著降低（15% vs 60%）。多層紙芯片乳腺癌組織顯示了更接近體內(nèi)情況的藥物反應(yīng)機(jī)制，細(xì)胞存活率隨阿霉素濃度升高呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，IC50值顯著高于2D培養(yǎng)細(xì)胞組（5.0 μmol/L vs 1.144 μmol/L）。這種多層紙芯片乳腺癌組織微陣列構(gòu)建簡(jiǎn)便、仿真度高，有望成為抗腫瘤藥物反應(yīng)測(cè)試的有力工具。

關(guān)鍵詞 紙芯片；乳腺癌；組織微陣列；微環(huán)境；抗腫瘤藥物

1 引 言

惡性腫瘤是威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)疾病。半個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，對(duì)于腫瘤的發(fā)生機(jī)制研究取得了一系列重要進(jìn)展，同時(shí)新的腫瘤治療手段也不斷出現(xiàn)，腫瘤治療也逐漸由經(jīng)驗(yàn)性治療模式轉(zhuǎn)變?yōu)閭€(gè)體化精準(zhǔn)治療模式，因此需要根據(jù)患者個(gè)體情況制定針對(duì)性治療方案。腫瘤個(gè)體化治療需要參考基因檢測(cè)以及細(xì)胞-藥物反應(yīng)結(jié)果。與分子水平的檢測(cè)相比較，細(xì)胞水平的藥物測(cè)試可以更直觀(guān)地顯示治療效果，發(fā)現(xiàn)耐藥信息以指導(dǎo)治療方案的及時(shí)調(diào)整，避免不合理治療引發(fā)的副作用，減輕經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]，為腫瘤個(gè)體化治療提供有力的支持。

在機(jī)體內(nèi)，藥物由血管向腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)需要穿越血管內(nèi)皮層和細(xì)胞間質(zhì)，最終進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，這個(gè)過(guò)程涉及腫瘤細(xì)胞與藥物的相互作用。一方面，藥物從血管向細(xì)胞內(nèi)部擴(kuò)散，其濃度隨擴(kuò)散距離的增加而遞減；另一方面，腫瘤組織對(duì)于藥物存在拮抗效應(yīng)，不僅包括上述擴(kuò)散屏障的被動(dòng)性阻擋，還有腫瘤細(xì)胞[2]和間質(zhì)細(xì)胞[3]對(duì)于藥物的主動(dòng)性抵制。傳統(tǒng)的二維（2D）細(xì)胞培養(yǎng)不能有效模擬腫瘤組織[4～6]，具體表現(xiàn)在：（1）細(xì)胞在傳統(tǒng)平板培養(yǎng)容器中喪失了體內(nèi)原有的三維結(jié)構(gòu)，細(xì)胞細(xì)胞間相互作用以及細(xì)胞基質(zhì)間相互作用不復(fù)存在，由此導(dǎo)致擴(kuò)散屏障功能?chē)?yán)重削弱；（2）由于細(xì)胞或組織幾乎完全暴露于培養(yǎng)液，不僅細(xì)胞藥物反應(yīng)被人為地放大，由濃度梯度介導(dǎo)的細(xì)胞微環(huán)境反應(yīng)過(guò)程也被干擾；（3）傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)方式不能實(shí)現(xiàn)及時(shí)的物質(zhì)更新，代謝廢物蓄積對(duì)細(xì)胞的毒性作用可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由于上述原因，目前通用的細(xì)胞水平的抗腫瘤藥物測(cè)試總體效果還不能令人滿(mǎn)意。為了模擬體內(nèi)微環(huán)境，研究者們開(kāi)發(fā)了一系列創(chuàng)新的體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，如體外3D培養(yǎng)技術(shù)[ 7，8]和癌細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)[ 9，10]。相比傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)方法，使用3D培養(yǎng)和共培養(yǎng)技術(shù)所建立的腫瘤細(xì)胞微環(huán)境更加接近體內(nèi)條件。但是，這些方法仍然具有明顯的不足。首先，簡(jiǎn)單的3D培養(yǎng)仍然無(wú)法實(shí)現(xiàn)腫瘤組織和腫瘤微環(huán)境的細(xì)致仿真，而報(bào)道的圖形化細(xì)胞共培養(yǎng)方法[11]雖然可以模擬組織的復(fù)雜性，但普遍操作繁瑣；其次，大多數(shù)細(xì)胞研究平臺(tái)僅能獲知腫瘤組織整體對(duì)于藥物刺激反應(yīng)的結(jié)果，而無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的空間解析。此外，目前使用的3D細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)需要采用共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)，使用成本較高，難于推廣。因此，為實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單有效的個(gè)體化腫瘤治療指導(dǎo)，迫切需要對(duì)細(xì)胞水平抗腫瘤藥物測(cè)試平臺(tái)進(jìn)行改進(jìn)，包括采用簡(jiǎn)便可靠的3D培養(yǎng)平臺(tái)、有效模擬組織擴(kuò)散屏障以及提供腫瘤組織空間解析能力。

利用多層平面材料組裝形成復(fù)合的立體組織結(jié)構(gòu)是一種簡(jiǎn)便有效的組織構(gòu)建方法。已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了利用不同類(lèi)型多孔平面材料，如電紡絲膜、聚合物薄膜和蠶絲蛋白薄膜等作為細(xì)胞載體[12～15]。在這些研究中，首先將不同類(lèi)型細(xì)胞分別培養(yǎng)在多層薄膜上，繼而通過(guò)疊加簡(jiǎn)便地實(shí)現(xiàn)組織的仿真。2009年，哈佛大學(xué)的Martinez等[16]在多層組裝組織構(gòu)建技術(shù)的基礎(chǔ)上，提出“紙芯片”細(xì)胞培養(yǎng)和分析技術(shù)。該技術(shù)在微流控芯片中使用通透性薄膜材料（如紙、纖維膜以及聚合物薄膜等）作為分子擴(kuò)散的媒介以及細(xì)胞培養(yǎng)的支撐， 自提出以來(lái)，紙芯片技術(shù)得到快速發(fā)展，紙和薄膜材料也在細(xì)胞培養(yǎng)中得到了初步應(yīng)用并取得良好效果。張瓊等[17]用明膠處理的硝酸纖維素薄膜模擬基底膜，支撐肝癌細(xì)胞3D培養(yǎng)，顯示出極好的仿真性能。Derda等[18]報(bào)導(dǎo)了使用多層折疊紙材料作為3D細(xì)胞培養(yǎng)的支架，結(jié)果顯示多層紙芯片3D培養(yǎng)可以真實(shí)模擬體內(nèi)生理狀態(tài)。之后，該研究組又使用噴蠟打印技術(shù)，發(fā)展了高通量3D紙芯片細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[19]。從上述研究工作可以看出，紙芯片細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不僅可以簡(jiǎn)便地實(shí)現(xiàn)組織仿真，而且其可拆解特性便于從空間角度反映腫瘤組織不同層面細(xì)胞對(duì)于微環(huán)境因素的反應(yīng)。

本研究提出了一種多層紙芯片3D腫瘤微陣列用于抗腫瘤藥物反應(yīng)測(cè)試。以紙材料作為細(xì)胞培養(yǎng)的支撐，以聚碳酸酯（Polycarbonate，PC） 微孔薄膜仿真血管內(nèi)皮屏障，將PC膜與接種有腫瘤細(xì)胞的圖形化多層紙疊加構(gòu)建仿真乳腺癌組織。借助于紙材料中的分子擴(kuò)散，模擬體內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸形式建立濃度梯度介導(dǎo)的細(xì)胞藥物相互作用機(jī)制。這種紙芯片的最大特色是可以通過(guò)紙層的拆分，簡(jiǎn)便地實(shí)現(xiàn)腫瘤結(jié)構(gòu)3D2D轉(zhuǎn)換。通過(guò)檢測(cè)各層面上細(xì)胞生存和代謝情況，可以從空間上解析不同層面上腫瘤細(xì)胞對(duì)于藥物刺激的反應(yīng)。本研究以MDAMB231乳腺癌細(xì)胞株為模型構(gòu)建組織陣列，并利用這種仿真芯片腫瘤組織獲取癌細(xì)胞對(duì)于藥物刺激的反應(yīng)等信息。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

IX71倒置熒光顯微鏡，AU2700全自動(dòng)生化分析儀（日本Olympus公司）；GUAVA easyCyte HT流式細(xì)胞儀（德國(guó)Merck公司）；噴蠟打印機(jī)（富士施樂(lè)8560DN）。

聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）前體及引發(fā)劑（美國(guó)Dow Coming公司）；PC薄膜（孔徑200 nm） 和Grade114濾紙（英國(guó)Whatman公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、DMEM培養(yǎng)基、明膠、胰蛋白酶溶液、RNase A （美國(guó)ThermoFisher公司）；海藻酸鈉、CaCl2、碘化丙啶（Propidiumiodide，PI）購(gòu)自上海生工公司；鈣黃綠素AM（CalceinAM，日本Dojindo公司）；鹽酸阿霉素（深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司）；熒光染料和阿霉素用二甲基亞砜配制，熒光染料使用前用PBS稀釋為工作液，其中CalceinAM/PI兩種染料含量分別為1.0 mol/L和1.5 mol/L。乳腺癌細(xì)胞株MDAMB231由中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提供。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 紙芯片加工

紙芯片加工參考文獻(xiàn)[20]的方法。每張芯片包含一個(gè)8×5親水點(diǎn)陣，每個(gè)親水點(diǎn)直徑為4 mm，親水點(diǎn)間距為 2 mm。芯片圖案用噴蠟打印機(jī)在濾紙上打印出來(lái)（打印分辨率為2400 dpi × 2400 dpi），之后將濾紙?jiān)?50℃烘烤2 min。濾紙表面的蠟在烘烤過(guò)程中熔化并滲透濾紙全層，形成封閉的親水區(qū)域限定細(xì)胞圖形化生長(zhǎng)。在頂層濾紙的親水區(qū)打孔，底面用雙面膠封接一層微孔PC薄膜（孔徑0.1 μm）。濾紙的細(xì)胞接種區(qū)使用0.1%明膠處理，烘干后備用。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌細(xì)胞MDAMB231首先在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待增殖至80%覆蓋率時(shí)使用0.25%胰蛋白酶EDTA溶液消化。收獲的細(xì)胞洗滌2次后，MDAMB231細(xì)胞懸液與同體積的2.0%海藻酸鈉溶液混勻制成濃度為1.5×107/mL的細(xì)胞懸液。

2.4 紙芯片上細(xì)胞的接種與培養(yǎng)

紙芯片在使用前用紫外線(xiàn)照射消毒。多層紙芯片的14層的每個(gè)親水區(qū)接種1.5 × 105個(gè)細(xì)胞，之后滴加3 μL CaCl2溶液。靜置2 h后將接種了細(xì)胞的紙芯片折疊，用訂書(shū)機(jī)將折疊濾紙的兩端裝訂起來(lái)。折疊紙芯片放置于尺寸為60 mm×9 mm×2 mm的長(zhǎng)方形PDMS孔板中（圖1），加入培養(yǎng)基覆蓋。培養(yǎng)過(guò)程中隔天換液。

圖1 A.芯片加工和實(shí)驗(yàn)操作流程示意圖。（i）濾紙噴蠟打印后烘烤，得到8×5親水點(diǎn)陣；（ii）在首行親水區(qū)打孔并用雙面膠封接一層微孔PC薄膜；（iii）在其余4行親水區(qū)接種乳腺癌細(xì)胞；（iv）濾紙折疊后兩端用訂書(shū)機(jī)裝訂，放入培養(yǎng)池中浸泡培養(yǎng)；B. 多層紙芯片仿真乳腺癌組織；C. 噴蠟打印加工紙芯片實(shí)物圖；D. 紙芯片折疊后置于培養(yǎng)池中浸泡培養(yǎng)。

2.5 紙芯片培養(yǎng)細(xì)胞分析

培養(yǎng)2， 4， 7天后，將多層紙芯片取出、展開(kāi)， CalceinAM/PI染色后，用熒光顯微鏡觀(guān)察每層細(xì)胞的形態(tài)和熒光顯色情況。CalceinAM可透過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Calcein，發(fā)出強(qiáng)綠色熒光 （激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515 nm），因此CalceinAM僅對(duì)活細(xì)胞染色。PI僅能穿過(guò)死細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光 （激發(fā)波長(zhǎng)535 nm，發(fā)射波長(zhǎng)617 nm）。由于Calcein和PIDNA都可被490 nm激發(fā)光激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡根據(jù)不同顏色的熒光同時(shí)觀(guān)察活細(xì)胞和死細(xì)胞。用Photoshop軟件分別統(tǒng)計(jì)紅色和綠色熒光覆蓋面積（S），細(xì)胞生存率=S綠/（S綠+S紅） ×100%。

在培養(yǎng)2， 4， 7天后，將多層紙芯片取出、展開(kāi)，并用剪刀將紙芯片分別剪開(kāi)并放到裝有生理鹽水的試管中。待水凝膠溶解后，分別將各層濾紙收集到1.5 mL離心管，用膠原酶和胰酶消化并收集細(xì)胞，用PBS洗1次后，用預(yù)冷的70%乙醇重懸細(xì)胞，4℃放置30 min固定細(xì)胞。PBS再次洗滌1次后，加入RNase A （100 μg/mL），37℃放置30 min去除RNA，之后加入PI（10 mg/μL）染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)并用Modfit軟件分析得出細(xì)胞周期分布。同時(shí)，制備等量細(xì)胞懸液放入一個(gè)含200 μL細(xì)胞裂解液的離心管，劇烈振蕩，以1000 r/min離心3 min后，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各層細(xì)胞的胞內(nèi)乳酸含量。

2.6 抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素測(cè)試

在細(xì)胞接種后第二天，更換含有不同濃度鹽酸阿霉素的新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后取出濾紙，CalceinAM/PI染色， 熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照，計(jì)算每層細(xì)胞存活率。同時(shí)，以96孔板培養(yǎng)細(xì)胞作為2D組對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 紙芯片上乳腺癌組織的構(gòu)建

本研究利用噴蠟打印技術(shù)加工圖形化紙芯片構(gòu)建高密度腫瘤細(xì)胞陣列。紙芯片折疊后用孔徑0.1 μm微孔PC薄膜覆蓋，用以構(gòu)建仿真腫瘤組織。多層紙材料支撐3D培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞模擬腫瘤實(shí)質(zhì)，紙芯片腫瘤組織表面的微孔薄膜模擬血管內(nèi)皮層，包裹細(xì)胞的水凝膠模擬細(xì)胞外基質(zhì)，而明膠處理紙纖維模擬腫瘤間質(zhì)。因此，多層紙芯片乳腺癌組織允許在高度仿真的條件下進(jìn)行體外抗腫瘤藥物測(cè)試。這種多層紙芯片乳腺癌組織的最大優(yōu)勢(shì)在于可以通過(guò)拆解簡(jiǎn)便地實(shí)現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)從3D至2D的轉(zhuǎn)化，從而可以從空間角度解析腫瘤組織內(nèi)部細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能變化。

3.1.1 乳腺癌組織實(shí)質(zhì)的模擬 濾紙孔隙中的乳腺癌細(xì)胞由于受空間限制得以維系3D 排列形式。熒光顯微鏡成像（圖2A）顯示，濾紙上細(xì)胞團(tuán)散的分布，提示乳腺癌細(xì)胞聚集形成類(lèi)似實(shí)體瘤的腫瘤球結(jié)構(gòu)。Photoshop軟件分析結(jié)果顯示（圖2B），隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各層濾紙的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，表明培養(yǎng)細(xì)胞的增殖。

圖2 多層濾紙上的乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)

Fig.2 Breast cancer cells cultured on multilayer paper chip

（A） 培養(yǎng)不同時(shí)間后紙芯片各層乳腺癌組織CalceinAM/PI染色熒光圖 （放大倍數(shù)4×10，標(biāo)尺100 μm）；B. Photoshop軟件分析得到的各層乳腺癌組織的熒光強(qiáng)度動(dòng)態(tài)變化曲線(xiàn)；C. 紙芯片乳腺癌組織的CalceinAM/PI熒光染色局部放大圖顯示細(xì)胞團(tuán)的形成 （放大倍數(shù)10×10）。

3.1.2 乳腺癌組織間質(zhì)的模擬 紙材料為多孔纖維素結(jié)構(gòu)，具有良好的生物兼容性。本實(shí)驗(yàn)使用明膠處理濾紙纖維，模擬腫瘤間質(zhì)，對(duì)乳腺癌細(xì)胞起到支持、連接、保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)作用。接種細(xì)胞懸液中混有一定濃度的海藻酸鈉，當(dāng)接觸Ca2+時(shí)固化成水凝膠包裹細(xì)胞，功能類(lèi)似于細(xì)胞外基質(zhì)。實(shí)驗(yàn)使用海藻酸鈉濃度為2.0%，可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供適宜的間質(zhì)硬度。海藻酸鈉和明膠中含有選擇素和整合素成分，可以提供細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)[21]，促使乳腺癌細(xì)胞通過(guò)粘附分子與間質(zhì)成分之間建立聯(lián)系。

3.1.3 乳腺癌組織微血管擴(kuò)散屏障的模擬 在腫瘤組織中，細(xì)胞與外界的物質(zhì)交換通過(guò)血管內(nèi)皮層、組織間質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)散而實(shí)現(xiàn)。在多層紙芯片腫瘤組織內(nèi)，物質(zhì)運(yùn)輸依賴(lài)于被動(dòng)擴(kuò)散因而形成了各種物質(zhì)成分在細(xì)胞整個(gè)擴(kuò)散路徑內(nèi)的濃度梯度分布，模擬了體內(nèi)微環(huán)境。據(jù)文獻(xiàn)[22]報(bào)道，由于物質(zhì)擴(kuò)散屏障的存在，體內(nèi)腫瘤組織與外界物質(zhì)交換效率遠(yuǎn)低于體外培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)在紙芯片腫瘤組織中以孔徑0.1μm多孔PC薄膜仿真血管內(nèi)皮，以紙纖維和水凝膠模擬組織間質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)，以3D腫瘤球模擬腫瘤實(shí)體結(jié)構(gòu)，這樣就構(gòu)建了從微血管到腫瘤細(xì)胞的完整擴(kuò)散屏障。

由于擴(kuò)散屏障的存在，腫瘤組織內(nèi)處于缺氧狀態(tài)，而細(xì)胞的代謝主要依賴(lài)糖酵解，因而會(huì)產(chǎn)生乳酸蓄積[ 23]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多層紙芯片乳腺癌組織內(nèi)細(xì)胞內(nèi)乳酸水平隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加（圖3），因此非常接近于體內(nèi)腫瘤組織的酸化狀態(tài)[24]。

3.2 多層紙芯片乳腺癌組織中的細(xì)胞生存和增殖

連續(xù)監(jiān)測(cè)接種后7天內(nèi)的細(xì)胞存活率和細(xì)胞周期分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率緩慢降低，至第4天時(shí)穩(wěn)定在80%左右（圖4A）。在相同時(shí)間點(diǎn)，各層濾紙上的細(xì)胞存活率無(wú)明顯差異。如圖4B所示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，紙芯片腫瘤組織中增殖細(xì)胞比例逐漸降低。在第2天時(shí)，增殖細(xì)胞比例在1層和2層濾紙中約為20%，3層和4層濾紙中分別為30%和50%； 4天以后，各層的增殖細(xì)胞比例均降至15%以下。與2D培養(yǎng)組相比較，多層紙芯片腫瘤組織內(nèi)增殖細(xì)胞比例顯著降低（15% vs 60%），這符合體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖動(dòng)力學(xué)。

3.3 多層紙芯片乳腺癌組織對(duì)于阿霉素刺激的反應(yīng)

如圖5所示，多層紙芯片乳腺癌組織中的細(xì)胞存活率隨著阿霉素濃度升高而降低。相比之下，芯片培養(yǎng)細(xì)胞的效應(yīng)劑量曲線(xiàn)要平緩得多。IC50值在2D組和芯片組分別為1.14和5 μmol/L（預(yù)測(cè)）。阿霉素濃度升高至0.5 μmol/L以上時(shí)，顯現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。用相對(duì)存活率（R=藥物刺激細(xì)胞存活率/同層非藥物刺激細(xì)胞存活率 × 100%）反映細(xì)胞對(duì)于藥物刺激的反應(yīng)，則有 R3>R2>R4>R1。上述結(jié)果提示多層紙芯片乳腺癌組織對(duì)于阿霉素具有較強(qiáng)的抵制，這解釋了為何實(shí)體瘤化學(xué)治療效果普遍不佳[25]。這種藥物抵制效應(yīng)在深層組織更為顯著[26]，分析其原因可能為由于擴(kuò)散屏障的存在，藥物運(yùn)輸效率受到限制，此外由于組織內(nèi)部的缺氧和微環(huán)境酸化，削弱了藥物的療效。

4 結(jié) 論

本研究開(kāi)發(fā)了一種多層紙芯片細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)。將乳腺癌細(xì)胞分別接種于多層的圖形化紙芯片的親水區(qū)，折疊后構(gòu)建了仿真實(shí)體腫瘤。結(jié)果顯示，各層紙芯片培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞存活率均保持在80%以上，并形成了類(lèi)組織結(jié)構(gòu)。芯片乳腺癌組織內(nèi)部呈酸化傾向，且酸化程度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。與2D二維（2D）培養(yǎng)細(xì)胞相比較，紙芯片乳腺癌組織內(nèi)細(xì)胞增殖比例顯著降低。多層紙芯片乳腺癌組織顯示了更加接近體內(nèi)情況的藥物反應(yīng)機(jī)制，細(xì)胞存活率隨阿霉素濃度升高呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，IC50值顯著高于2D培養(yǎng)細(xì)胞組。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于多層紙芯片腫瘤陣列的抗腫瘤藥物測(cè)試操作簡(jiǎn)便、仿真性高，是體外藥物測(cè)試的有力工具。

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AntiCancer Drug Testing Using MultiLayer PaperSupported

Breast Cancer Tissue Array

LIU WeiPing1， LIN JinQiong1， DU Yan1， QI MingYue1， LIANG GuangTie1，2， YANG Na1，2， LIU DaYu*1，2，3

1（Department of Laboratory Medicine， Guangzhou First People′s Hospital，

Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510180， China）

2 （Clinical Molecular Medicine and Molecular Diagnosis Key Laboratory of Guangdong Province， Guangzhou 510180， China）

3 （Clinical Research Center， the Second Hospital Affiliated to Dalian Medical University， Dalian 116027， China）

Abstract This paper describes a multilayer papersupported breast cancer tissue array. The paperbased microchip with arrayed hydrophilic spots was fabricated by wax printing. After cell seeding， the microchip was folded to form an artificial solid tumor， and the multilayer paper was covered by a layer of microporous membrane that mimics endothelial layer. After culturing the papersupported breast cancer tissue for a certain period of time， the multilayer device was unfold thus enabling detections of cell survival， proliferation， morphology and metabolism on different layers. Breast cancer cells cultured on paper had a survival rate >80% and aggregated into tumor spheroids. Intracellular lactic acid levels increased with the extension of culture time. Compared to two dimensional （2D） counterparts， the decreased fraction of S phase cell （15% vs 60%） was detected. The papersupported breast cancer tissue showed a drug response mechanism similar to the tumor in vivo. Cancer cells within the tissue were less sensitive to doxorubicin and the IC50 value detected was significantly higher than that obtained with 2D cultures （5 μmol/L vs 1.14 μmol/L）. The multilayer papersupported breast cancer tissue array developed in this work featured simple tissue reconstruction and easy operation， thus providing an ideal tool for anticancer drug testing.

Keywords Paperbased microfluidic chip； Breast cancer； Tissue microarray； Microenvironment； Anticancer drug

（Received 30 December 2015； accepted 29 February 2016）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 81371649， 81271730， 81171418） and the Medicine Health Science and Technology Program of Guangzhou （Nos. 20121A021002， 20121A011035）