以貽貝貝殼為原料制備的無定形磷酸鈣及其性質(zhì)

韓義忠，崔正陽，陳 岑，葉 婷，孔祥東,

(浙江理工大學(xué)，a.材料與紡織學(xué)院； b.生命科學(xué)學(xué)院， 杭州 310018)

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以貽貝貝殼為原料制備的無定形磷酸鈣及其性質(zhì)

韓義忠a，崔正陽b，陳 岑b，葉 婷b，孔祥東a,b

(浙江理工大學(xué)，a.材料與紡織學(xué)院； b.生命科學(xué)學(xué)院， 杭州 310018)

以廢棄的貽貝貝殼資源為原料，將貝殼簡單粉碎后作為鈣源制備出了無定形磷酸鈣(ACP)。在反應(yīng)過程中先后加入磷酸、三聚磷酸鈉及尿素，快速制備了直徑為250～450 nm的球形亞微米顆粒，該顆粒粒徑分布范圍窄，尺寸均一，表面積大，顆粒表面電位(Zeta電位)為27.5 mV。該無定形磷酸鈣顆粒與量子點結(jié)合性良好，MTT試驗表明該無定形磷酸鈣顆粒對成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)不顯示毒性，生物相容性良好。

無定形磷酸鈣；貽貝貝殼；生物相容性

0 引 言

無定形磷酸鈣(amorphous calcium phosphate，ACP)是一種短程有序，長程無序磷酸鈣的總稱[1]，ACP可以被歸為具有可變化學(xué)組成(Ca/P比范圍可在1.0～2.0之間變化)、化學(xué)性質(zhì)與玻璃相似的一類磷酸鈣鹽[2]。ACP是在中性或酸性條件下合成羥基磷灰石(HAp)過程中發(fā)現(xiàn)的一種磷酸鈣的無定形中間相，所以X衍射分析顯示非晶特征[3]。

貽貝(mussel) 俗稱青口、海紅，其干制品稱淡菜。貽貝屬于軟體動物門(Mollosca)，瓣鰓綱(Lanellibranchia)，異柱目(Anisomyaria)，貽貝科(Mytidea)，是一種營足絲附著生活的雙殼類軟體動物[5]。貽貝貝殼約占貽貝總質(zhì)量的55%，貽貝貝殼的主要無機成分為碳酸鈣(95%)，還有一些有機物質(zhì)(蛋白質(zhì)和多糖)和鎂、鉀、鍶、氮、硫、磷等微量元素[6]。貽貝貝殼中的CaCO3主要組成為方解石和霰石[7]。隨著我國海洋養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，在沿海地區(qū)產(chǎn)生了大量廢棄的貽貝貝殼，貝殼堆積既占用大量的土地，又容易造成環(huán)境污染，還是一種生物資源的浪費。

以貽貝貝殼為原料制備無定形磷酸鈣時，貝殼中的鎂、鉀、鍶等離子可進(jìn)入到顆粒中，天然骨中除了鈣離子外還含有多種與貝殼中相同的金屬元素，所制備的無定形磷酸鈣具有更好的生物相容性。貝殼中的鎂、鍶、碳酸根等離子還可以有效地抑制晶態(tài)磷酸鈣晶粒的形成和生長，從而促進(jìn)ACP的形成[2]。無定形磷酸鈣的生物降解速率可控、骨傳導(dǎo)性能優(yōu)異，具有良好的細(xì)胞粘附性、生物活性，可以用作骨科材料、組織工程支架、牙科材料和釋放載體等[2]。

本研究充分利用了廢棄的貽貝貝殼資源，既有助于緩解環(huán)境問題，還可以提高廢棄資源的附加值，變廢為寶。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

貽貝貝殼(取自舟山市嵊泗縣)，丙酸(分析純，上海展云化工有限公司)，三聚磷酸鈉(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，尿素(分析純，無錫市展望化工試劑有限公司)，無水乙醇(分析純，杭州高晶精細(xì)化工有限公司)，去離子水由milipore純水儀制備。

1.2 儀 器

AK-98流水式超細(xì)中藥粉碎機(奧力中藥機械有限公司)，HL-2B恒流泵(上海嘉鵬科技有限公司)，磁力攪拌器(杭州惠創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司)，ZEISS-ULTRA55掃描電子顯微鏡，JEM-2100透射電子顯微鏡，ARL-X’TRA X射線粉末衍射儀，Nicolet 5700傅里葉紅外光譜(Thermo Electron)，Pyris Diamond TGA熱重分析儀(PerkinElmer)，ZEN3600動態(tài)光散射儀(馬爾文儀器有限公司)，DNA export酶標(biāo)儀(TECAN)，Nano Drop 2000超微量分光光度計(Thermo Scientific)，F(xiàn)-4500熒光分光光度計(日本日立公司)。

1.3 無定形磷酸鈣的制備

貽貝貝殼從舟山市嵊泗縣采集，將貽貝貝殼清洗干凈，干燥后粉碎，置于干燥環(huán)境中備用。取少量樣品進(jìn)行XRD、FTIR、TG分析。

取0.5 g貽貝貝殼粉于100 mL的燒杯中，加入40 mL濃度為5%的丙酸，使其充分反應(yīng)，離心后取上清液，將得到的溶液稀釋至50 mL，然后將濃度為0.06 M的磷酸溶液50 mL滴加到燒杯中，滴加完成后向燒杯中加入0.6 mmol的三聚磷酸鈉，反應(yīng)30 min后加入6 g尿素，攪拌使尿素充分溶解后，將燒杯置于90 ℃的水浴中，攪拌3 min后靜置至出現(xiàn)沉淀。將沉淀離心，用去離子水洗滌2次，乙醇洗滌2次，將其在70 ℃下干燥24 h，得到ACP白色粉末。

1.4 材料表征

1.4.1 透射電子顯微鏡(TEM)觀察

取適量顆粒于無水乙醇中，超聲使顆粒均勻分散到無水乙醇中，用毛細(xì)管取分散液滴于碳膜上，然后放到紅外燈下干燥10 min，用JEM-2100型透射電鏡觀察顆粒形貌、顆粒尺寸。

1.4.2 場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)觀察

取適量顆粒于無水乙醇中，超聲使顆粒均勻分散到無水乙醇中，然后滴加到清洗干凈的硅片表面，待無水乙醇揮發(fā)后將硅片粘貼到導(dǎo)電膠上，采用FE-SEM(加速電壓為3.0 kV)對顆粒形貌進(jìn)行觀察。

1.4.3 X射線粉末衍射儀(XRD)分析

將顆粒均勻地置于載玻片表面，用X射線粉末衍射儀(管電壓40 kV，管電流35 mA，掃描速度為5°/min，掃描范圍2θ=20°～60°)對顆粒進(jìn)行結(jié)晶性能分析。

1.4.4 傅里葉紅外光譜儀(FTIR)分析

將顆粒與溴化鉀研磨混合均勻，采用溴化鉀壓片法，質(zhì)量比為1∶100，研磨后將混合物進(jìn)行壓片(30 MPa，45 s)。利用傅立葉紅外光譜儀(掃描范圍為4000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1)對樣品中的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行分析。

1.4.5 動態(tài)光散射(DLS)

取適量顆粒于無水乙醇中，超聲使顆粒均勻分散到無水乙醇中，取分散好的顆粒懸液于樣品池中，將樣品池插入動態(tài)光散射儀中，測量顆粒的大小、分布與Zeta電位。

1.4.6 熱重分析(TG)

熱重分析(Pyris Diamond TGA, PerkinElmer)在氮氣的氣氛下(氮氣流量為20 mL/min)，溫度范圍為室溫至800 ℃，升溫速率為20 ℃/min。

1.5 ACP顆粒與量子點的結(jié)合

取1 mg/mL的無定形磷酸鈣懸液與1 mL純化后的量子點混合；然后將混合溶液在100 W超聲振蕩20 min，在轉(zhuǎn)速為8000 rpm 離心3 min，吸去上清液；將得到的沉淀用去離子水洗滌2遍，得到純凈量子點與無定形磷酸鈣結(jié)合后的顆粒。使用Nano Drop 2000超微量分光光度計測量得到的顆粒激發(fā)波長，使用熒光分光光度計測量顆粒的發(fā)射熒光光譜。

1.6 生物相容性實驗

將ACP顆粒在紫外燈照射下滅菌12 h，使用PBS配置成不同濃度的懸液。鋪MC3T3-E1細(xì)胞96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為5×105個，將96孔板置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后每孔加入10 μL的不同濃度ACP懸液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不同時間(24 h、48 h、72 h)后，每孔加入20 μL的MTT(3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽)，培養(yǎng)4 h后使用真空安全吸液器(VACOSAFE 158 3XX, INTEGRΛ)吸出培液，每孔加入150 μL的DMSO(二甲基亞砜)，震蕩10 min后，使用酶標(biāo)儀在OD 490 nm處讀取各孔的吸光值，使用公式：細(xì)胞生存率/%=(OD實驗組-OD調(diào)零孔)/(OD對照組-OD調(diào)零孔)×100，計算出細(xì)胞成活率并作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 貽貝貝殼的結(jié)構(gòu)表征

譜可以看出：在1444、1083、873 cm-1出現(xiàn)的特征吸收峰均為球霰石中的特征吸收峰；在1444、873、713 cm-1處出現(xiàn)的特征吸收峰分別為方解石的特征吸收峰[9]。

圖1 貽貝貝殼粉的XRD和FTIR圖譜

圖2 貽貝貝殼粉的熱重分析曲線

由熱重曲線可以看出，在200～475 ℃之間貽貝貝殼粉失重率為1.9%，該失重是由有機物的分解造成的。在610～817 ℃之間又發(fā)生了一次明顯的失重現(xiàn)象，失重率為43.6%，說明占貽貝貝殼的主要無機成分(CaCO3)開始了分解，分解的化學(xué)方程式為：CaCO3→CaO+CO2↑。自然界中大部分碳酸鈣礦物在800 ℃以上的溫度下才能分解(方解石在898 ℃分解，文石和球霰石分別在825 ℃和800 ℃分解為氧化鈣和二氧化碳)，ZHAO等人利用絲膠蛋白調(diào)控生物礦化法制備的碳酸鈣在800 ℃左右分解[10]，而貝殼生物礦物的分解溫度則較低，在600 ℃附近已分解。貽貝貝殼的分解溫度低于不含有機成分的碳酸鈣礦物，原因可能是貽貝貝殼在加熱的過程中，有機質(zhì)逐步分解，與有機物鍵合的鈣離子被游離出來，以有機物為模板的碳酸鈣晶粒更易受到破壞，從而導(dǎo)致碳酸鈣在較低的溫度下分解。

2.2 ACP顆粒的表征

2.2.1 ACP顆粒的形貌表征

由粒徑分布圖(圖3c)可以看出顆粒的粒徑分布范圍窄，顆粒直徑大部分位于250～450 nm，大小均一，與圖3中的SEM圖和TEM圖相對應(yīng)。動態(tài)光散射儀測出所制備顆粒表面電位為27.5 mV。Kandori K等[11]研究認(rèn)為顆粒表面化學(xué)本質(zhì)決定了這些材料的表面Zeta電位并進(jìn)而決定其蛋白吸附能力。

圖3 制得ACP顆粒的形態(tài)

2.2.2 ACP顆粒的X射線衍射分析

由XRD圖譜可以看出在2θ=30°附近有個饅頭峰[12]，表明所制備的顆粒主要為無定形狀態(tài)，進(jìn)一步證明得到的產(chǎn)物為ACP。在XRD圖譜中沒有發(fā)現(xiàn)其他物質(zhì)的衍射峰，說明得到的ACP為純相，而且為無定形相。與TEM中的選區(qū)電子衍射相對應(yīng)，表明成功的合成了ACP顆粒。

圖4 制得顆粒的XRD圖譜

2.2.3 ACP顆粒的傅里葉紅外光譜分析

圖5 制得顆粒的FTIR圖譜

2.2.4 ACP的熱重分析

圖6為利用貽貝貝殼制得無定形磷酸鈣的熱重(TG)分析曲線，由圖可以看出制得的無定形磷酸鈣在加熱過程中不穩(wěn)定，在室溫加熱到800 ℃的過程中總的失重為34.5%。ACP的失重主要分為兩個過程，第一個過程在25～150 ℃之間有個明顯的失重現(xiàn)象，為無定形磷酸鈣團(tuán)簇間的分子水，失重率約為17.1%，符合無定形磷酸鈣含10%～20%的分子水范圍。第二個過程150～800 ℃可能是由于ACP中結(jié)合水分解以及ACP相變導(dǎo)致的重量損失。

圖6 制得顆粒的熱重分析曲線

2.3 ACP顆粒與量子點的結(jié)合性

量子點材料是涉及多種學(xué)科的交叉領(lǐng)域，量子點熒光穩(wěn)定、明亮，激發(fā)光譜寬, 發(fā)射光譜窄。由于其不同于塊體材料的許多性質(zhì)，因此在很多方面具有潛在的應(yīng)用價值，目前量子點最有前途的應(yīng)用領(lǐng)域是作為生物體系中作熒光標(biāo)記物[14]。為了更好地應(yīng)用制備的ACP顆粒，使用CdTe量子點與制得ACP顆粒結(jié)合。圖7中的(a)、(b)為ACP顆粒與CdTe量子點結(jié)合后的熒光顯微鏡圖，由熒光顯微鏡圖可以看出ACP顆粒與量子點有著良好的結(jié)合。圖7中的(c)圖為ACP顆粒與CdTe量子點結(jié)合后的發(fā)射光譜圖，在激發(fā)波長為219 nm下，在437 nm處有最強的熒光強度，峰寬為67.6 nm。由此可以說明當(dāng)本實驗制得的ACP被用作藥物載體時，可以使用CdTe量子點標(biāo)記，從而可以直觀觀察ACP顆粒與細(xì)胞的相互作用。

圖7 ACP與量子點結(jié)合圖片

2.4 制得ACP的生物相容性實驗

為了檢測本研究合成的ACP顆粒是否具有毒性，本實驗采用成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)作為研究對象，設(shè)置不同濃度的ACP懸液(0、0.001、0.01、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)檢測它們對成骨細(xì)胞活性的影響。由圖8可以看出，不同濃度的ACP懸液與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)不同時間(24、48、72 h)后，細(xì)胞的成活率都在90%以上。隨著ACP懸液濃度的增加細(xì)胞的成活率有增加的趨勢，在ACP懸液的濃度較高時(0.6、0.8、1.0 mg/mL)成骨細(xì)胞的成活率在100%以上，表明所合成的ACP顆粒具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的特性。由圖8還可以看出隨著培養(yǎng)時間的延長，ACP顆?？梢约涌旒?xì)胞的生長。利用貽貝貝殼為鈣源制備的無定形磷酸鈣，會有鎂、鉀等離子進(jìn)入到其中，這使其和骨的成分更為相似，具有良好的生物相容性。圖8可以說明利用貽貝貝殼粉制備的ACP顆粒對成骨細(xì)胞不具毒性，安全性高，有良好的生物相容性，可以用作藥物載體和骨修復(fù)材料。曹俊等[15]研究了納米磷酸鈣對MG63細(xì)胞增殖過程的影響作用，結(jié)果表明納米磷酸鈣對MG63細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。

無定形磷酸鈣具有良好的生物相容性，已被用作生物陶瓷、藥物載體、組織工程支架等。王皓宇等[16]利用無定形磷酸鈣負(fù)載重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)制備了納米緩釋體，對制得的材料進(jìn)行體外和體內(nèi)試驗，表明納米緩釋體具有良好的生物相容性和安全性，可適用于骨缺損修復(fù)的治療。賀文慧等[17]研究了空心納米無定形磷酸鈣，并且以牛血清蛋白(BSA)為模型體系研究了材料的載藥和釋放性能，發(fā)現(xiàn)所制備的納米磷酸鈣鈣不僅具有良好的蛋白質(zhì)負(fù)載量而且還具有優(yōu)異的可釋放性，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的羥基磷灰石體系。本研究利用貽貝殼為原料合成的無定形磷酸鈣亞微粒，具有良好的生物相容性，在醫(yī)用材料或藥物載體領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用前景。本研究可以利用廢棄的貽貝殼資源，使其變廢為寶，緩解環(huán)境污染問題，有很大的實際意義。

圖8 不同濃度的ACP懸液對成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)的毒性檢測

3 結(jié) 論

以貽貝貝殼粉為原料制備了無定形磷酸鈣顆粒，顆粒粒徑為250～450 nm亞微粒，顆粒粒徑分布范圍窄，大小均一，表面積大，表面電位(Zeta電位)為27.5 mV。三聚磷酸鈉可以絡(luò)合溶液中的Ca2+，從而影響無定形磷酸鈣的形貌。CdTe量子點與制得ACP顆粒與CdTe量子點具有良好的結(jié)合性，在激發(fā)波長為219 nm下，復(fù)合顆粒在437 nm處有最強的熒光強度，峰寬為67.6 nm。所制備的無定形磷酸鈣顆粒對成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)有著良好的生物相容性，顯示了該材料在醫(yī)用材料或藥物載體領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯： 唐志榮)

Synthesis and Properties of Amorphous Calcium Phosphate Microspheres with Mussel Shells

HANYizhonga,CUIZhengyangb,CHENCenb,YETingb,KONGXiangdonga, b

(a. College of Materials and Textiles； b. College of Life Sciences,Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

Amorphous calcium phosphate (ACP) was successfully synthesized by utilizing the calcium precursor of mussel shell powder. Phosphoric acid, sodium tripolyphosphate and urea were added during the reaction To fast prepare spherical submicron particles with the diameter of 250～450 nm. Particle size distribution range is narrow. The size is uniform and the superficial area is large. Potential of particle surface (Zeta potential) is 27.5 mV. The amorphous calcium phosphate microspheres can well bond with quantum dots. The MTT test results indicate that the ACP microspheres are not toxic to osteoblasts cells (MC3T3-E1), and have good biocompatibility.

amorphous calcium phosphate; mussel shells; biocompatibility

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.11.009

2015-12-26

國家自然科學(xué)基金項目(51272236，51002139)

韓義忠(1988-)，男，山東聊城人，碩士研究生，主要從事生物材料方面的研究。

孔祥東，E-mail：Kongxiangdong@gmail.com

Q279

A

1673- 3851 (2016) 06- 0849- 06 引用頁碼： 110209