HPLC法測定復(fù)方鵝絨藤中兩種黃酮的含量

王增尚 李 強 盛芳婷 扎西白珍 劉江云* 陳 虹

1.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832000

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HPLC法測定復(fù)方鵝絨藤中兩種黃酮的含量

王增尚1李 強2盛芳婷1扎西白珍1劉江云1*陳 虹2

1.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832000

目的：建立同時測定復(fù)方鵝絨藤中小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，CosmosilC18-AR-Ⅱ(4.6mm×250mm，5μm) 色譜柱，乙腈-0.1%乙酸水溶液為流動相梯度洗脫，檢測波長330nm，流速1.0mL/min，柱溫30℃。結(jié)果：小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷線性范圍為4.004～40.04μg(R2=0.9996)，平均加樣回收率為98.1%；芹菜素的線性范圍為1.996～19.96μg(R2=0.9990)，平均加樣回收率為98.4%。結(jié)論：該方法操作簡便，結(jié)果準確，可作為復(fù)方鵝絨藤中該兩種成分的含量測定方法。

鵝絨藤；白花菜籽；小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；芹菜素；含量

復(fù)方鵝絨藤是由鵝絨藤、白花菜籽等藥組成的民間驗方，是以新疆特產(chǎn)鵝絨藤藥材為主藥的在研新藥，主要外用治療肩周炎、腰肌勞損等多種外周關(guān)節(jié)炎性疼痛。根據(jù)復(fù)方鵝絨藤的藥味組成及其制備工藝，本研究在鵝絨藤[1-2]、白花菜籽化學(xué)成分分離鑒定的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜建立該方中兩種黃酮類成分的含量測定方法，為復(fù)方鵝絨藤的質(zhì)量控制標準提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；ME215S型電子天平(德國Starorious公司)；MP2002電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。1.2 材料 鵝絨藤莖葉(批號：ER130901)采自新疆維吾爾自治區(qū)石河子市郊，白花菜籽(批號：BZ140301，購自湖北武漢市)，經(jīng)蘇州大學(xué)藥學(xué)院陸葉博士鑒定依次為鵝絨藤(CynanchumchinenseR.Br.)莖葉及白花菜(CleomegynandraL.)的種子。復(fù)方鵝絨藤提取物(批號：FE140501)按相應(yīng)處方工藝，采用鵝絨藤和白花菜籽經(jīng)醇提、減壓濃縮、大孔樹脂精制、減壓濃縮和干燥獲得。

小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷對照品為自制，從鵝絨藤中分離得到[1]；芹菜素對照品為自制，從白花菜籽中分離得到，并經(jīng)與相應(yīng)化合物[1]NMR數(shù)據(jù)比較確定。兩種對照品經(jīng)HPLC檢測，按峰面積歸一法計算其純度均大于98%。乙腈(色譜純，美國Fisher公司)，純水(娃哈哈)，其余試劑為分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷10.01mg、芹菜素9.98mg于10mL容量瓶中，用甲醇定容制成相應(yīng)對照品儲備液A、B。分別依次精密量取對照品儲備液A 0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，對照品儲備液B 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于50mL容量瓶中，甲醇定容配制成系列小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素混合對照品溶液1～6。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 復(fù)方鵝絨藤供試品溶液 精密稱取復(fù)方鵝絨藤提取物29.42mg于50mL容量瓶中，用甲醇定容，即得。

2.2.2 藥材供試品溶液 參照復(fù)方鵝絨藤提取物相應(yīng)工藝進行制備。分別精密稱定鵝絨藤藥材9.94g、白花菜籽藥材11.48g，各用75 %乙醇100mL加熱回流提取兩次，提取液合并，減壓濃縮至約40mL，上樣于AB-8大孔樹脂柱，依次用水200mL、70 %乙醇100mL洗脫，收集70%乙醇洗脫液、減壓濃縮至約25mL，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用甲醇定容，得儲備液；分別精密量取該儲備液2mL置25mL容量瓶中，用甲醇定容，即得到相應(yīng)鵝絨藤、白花菜籽供試品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱：Cosmosil 5C18-AR-Ⅱ(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：0.1 %乙酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～15min，18%～25%B；15～16min，25%～45%B；16～25min，45% B～60% B；25～30min，60%～80%B)；流速：1.0mL/min；檢測波長：330nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。在此色譜條件下，各相鄰色譜峰之間分離度均大于1.5。見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1”項下6個不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液1-6，分別進樣20μL，以峰面積積分值(y)為縱坐標，進樣質(zhì)量(x)為橫坐標，進行線性回歸，測得小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素的線性方程分別為y=17.72x+9.062，R2=0.9996；y=29.37x-23.52，R2= 0.9990。結(jié)果表明小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素分別在4.004～40.04μg、1.996～19.96μg范圍呈線性關(guān)系。2.5 精密度實驗 分別精密吸取對照品溶液3號20μL，連續(xù)進樣6次，計算小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素峰面積的RSD，分別為1.54 %、2.32%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗 分別精密吸取同一復(fù)方鵝絨藤供試品溶液20μL，分別于0、2、4、6、8h進樣測定，結(jié)果小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素的峰面積RSD分別為1.37%、1.58%，表明穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性實驗 取同一批次復(fù)方鵝絨藤樣品6份，精密稱定，按“2.2”項下方法制備復(fù)方鵝絨藤供試品溶液，進樣20μL，計算小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷含量為39.68mg/g，峰面積RSD為2.12%；芹菜素含量為6.532mg/g，峰面積RSD為2.24%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收實驗 精密稱取“2.7”項下已知含量的同一批次復(fù)方鵝絨藤樣品6份于50mL容量瓶中，每份約15mg，精密加入1mL混合對照品溶液(其中含小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷0.5005mg/mL，芹菜素0.0998mg/mL)，用甲醇定容，進樣20 μL測定，計算兩種成分回收率(表1)。測得平均回收率分別為98.1%、98.4%，RSD值分別為0.51%、0.58 %。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)

2.9 樣品測定 將“2.2”項下三種供試品溶液按照以上條件進樣，記錄芹菜素和小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的峰面積，計算樣品質(zhì)量分數(shù)。實驗結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果 (mg/g,n=3)

3 討論

復(fù)方鵝絨藤是由鵝絨藤、白花菜籽等藥物組成的在研新藥。方中鵝絨藤作為該方主藥，主產(chǎn)于甘肅、內(nèi)蒙、寧夏、新疆等西北地區(qū)，藥用根及新鮮莖的乳汁，乳汁外敷可治療疣贅[3]，其莖葉及其中的黃酮苷類成分具有抗氧化[4]、抗腫瘤[5-6]等活性。本課題前期已對鵝絨藤莖葉中的黃酮類成分進行了分離鑒定[1]，對其中的小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷等主成分進行含量分析[2]。白花菜籽中主要含有黃酮、生物堿等成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌等作用[7]，但未見相關(guān)含量測定報道。通過對白花菜籽中的主要成分進行液相分析和分離純化，經(jīng)NMR鑒定并與相關(guān)文獻數(shù)據(jù)[1]對照確證為芹菜素。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)復(fù)方鵝絨藤的藥味組成及其制備工藝，本文采用高效液相色譜首次建立了該方中兩種黃酮類成分的含量測定方法(圖1)。該方法操作簡便，結(jié)果準確，方法學(xué)評價可行，可為復(fù)方鵝絨藤及其中的鵝絨藤、白花菜籽兩種藥材的質(zhì)量控制標準提供參考。

[1]馮建勇, 陳虹, 孫燕, 等．鵝絨藤地上部位化學(xué)成分研究[J]．中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2013, 30(3): 274-277．

[2]馮建勇, 孫燕, 陳虹, 等．HPLC法同時測定鵝絨藤中2種黃酮類成分的含量[J]．中國藥房, 2013, 24(23): 2175-2177．

[3]馬艷, 周鳳琴. 民間藥鵝絨藤化學(xué)成分藥理及臨床應(yīng)用研究概況[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2010, 28(2): 289-291.

[4]許紅平, 水棟, 徐泉, 等. 鵝絨藤醇提物各組分清除自由基的研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2014, 25(7): 1558-1559．

[5]李洋, 王琦. 鵝絨藤三種單體化合物體外抗腫瘤活性的研究[J]. 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2013, 35(6): 622-625．

[6]李洋, 王琦. 鵝絨藤中的黃酮苷類誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的研究[J]. 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2014, 36(1): 17-20．

[7]呂幫玉，何玉池．白花菜的研究進展[J]．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2014, (3): 74-75．

(編輯：程鵬飛)

Determination of Two Flavonoids in Compound Cynanchum Chinensis Extract by HPLC

WANG Zengshang1LI Qiang2SHENG Fangting1ZHAXI Baizhen1LIU Jiangyun1*CHEN Hong1

1. College of Pharmaceutical Sciences, SooChow University,Suzhou 215123, China;2. School of Pharmacy, Shihezi University,Shihezi 832000, China

Objective To establish a method for determination of both tricin-7-O-β-D-glucuronide and apigenin in Compound Cynanchum Chinensis Extract by HPLC. Method A HPLCsystem was applied, using a Cosmosil C18-AR-Ⅱ(4.6mm×250mm,5μm) column; mobile phase consisted of cetonitrile-1% acetic acid aqueous solution under gradient elution; the detection wavelength was set at 330 nm; the flow rate was 1.0 mL/min and thetemperature of column was maintained at 30℃. Results As for tricin-7-O-β-D-glucuronide and apigenin, the linear range was between 4.004～40.04μg (R2= 0.9996) and 1.996～19.96μg (R2=0.9990), with average recovery rate to be 98.1% and98.4% respectively.Conclusion The method developed is simple, rapid with reliable results. The contents of both tricin-7-O-β-D-glucuronide and apigenin could be quantified simultaneously, which may be applied for the quality control of the Compound Cynanchum Chinensis extract.

CynanchumChinensis;Cleomegynandra;Tricin-7-O-β-D-Glucuronide;Apigenin;Determination

2016-07-25

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團科技援疆專項(2014AB046)。

王増尚(1992-)，男，壯族，碩士研究生在讀，研究方向為天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。E-mail:1207756820@qq.com

劉江云，博士，副教授，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。E-mail：liujiangyun@suda.edu.cn

R248.1

A

1007-8517(2016)20-0030-03