新生兒退黃中藥洗液對溶血性黃疸大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究

王艷寧 朱世龍 吳曙粵

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬南寧市第一人民醫(yī)院，廣西 南寧 530022

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實(shí)驗(yàn)研究

新生兒退黃中藥洗液對溶血性黃疸大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究

王艷寧 朱世龍 吳曙粵*

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬南寧市第一人民醫(yī)院，廣西 南寧 530022

目的：分析新生兒退黃中藥洗液對乙酰苯肼(APH)所致大鼠溶血性貧血模型的退黃作用。方法：50只大鼠隨機(jī)分為正常組(10只)和APH處理組(40只)。將APH 150 mg/kg腹腔注射大鼠，48h后經(jīng)APH處理的大鼠隨機(jī)分為陽性對照組及新生兒退黃中藥洗液高、中、低劑量組(藥液分別稀釋5、10、50倍)，每組10只。正常組、陽性對照組大鼠每天給予自來水泡浴，洗液組予洗液泡浴15min，連續(xù)3 d。泡浴結(jié)束后摘眼球取血測定大鼠血清總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽汁酸(TBA)；并觀察大鼠心肝肺腎的生理形態(tài)。結(jié)果：APH處理組大鼠肝功能受損，肝臟組織切片示肝血竇有擴(kuò)張、充血及肝總管內(nèi)鐵血黃素淤積、膽紅素淤積的程度較正常組高，心肺腎組織無明顯變化；血清肝功能各項(xiàng)指標(biāo)較正常組明顯升高(P<0.01)。各濃度退黃外洗液組與陽性對照組比較，血清肝功能指標(biāo)均下降并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，但組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論：新生兒退黃中藥洗液對APH所致的大鼠溶血性黃疸均有退黃、降酶作用，各濃度組效果相當(dāng)，且對心肝肺腎無組織損害。

新生兒退黃中藥洗液；乙酰苯肼；大鼠；溶血性黃疸模型

新生兒退黃中藥洗液來源于我院吳曙粵主任醫(yī)師多年臨床經(jīng)驗(yàn)方，該方主要成分為茵陳、大黃、山梔子、柴胡等15味中藥組成，有利膽、消炎、保肝、退黃作用[1]，并獲國家發(fā)明專利(專利號：Zl200510019562.1)。臨床上泡浴用于新生兒黃疸患兒，取得了良好效果[2]，研究以乙酰苯肼(APH)腹腔注射大鼠制成溶血性黃疸模型，通過檢測經(jīng)新生兒退黃中藥洗液泡浴后溶血性黃疸大鼠的血清肝功能的相關(guān)指標(biāo)血清總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽汁酸(TBA)的水平并觀察心肝肺腎等組織的病理變化，探討洗液對溶血性黃疸大鼠的退黃利膽作用。

1 儀器與材料

1.1 動物 健康SD大鼠50只，雌雄不分，體質(zhì)量(200±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號SCXK桂2009-0002，廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心恒溫飼養(yǎng)，自由飲水并喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。

1.2 藥物 新生兒退黃中藥洗液(自制，登記號為20120412，250mL/瓶)，分別將新生兒退黃中藥洗液原液(生藥量為3g/mL)稀釋為5倍、10倍、50倍，制成高、中、低濃度洗液，即濃度分別為600mg/mL、300mg/mL、60mg/mL。

1.3 儀器 日立7600全自動生化分析儀；DT5-3離心機(jī)(北京時代北利離心機(jī)有限公司)；JY5002電子天平(上海志榮電子科技有限公司)；Excelsior ES型自動脫水機(jī)、Finesse325切片機(jī)(英國珊頓公司)； YB-6LF冷凍包埋機(jī)、YR-14染色機(jī)(湖北亞光公司)； BA400型光學(xué)顯微鏡(中國Motio公司)。

1.4 試劑 乙酰苯肼(批號：120929，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；總膽紅素測定試劑盒-TBIL(批號：17066)、直接膽紅素測定試劑盒-DBIL(批號：16932)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒-ALT(批號：27031)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒AST(批號：26026)、總膽汁酸測定試劑盒-TBA(批號：10089)均購自德國DiaSys公司。

2 方法

2.1 動物分組與造模 50只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為正常組(10只)和乙酰苯肼處理組(40只)。將乙酰苯肼[3](APH)150 mg/kg腹腔注射大鼠，48h后[4]經(jīng)乙酰苯肼處理后的大鼠成為紅細(xì)胞氧化性溶血黃疸大鼠，再將這40只溶血性黃疸大鼠隨機(jī)分為陽性對照組(10只)、新生兒退黃中藥洗液高、中、低劑量組，每組10只。各洗液組給予38℃高、中、低濃度洗液1 000mL泡浴15min，1次/d，連續(xù)3d；正常組和陽性對照組給予等容積38℃自來水泡浴15min，1次/d，連續(xù)3d。

2.2 血清肝功能檢測 各組大鼠第三天藥浴或水浴結(jié)束1h后眼球取血2mL，用離心機(jī)3000r/min離心10 min，分離血清。按試劑盒說明書操作(TBIL/DBIL的測定使用釩酸鹽氧化法，ALT/AST使用底物法，TBA使用酶循環(huán)法)，用全自動生化分析儀測定血清中TBIL、DBIL、ALT、AST、TBA的活性。另間接膽紅素(IBIL)=TBIL-DBIL。

2.3 心肝肺腎肝組織形態(tài)的觀察 經(jīng)眼球取血的大鼠立即處死，摘取心、肝、肺、腎臟，分別切取1.0cm×0.8cm×0.3 cm 心、肝、肺、腎組織1 塊，10%中性甲醛固定1周，逐級酒精脫水、二甲苯透明、浸臘、包埋、切片，片厚6μm，采用HE 染色方法，光鏡觀察各切片的組織形態(tài)。

心臟切片觀察有無心肌細(xì)胞壞死；腎臟切片觀察腎小球、腎小管的形態(tài)結(jié)構(gòu)是否正常，腎小管內(nèi)是否為膽紅素管型；肝臟切片觀察肝細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)是否正常，膽管(肝管)是否有膽汁淤積，肝血竇中是否有擴(kuò)張、充血、含鐵血黃素淤積以及膽紅素的淤積。肺臟切片觀察肺間質(zhì)是否有充血、水腫以及肺泡隔是否有充血。并以輕、中、重度作為量化指標(biāo)。

3 結(jié)果

3.1 大鼠肝功能變化 經(jīng)乙酰苯肼造模后大鼠(陽性對照組、洗液各組)的血清肝功能指標(biāo)TBIL、DBIL、IBIL、AST、ALT、TBA 均較正常組明顯升高(P<0.01)，且以間接膽紅素升高為主；高、中、低濃度洗液組血清TBIL、DBIL、IBIL、AST、ALT、TBA低于陽性對照組(P<0.05)，并高于正常組(P<0.05)，組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 新生兒退黃中藥洗液對ANT致大鼠溶血性黃疸模型肝功能的影響 ±s，n=10)

注：與正常組相比，△P<0.01；與陽性對照組相比，*P<0.05。

3.2 大鼠各組織病理切片的結(jié)果 各組大鼠的心臟、肺臟、腎臟肉眼未見明顯病變，鏡下組織切片亦未見異常：心肌細(xì)胞無壞死；腎小球、腎小管的形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無膽紅素管型；肺臟肺間質(zhì)無充血、水腫、肺泡隔無充血。在肝臟的組織病理比較中，除陽性對照組的肝臟肉眼可見輕微腫脹外，其余各組的肝臟肉眼未見明顯異常。陽性對照組肝臟組織切片鏡下見肝組織結(jié)構(gòu)有明顯損害：肝血竇有輕中度擴(kuò)張、充血；肝、膽管、肝管細(xì)胞及間隙見有棕黃色溶血浸潤(示有鐵血黃素淤積以及膽紅素的淤積)。而正常組、洗液高、中、低濃度組則未見明顯的肝血竇擴(kuò)張和充血、無鐵血黃素淤積。見圖1。

4 討論

APH誘導(dǎo)的大鼠溶血性黃疸是常見的造模方法。APH是強(qiáng)氧化劑，通過干擾還原型谷胱甘肽的生成使紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定性遭到破壞致溶血性黃疸[5-6]。實(shí)驗(yàn)中，陽性對照組血清的ALT，AST，TBIL 含量較正常組均顯著升高(P<0.01)，并以間接膽紅素升高為主。另外，在肝組織病理切片可見陽性對照組的肝血竇擴(kuò)張，充血明顯，鐵血黃素淤積程度較正常組明顯，表明造模成功。通過動物模型，可從機(jī)理探討疾病病理生理變化與中醫(yī)證候特征之間的關(guān)系[7]，并進(jìn)行了以APH 150mg/kg腹腔注射大鼠，取得良好的效果，實(shí)驗(yàn)中無大鼠的死亡。

經(jīng)高、中、低濃度洗液組干預(yù)后的黃疸大鼠血清TBIL、DBIL、IBIL、AST、ALT、TBA含量均明顯低于陽性對照組(P<0.05)，但仍與正常組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明洗液可降低APH所致的血清肝功能損害，降低黃疸水平，但未能根本糾正。各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明實(shí)驗(yàn)中選擇的3種濃度新生兒退黃洗液均有效，其退黃效果相當(dāng)。另外各洗液組大鼠心肺腎組織切片均示為正常組織，表明洗液安全，對大鼠的心肺腎臟無明顯毒性損害。并可減輕溶血性黃疸大鼠的鐵血膽紅素的淤積。其退黃機(jī)理可能與模型大鼠通過藥液泡浴，藥物透皮吸收，進(jìn)入體循環(huán)而降低大鼠膽紅素、改善肝功能的作用有關(guān)。

新生兒退黃中藥洗液中主要成分為茵陳、大黃、梔子和甘草等，具有利濕退黃、疏肝理氣、通便活血等作用。茵陳具有抗脂質(zhì)過氧化和防止肝細(xì)胞壞死及肝脂肪變性的作用[8]。大黃通過減少膽汁酸及其他有害物質(zhì)在肝臟中的蓄積，起到保肝利膽的作用[9]。茵陳、梔子可通過還原組織中活性氧簇、誘導(dǎo)膽紅素產(chǎn)生限速酶血紅素加氧酶-1(HO-1)水平上調(diào)等機(jī)制達(dá)到減少膽紅素產(chǎn)生、抗氧化作用，并可改善肝損害[10]。通過泡浴的方式，洗液中有效成分通過皮膚吸收，達(dá)到促進(jìn)膽汁分泌及排泄,降低膽紅素的功效。

綜上所述，新生兒退黃中藥洗液通過促進(jìn)大鼠血清膽紅素代謝排出、保肝利膽從而達(dá)到退黃的作用。

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(編輯：陶希睿)

2016-07-29

廣西科學(xué)研究技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科自0832278)，廣西科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(桂科攻1298003-6-7)。

王艷寧(1971-)，女，副主任藥師，主要從事臨床藥學(xué)研究。E-mail：523657993@qq.com

吳曙粵(1963-)，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事醫(yī)院管理，兒科學(xué)等。E-mail：wushuyue@163.com

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