位置功能候選基因HMGA1、C6orf106和ENSSSCG00000023160與豬肢蹄結(jié)實(shí)度的關(guān)聯(lián)性

張徐非，候利娟，邱恒清，黃路生，郭源梅

（1溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，浙江溫州 325000；2江西農(nóng)業(yè)大學(xué)種豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045）

位置功能候選基因HMGA1、C6orf106和ENSSSCG00000023160與豬肢蹄結(jié)實(shí)度的關(guān)聯(lián)性

張徐非1，2，候利娟2，邱恒清2，黃路生2，郭源梅2

（1溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，浙江溫州 325000；2江西農(nóng)業(yè)大學(xué)種豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045）

【目的】建立一種通過(guò)內(nèi)在的四肢骨關(guān)節(jié)評(píng)分來(lái)評(píng)估豬肢蹄結(jié)實(shí)度的方法，并計(jì)算關(guān)節(jié)評(píng)分與表觀評(píng)估的肢蹄結(jié)實(shí)度之間的相關(guān)系數(shù)。此外，在F2、萊蕪、二花臉、蘇太和杜長(zhǎng)大5個(gè)豬群中，研究三個(gè)位置功能候選基因HMGA1、C6orf106和ENSSSCG00000023160與豬肢蹄結(jié)實(shí)度之間的關(guān)聯(lián)性?！痉椒ā扛鶕?jù)關(guān)節(jié)面裂痕的大小和深淺以及損傷的嚴(yán)重程度，對(duì)5塊四肢骨的關(guān)節(jié)進(jìn)行評(píng)分（1—5分）。如果關(guān)節(jié)面裂痕很大且很深，或損傷很?chē)?yán)重，則評(píng)為1分；如果關(guān)節(jié)面沒(méi)有裂痕和損傷，則評(píng)為5分。評(píng)分越高，說(shuō)明關(guān)節(jié)越健康，肢蹄越結(jié)實(shí)。此外，基于筆者前期全基因組關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果，在豬7號(hào)染色體最強(qiáng)關(guān)聯(lián)SNP兩側(cè)翼各0.2 Mb的區(qū)域內(nèi)，篩選出HMGA1、C6orf106和ENSSSCG00000023160三個(gè)位置功能候選基因。在F2群體中，通過(guò)基因測(cè)序，搜尋這3個(gè)基因的多態(tài)位點(diǎn)，并根據(jù)多態(tài)位點(diǎn)在6個(gè)物種間的保守性，篩選出11個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。利用Taqman探針，對(duì)3個(gè)HMGA1位點(diǎn)和3個(gè)C6orf106位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，而另一個(gè)基因的5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)則通過(guò)基因型填補(bǔ)（genotype imputation）方法進(jìn)行基因分型。最后，利用R軟件GenABEL程序包，分析最小等位基因頻率（MAF）大于0.05的多態(tài)位點(diǎn)與肢蹄結(jié)實(shí)度之間的關(guān)聯(lián)性。【結(jié)果】在C6orf106和ENSSSCG00000023160基因中，分別鑒別到174和5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。關(guān)節(jié)評(píng)分之間呈顯著的正相關(guān)，絕大部關(guān)節(jié)評(píng)分與蹄趾、肢蹄和步態(tài)評(píng)分之間無(wú)相關(guān)，而與肱二頭肌長(zhǎng)度和重量呈顯著的負(fù)相關(guān)。公豬的肩胛骨關(guān)節(jié)評(píng)分極顯著低于母豬的評(píng)分，但是臂骨肩關(guān)節(jié)和后肢跗關(guān)節(jié)評(píng)分顯著高于母豬相應(yīng)的關(guān)節(jié)評(píng)分。在F2群體中，3個(gè)候選基因均與肢蹄結(jié)實(shí)度關(guān)聯(lián)，但是ENSSSCG00000023160的關(guān)聯(lián)程度不如另外2個(gè)基因強(qiáng)，可以排除它為肢蹄結(jié)實(shí)度的因果基因。因此，該基因沒(méi)有在其余的4個(gè)群體中進(jìn)行檢測(cè)。在二花臉群體中，HMGA1的g.2029C＞T和g.3155A＞G位點(diǎn)均與肢蹄結(jié)實(shí)度關(guān)聯(lián)，另一個(gè)位點(diǎn)的MAF小于0.05。在其它3個(gè)群體中，HMGA1 3個(gè)位點(diǎn)的MAF都小于0.05。在萊蕪群體中，僅C6orf106的g.6953T＞C位點(diǎn)的MAF大于0.05，該位點(diǎn)與肢蹄結(jié)實(shí)度顯著關(guān)聯(lián)。在蘇太和杜長(zhǎng)大群體中，C6orf106的g.2054T＞C和g.6953T＞C位點(diǎn)的MAF大于0.05，但它們與肢蹄結(jié)實(shí)度性狀之間無(wú)顯著關(guān)聯(lián)?！窘Y(jié)論】建立了一套利用四肢骨關(guān)節(jié)評(píng)分來(lái)評(píng)估肢蹄結(jié)實(shí)度的方法，該方法是對(duì)現(xiàn)有的表觀評(píng)估方法的重要補(bǔ)充。因?yàn)樘阒骸⒅愫筒綉B(tài)評(píng)分與關(guān)節(jié)評(píng)分無(wú)相關(guān)，所以它們不能取代關(guān)節(jié)評(píng)分。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果排除了ENSSSCG00000023160是肢蹄結(jié)實(shí)度因果基因，但沒(méi)有排除HMGA1和C6orf106的可能性，因此，有必要對(duì)這2個(gè)基因進(jìn)行更深入的研究。

豬；肢蹄結(jié)實(shí)度；關(guān)節(jié)評(píng)分；關(guān)聯(lián)分析；基因型填補(bǔ)

0 引言

【研究意義】肢蹄結(jié)實(shí)度反映豬前后肢蹄的結(jié)實(shí)程度，一般通過(guò)外在的肢蹄評(píng)分和步態(tài)評(píng)分來(lái)度量［1］。不結(jié)實(shí)的肢蹄是一種病，稱為肢蹄軟弱（leg weakness）。豬肢蹄軟弱發(fā)病率高，病因復(fù)雜，且難以治愈，導(dǎo)致大量種豬和生產(chǎn)母豬被動(dòng)淘汰。據(jù)報(bào)道：在通過(guò)了生產(chǎn)性能測(cè)定的后備公豬中，有20%—50%的后備公豬因肢蹄軟弱而被淘汰［2-3］；在生產(chǎn)母豬中，也有6.1%—15%的母豬因肢蹄軟弱而被淘汰［4］。肢蹄結(jié)實(shí)度作為一個(gè)復(fù)雜性狀，它受遺傳和環(huán)境因素的共同影響。豬肢蹄結(jié)實(shí)度具有中等遺傳力，其遺傳力為0.1—0.5［3，5-7］。ROTHSCHILD等在一個(gè)杜洛克群體中對(duì)肢蹄結(jié)實(shí)度進(jìn)行5個(gè)世代的歧化選擇后，正向選擇群體的肢蹄結(jié)實(shí)度顯著高于反向選擇群體［7］。因此，對(duì)肢蹄結(jié)實(shí)度的遺傳解析可以為它的遺傳改良奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】利用全基組連鎖分析，定位了很多肢蹄結(jié)實(shí)度的數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus， QTL）；通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析（genomewide association analysis，GWAS），鑒別了一些與肢蹄結(jié)實(shí)度關(guān)聯(lián)的單核苷多態(tài)（single nucleotide polymorphism，SNP）。在豬的QTL數(shù)據(jù)庫(kù)中，一共收錄了278個(gè)控制肢蹄結(jié)實(shí)度的QTL或與之關(guān)聯(lián)的SNP［8］。本研究小組在白色杜洛克×二花臉的F2資源家系中，利用183個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，通過(guò)全基因組掃描，一共定位到42個(gè)影響肢蹄結(jié)實(shí)度的QTL，其中7號(hào)染色體SW1856—S0102區(qū)間內(nèi)的QTL效應(yīng)最大、置信區(qū)間最小（只有6 cM）［9］。利用Illumina公司豬60K SNP芯片，在該F2資源群體和蘇太群體中，通過(guò)GWAS，將影響前后肢步態(tài)評(píng)分的基因位點(diǎn)定位在7號(hào)染色體上一個(gè)2.15 Mb的連鎖不平衡框內(nèi)，其最強(qiáng)關(guān)聯(lián)的SNP為35.18 Mb的MARC0033464［10］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)肢蹄結(jié)實(shí)度的測(cè)定僅停留在外觀上，缺乏一種內(nèi)在的評(píng)估方法。另外，7號(hào)染色體最強(qiáng)關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)的基因與肢蹄結(jié)實(shí)之間度的關(guān)聯(lián)也沒(méi)有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】建立一種通過(guò)內(nèi)在的關(guān)節(jié)評(píng)分來(lái)度量肢蹄結(jié)實(shí)度的方法，并與現(xiàn)有方法作比較，評(píng)估該方法的必要性。另外，在7號(hào)染色體最強(qiáng)關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)篩選3個(gè)位置功能候選基因，并對(duì)其多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行搜尋，然后在每個(gè)候選基因中篩選3個(gè)保守的多態(tài)位點(diǎn)，在F2、蘇太、萊蕪、二花臉和杜長(zhǎng)大5個(gè)群體中進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，尋找與肢蹄結(jié)實(shí)度顯著關(guān)聯(lián)的多態(tài)位點(diǎn)，為肢蹄結(jié)實(shí)度的標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)群體 本研究一共用了5個(gè)試驗(yàn)豬群，即F2資源群體、蘇太豬、二花臉、萊蕪豬和杜長(zhǎng)大群體。F2資源群體以2頭白色杜洛克公豬和17頭二花臉母豬為親本，雜交產(chǎn)生F2代［11］。蘇太豬是杜洛克公豬和太湖母豬雜交，經(jīng)19個(gè)世代對(duì)繁殖和生長(zhǎng)性狀的選育，培育而成的母系品種［10］。331頭二花臉和314頭萊蕪豬分別購(gòu)自江蘇省焦西二花臉合作社和山東省萊蕪原種豬場(chǎng)。在4—5月齡從購(gòu)買(mǎi)豬場(chǎng)運(yùn)至江西省南昌市國(guó)鴻生態(tài)園豬場(chǎng)進(jìn)行肥育。二花臉公母豬均進(jìn)行了閹割，萊蕪豬只對(duì)公豬進(jìn)行閹割。這4個(gè)群體在肥育期間均飼喂含3 100 kJ可消化能、16%粗蛋白和0.78%賴氨酸的全價(jià)配合飼料，自由采食和飲水，且采用相同的飼養(yǎng)管理方式，自由采食和飲水。F2資源群體和蘇太豬在240日齡左右屠宰，二花臉和萊蕪豬在300日齡左右屠宰。610頭杜長(zhǎng)大來(lái)自江西國(guó)鴻集團(tuán)修水商品豬場(chǎng)。公豬在出生時(shí)閹割，母豬不閹割。分階段飼喂相應(yīng)的配合飼料，自由采食和飲水，體重在110 kg左右屠宰。

1.1.2 表型測(cè)定 各個(gè)表型的測(cè)定，分別由同一人根據(jù)相同的標(biāo)準(zhǔn)在江西省南昌市進(jìn)行測(cè)定。肢蹄評(píng)分和步態(tài)評(píng)分采用GUO等建立的方法在飼養(yǎng)場(chǎng)地進(jìn)行測(cè)定［9］。在F2資源群體（2002—2006年）和蘇太豬（2010—2011年）和萊蕪豬（2012—2014年）群體中，肢蹄評(píng)分和步態(tài)評(píng)分都在220日齡左右進(jìn)行測(cè)定，萊蕪豬（2012—2014年）群體在300日齡左右進(jìn)行評(píng)定。屠宰后，前后蹄從屠體上分割下來(lái)，根據(jù)蹄子的大小、均勻度、受損程度等進(jìn)行評(píng)分。蹄子大、均勻且沒(méi)有損傷評(píng)5分；蹄子很小、非常不均勻或損傷嚴(yán)重評(píng)1分。左側(cè)的肱二頭肌完整地從前肢剝離下來(lái)，用電子天平和游標(biāo)卡尺分別測(cè)定其重量和長(zhǎng)度。前后肢四肢骨的主要關(guān)節(jié)面，根據(jù)表1的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。

表1 豬關(guān)節(jié)面評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table1 The criteria for joint surface score

1.1.3 基因DNA的提取 個(gè)體屠宰后，用剪刀剪取適量的耳組織或脾臟，貯存于裝有75%的酒精溶液的EP管中備用。采用常規(guī)酚氯仿法從耳組織或脾臟中提取基因組DNA，經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)和濃度測(cè)定后稀釋成50 ng·μL-1的工作液備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 位置功能候選基因的篩選及其SNP的搜尋在7號(hào)染色體上，以最強(qiáng)關(guān)聯(lián)SNP為中心的0.4 Mb范圍內(nèi)一共有6個(gè)基因。HMGA1編碼一種影響軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的非組蛋白［12］；C6orf06基因可能與骨骼生長(zhǎng)相關(guān)，因?yàn)樵贑6orf06和HMGA1區(qū)域內(nèi)鑒別到與人類(lèi)身高顯著關(guān)聯(lián)的SNP［13-15］；ENSSSCG00000023160的功能未知；這3個(gè)基因可能會(huì)影響肢蹄結(jié)實(shí)度，因此把它們作為肢蹄結(jié)實(shí)度的候選基因。RPS10編碼一種核糖體蛋白S10，與人的先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血關(guān)聯(lián)［16］；SPDEF編碼上皮特異性ETs轉(zhuǎn)錄因子，與小腸杯狀細(xì)胞的分化和成熟有關(guān)［17］；PACSIN1編碼神經(jīng)元蛋白激酶C酪蛋白激酶底物1，調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突的延伸和分支［18］；這3個(gè)基因的功能均與肢蹄結(jié)實(shí)度不相關(guān)，因此可以排除。

從Ensembl網(wǎng)站上（http://www.ensembl.org/index. html）獲取豬HMGA1、C6orf106和ENSSSCG00000023160 3個(gè)候選基因的基因組序列。根據(jù)其基因組序列，使用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/）分別設(shè)計(jì)16、50和5對(duì)引物對(duì)這3個(gè)基因的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行搜尋。

HMGA1和C6orf106 SNP基因多態(tài)位點(diǎn)搜尋的模板為3頭F1公豬（耳號(hào)分別為17、29和41號(hào)）組成的DNA池。ENSSSCG00000023160則對(duì)所有的F0代個(gè)體單獨(dú)進(jìn)行測(cè)序，搜尋多態(tài)位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增的有效性，合格的DNA樣品經(jīng)QIAquick DNA純化試劑盒純化后，送上海生工進(jìn)行雙向測(cè)序，獲得所需序列。用DNAStar軟件包的Seqman程序進(jìn)行序列分析，鑒別多態(tài)位點(diǎn)。

1.2.2 多態(tài)位點(diǎn)的篩選及基因型判定 用Clustal W軟件，選取豬、狗、奶牛、人、鼠和兔子6種哺乳動(dòng)物DNA序列，對(duì)C6orf106進(jìn)行保守性分析［19］。選取3個(gè)在這6種動(dòng)物間保守且具有代表性的SNP用于基因判型，并利用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切驗(yàn)證其多態(tài)性。設(shè)計(jì)3對(duì)探針和引物，使用7900HT Fast Real-time PCR System分別對(duì)g.2054T＞C、g.6953T＞C和g34542A＞T進(jìn)行基因分型［20］。

沈虎群對(duì)HMGA1進(jìn)行測(cè)序，搜尋到9個(gè)SNP，并在F2資源群體中對(duì)其中的g.1149C＞T、g.2029C＞T和g.3155A＞G進(jìn)行基因型檢測(cè)［21］。在F2資源群體中，本研究直接使用他的分型結(jié)果。在另外的4個(gè)群體中，對(duì)這3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。

ENSSSCG00000023160基因采用基因型填補(bǔ)法（genotype imputation）來(lái)獲取F2個(gè)體所有多態(tài)位點(diǎn)的基因型［22］。首先對(duì)全部的F0代和F1代個(gè)體的測(cè)序，獲取F0和F1代個(gè)體該基因所有多態(tài)位點(diǎn)的基因型。然后在該基因兩側(cè)翼臨近區(qū)域內(nèi)選取15個(gè)多態(tài)性好的60K SNP芯片上的SNP位點(diǎn)（F0、F1和F2個(gè)體的基因型都已知），與該基因的基因型進(jìn)行整合（F2代個(gè)體的基因型均為缺失），利用SimWalk2.9軟件，構(gòu)建所有個(gè)體的單倍型［23］。最后根據(jù)個(gè)體的單倍型來(lái)重建 F2個(gè)體的基因型。為了評(píng)估基因型填補(bǔ)法的準(zhǔn)確性，在60K SNP芯片中，選取5個(gè)位于該基因兩側(cè)翼、且F0和F1代個(gè)體的基因型分別與該基因5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)相類(lèi)似的SNP，保留F0和F1代個(gè)體的基因型，把F2個(gè)體的基因型設(shè)為缺失，通過(guò)上述方法獲取F2個(gè)體的基因。芯片檢測(cè)的基因型和基因填補(bǔ)獲得的基因型之間吻合度可以用來(lái)評(píng)估基因填補(bǔ)的準(zhǔn)確性。吻合度越高，基因型填補(bǔ)法獲取的基因型就越準(zhǔn)確。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

1.3.1 表型相關(guān)及性別差異檢驗(yàn) 表型簡(jiǎn)單統(tǒng)計(jì)量的計(jì)算及性別差異檢驗(yàn)都在統(tǒng)計(jì)軟件SAS9.0（SAS Institute Inc.， Cary， NC， USA）上完成的。CORR過(guò)程用于計(jì)算表型之間的簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)；TTEST過(guò)程檢驗(yàn)表型在性別之間的差異。

1.3.2 關(guān)聯(lián)分析 利用R軟件中的GenABEL軟件包，使用下面模型對(duì)肢蹄結(jié)實(shí)度相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析［24］：

其中，y是表型向量；b是固定效應(yīng)向量，包括性別和批次，分析肱二頭肌長(zhǎng)度和重量是還包括胴體重；u是加性遺傳效應(yīng)向量，服從N（0， G σ2α），G為基因組親緣關(guān)系矩陣，利用豬60K芯片常染色體上SNP的計(jì)算得到［25-26］；σ2α為加性方差；a為SNP等位基因的替代效應(yīng)；X和Z分別為b和u的指示矩陣；s是a的指示向量；e是殘差向量，服從N（0， Iσ2e）。

2 結(jié)果

2.1 多態(tài)位點(diǎn)搜尋

設(shè)計(jì)了50對(duì)引物對(duì)C6orf106進(jìn)行全基因多態(tài)位點(diǎn)的搜尋，一共搜尋到多態(tài)位點(diǎn)個(gè)SNP［20］。用Clustal W軟件對(duì)這174個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行保守性分析，有9個(gè)SNP在豬、狗、奶牛、人、鼠和兔子中是保守的［20］。從這9個(gè)保守的SNP中，選取3個(gè)具有代表的SNP，即g.2054T＞C、g.6953T＞C和g34542A＞T，在這5個(gè)群體進(jìn)行基因分型。

設(shè)計(jì)了5對(duì)引物對(duì)ENSSSCG00000023160進(jìn)行全基因多態(tài)位點(diǎn)的搜尋，一共搜尋得到5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，即g.1129G＞C、g.2284C＞G、g.2430C＞T、g.2813G＞A和g.3231AA＞--。利用基因填補(bǔ)法獲取F2資源群體中F2個(gè)體的基因型。根據(jù)兩側(cè)翼5個(gè)SNP的基因填補(bǔ)的模擬結(jié)果，基因填補(bǔ)的錯(cuò)誤率分別為2.73%、0、0.2%、1.0%和0.4%。

表2 性狀之間的表型相關(guān)系數(shù)Table2 The phenotypic correlation coefficients among the measured traits

2.2 多態(tài)位點(diǎn)判型

在資源家系F2群體中，3個(gè)候選基因的11個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的最小等位基因頻率（MAF）均大于0.3。在其余4個(gè)群體中，只對(duì)C6orf106和HMGA1的6個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了分型。在蘇太和杜長(zhǎng)大群體中，只有C6orf106前2個(gè)位點(diǎn)的MAF大于0.05；在二花臉群體中，只有HMGA1后2個(gè)位點(diǎn)的MAF大于0.05；在萊蕪豬群體中，只有C6orf106第2個(gè)位點(diǎn)的MAF大于0.05。MAF大于0.05的位點(diǎn)用于后續(xù)的關(guān)聯(lián)分析。

2.3 表型相關(guān)分析

在萊蕪、二花臉和杜長(zhǎng)大混合群體中，表型之間的簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。肱二頭肌長(zhǎng)度和重量與前后蹄和前后肢肢蹄評(píng)分之間呈極顯著正相關(guān)，而與關(guān)節(jié)評(píng)分之間呈顯著負(fù)相關(guān)（除肱二頭肌重量和前臂骨腕關(guān)節(jié)評(píng)分不顯著之外）。肱二頭肌長(zhǎng)度與前肢步態(tài)評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)，與后肢步態(tài)評(píng)分不相關(guān)。肱二頭肌重量與前肢步態(tài)評(píng)分不相關(guān)，與后肢步態(tài)評(píng)分呈顯著正相關(guān)。前蹄評(píng)分除了與肱二頭肌長(zhǎng)度和重量以及后蹄評(píng)分呈正相關(guān)外，還與臂骨肩關(guān)節(jié)、前臂骨肘關(guān)節(jié)、前臂骨腕關(guān)節(jié)和股骨髖關(guān)節(jié)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與其他性狀不相關(guān)。后蹄評(píng)分除了與肱二頭肌長(zhǎng)度和重量以及前蹄評(píng)分呈正相關(guān)外，還與肩胛骨關(guān)節(jié)和臂骨肘關(guān)節(jié)評(píng)分呈顯著的負(fù)相關(guān)，與肢蹄評(píng)分和步態(tài)評(píng)分呈顯著正相關(guān)，與其他性狀不相關(guān)。關(guān)節(jié)評(píng)分之間呈顯著正相關(guān)（除肩胛骨關(guān)節(jié)與前臂骨肘關(guān)節(jié)評(píng)分以及前臂骨腕關(guān)節(jié)與肩胛骨關(guān)節(jié)、臂骨肘關(guān)節(jié)和小腿骨跗關(guān)節(jié)評(píng)分之間無(wú)相關(guān)外），與肢蹄和步態(tài)評(píng)分之間無(wú)相關(guān)（除股骨膝關(guān)節(jié)評(píng)分與前肢肢蹄和步態(tài)評(píng)分呈正相關(guān)、前臂骨腕關(guān)節(jié)評(píng)分與后肢肢蹄和步態(tài)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)以及臂骨肩關(guān)節(jié)評(píng)分和前肢步態(tài)評(píng)分呈正相關(guān)外）。肢蹄與步態(tài)之間呈極顯著的正相關(guān)。后肢跗關(guān)節(jié)評(píng)分只在杜長(zhǎng)大群體中進(jìn)行了測(cè)量，它與前蹄評(píng)分（r= 0.0172，P= 0.6726）和后蹄評(píng)分（r= 0.0612，P= 0.1322）之間無(wú)相關(guān)。

2.4 性別差異檢驗(yàn)

性別對(duì)表型的影響見(jiàn)表3。公豬的肩胛骨關(guān)節(jié)評(píng)分極顯著低于母豬的肩胛骨關(guān)節(jié)評(píng)分，但是臂骨肩關(guān)節(jié)和后肢跗關(guān)節(jié)評(píng)分顯著高于母豬的相應(yīng)關(guān)節(jié)的評(píng)分，其余性狀在性別之間沒(méi)有顯著差異。

表3 不同性別對(duì)肢蹄結(jié)實(shí)度的影響Table3 The effects of sexes on the measured traits

2.5 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

在F2資源群體中，11個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與肢蹄結(jié)實(shí)度關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見(jiàn)表4。HMGA1基因的g.2029C＞T和g.3155A＞G位點(diǎn)與肱二頭肌長(zhǎng)度和重量、肢蹄評(píng)分和步態(tài)評(píng)分6個(gè)性狀均顯著關(guān)聯(lián)，而g.1149C＞T位點(diǎn)與肢蹄評(píng)分和前肢步態(tài)評(píng)分顯著關(guān)聯(lián)，與另外3個(gè)性狀不關(guān)聯(lián)。C6orf106基因的g.34542A＞T位點(diǎn)與6個(gè)性狀均顯著關(guān)聯(lián)，而另外2個(gè)位點(diǎn)與步態(tài)評(píng)分和前肢肢蹄評(píng)分顯著關(guān)聯(lián)，與另外3個(gè)性狀不關(guān)聯(lián)。ENSSSCG00000023160基因不與肱二頭肌重量關(guān)聯(lián)。在剩下的5個(gè)性狀中，g.2430C＞T和g.3231AA＞--位點(diǎn)與它們顯著關(guān)聯(lián)，g.2284C＞G和g.1129G＞C位點(diǎn)分別與除前肢肢蹄評(píng)分和肱二頭肌長(zhǎng)度之外的4個(gè)性狀顯著關(guān)聯(lián)，而另一個(gè)位點(diǎn)不與任何性狀關(guān)聯(lián)。在這11個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中，HMGA1的g.3155A＞G與前肢步態(tài)評(píng)分的關(guān)聯(lián)程度最強(qiáng)。

表4 F2資源群體中11個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與肢蹄結(jié)實(shí)度關(guān)聯(lián)分析Table4 The association analysis results between 11 loci and leg soundness in the F2population

在其余4個(gè)群體中，HMGA1和C6orf106與肢蹄結(jié)實(shí)度關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見(jiàn)表5。在萊蕪群體中，只有C6orf106的g.6953T＞C位點(diǎn)的MAF大于0.05。該位點(diǎn)與臂骨肩關(guān)節(jié)、股骨膝關(guān)節(jié)、后肢步態(tài)和前臂骨肘關(guān)節(jié)評(píng)分顯著關(guān)聯(lián)，與其余性狀之間不關(guān)聯(lián)。在二花臉群體中，只有HMGA1的g.2029C＞T和g.3155A＞G位點(diǎn)的MAF大于0.05。前者與股骨髖關(guān)節(jié)評(píng)分極顯著關(guān)聯(lián)，后者與股骨髖關(guān)節(jié)和臂骨肘關(guān)節(jié)評(píng)分極顯著關(guān)聯(lián)，與其余性狀不關(guān)聯(lián)。在蘇太和杜長(zhǎng)大群體中，只有C6orf106的g.2054T＞C和g.6953T＞C位點(diǎn)的MAF大于0.05，但它們均與肢蹄結(jié)實(shí)度性狀之間不關(guān)聯(lián)。

3 討論

本研究一共使用了5個(gè)試驗(yàn)豬群。選擇了F2群體是因?yàn)?號(hào)染色體上的QTL是在F2資源群體中鑒別到的。因此，只有在這群體中顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，才有可能是因果突變位點(diǎn)。蘇太豬與F2資源群體有相似的來(lái)源，他們的祖代都是杜洛克和二花臉。但是蘇太豬經(jīng)歷了18個(gè)世代的重組，連鎖不平衡區(qū)域會(huì)顯著的小于F2群體，因此選擇這個(gè)群體有利于區(qū)分因果位點(diǎn)和連鎖不平衡位點(diǎn)。二花臉是F2資源群體的祖代之一，使用這個(gè)品種有利于了解這個(gè)QTL的起源。萊蕪豬是中國(guó)著名地方品種之一，對(duì)萊蕪豬肢蹄結(jié)實(shí)度的研究，有利于該地方品種的開(kāi)發(fā)和利用。杜長(zhǎng)大是目前中國(guó)商品豬生產(chǎn)的主要雜交模式，在杜長(zhǎng)大群體中開(kāi)展肢蹄結(jié)實(shí)度的研究，可以為商品豬肢蹄結(jié)實(shí)度的分子育種奠定基礎(chǔ)。

群體對(duì)肢蹄結(jié)實(shí)度的影響是極顯著的（數(shù)據(jù)沒(méi)有展示）。杜長(zhǎng)大群體的蹄趾評(píng)分顯著高于兩個(gè)地方品種，二花臉的前蹄趾評(píng)分比萊蕪豬的要高，但是后蹄趾評(píng)分比萊蕪豬要低。蘇太豬的前后肢的肢蹄評(píng)分和步態(tài)評(píng)分均極顯著高于萊蕪豬?？傮w來(lái)說(shuō)二花臉的關(guān)節(jié)評(píng)分比萊蕪豬要高，如肩胛骨關(guān)節(jié)評(píng)分、臂骨肘關(guān)節(jié)評(píng)分、股骨膝關(guān)節(jié)評(píng)分和小腿骨跗關(guān)節(jié)評(píng)分，但萊蕪豬的前臂骨腕關(guān)節(jié)評(píng)分比二花臉的高。

DRAPER等報(bào)道在肢蹄軟弱品系中，肱二頭肌的長(zhǎng)度和重量顯著大于肢蹄正常和結(jié)實(shí)的品系［27］。在F2群體中，前肢步態(tài)評(píng)分與肱二頭肌的長(zhǎng)度和重量呈顯著的負(fù)相關(guān)，而肢蹄評(píng)分與它們呈顯著正相關(guān)［9］。在蘇太群體中，肱二頭肌的長(zhǎng)度和重量與步態(tài)和肢蹄評(píng)分不相關(guān)［10］。在萊蕪、二花臉和杜長(zhǎng)大混合群體中，前肢步態(tài)評(píng)分與肱二頭肌長(zhǎng)度呈顯著的負(fù)相關(guān)，這重復(fù)了前人的結(jié)果。外觀的蹄趾、肢蹄和步態(tài)評(píng)分與關(guān)節(jié)評(píng)分之間不相關(guān)，因此，它們不能替代關(guān)節(jié)評(píng)分。

表5 HMGA1和C6orf106 的4個(gè)SNP與肢蹄結(jié)實(shí)度關(guān)聯(lián)分析Table5 The association analysis results between 4 SNPs of HMGA1 and C6orf106 and leg soundness

在F2群體和蘇太群體中，母豬的肢蹄結(jié)實(shí)度高于公豬［10］。在萊蕪、二花臉和杜長(zhǎng)大混合群體中，公豬的肢蹄和步態(tài)評(píng)分以及肱二頭肌長(zhǎng)度顯著小于母豬的，但是都沒(méi)有達(dá)到顯著水平，這和前人的結(jié)果相似［10］。

在F2群體中，ENSSSCG00000023160 的g.2284C＞G、g.2430C＞T和g.3231AA＞--與前肢步態(tài)評(píng)分相關(guān)聯(lián)，但關(guān)聯(lián)顯著水平不如HMGA1的兩個(gè)位點(diǎn)（表4）。其余位點(diǎn)在不同群體中與肢蹄軟弱的表型性狀關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)，未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平。雖然基因填補(bǔ)存在一定的錯(cuò)誤，導(dǎo)致檢測(cè)效率的下降，但是模擬結(jié)果顯示錯(cuò)誤在3%以下（與前人的結(jié)果類(lèi)似［22］），對(duì)關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果影響不會(huì)很大?；谏鲜鼋Y(jié)果，可以排除該基因?yàn)橹憬Y(jié)實(shí)度的因果基因。因此，在其余的4個(gè)群體中，沒(méi)有必要對(duì)該基因進(jìn)行相關(guān)的研究。

HMGA1能提高軟骨細(xì)胞增殖活性［12］，并通過(guò)調(diào)控透明軟骨細(xì)胞增殖和分化來(lái)影響軟骨組織的修復(fù)［28］。在關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)，HMGA1和IGFBP-3蛋白表達(dá)量均上調(diào)［29］。在F2和二花臉群體中，該基因均與肢蹄結(jié)實(shí)度相關(guān)性狀顯著關(guān)聯(lián)，在其他3個(gè)群體中，該的3個(gè)體位點(diǎn)的MAF小于0.05，沒(méi)有足夠的檢測(cè)效率，因此沒(méi)有進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。因此，它仍有可能是肢蹄結(jié)實(shí)度因果基因。

在F2群體和萊蕪群體中，C6orf106與肢體結(jié)實(shí)度性狀顯著地關(guān)聯(lián)。在二花臉群體中，3個(gè)SNP的MAF均小于0.05。在蘇太和杜長(zhǎng)大群體中，g.34542A＞T位點(diǎn)的MAF小于0.05，另外2個(gè)SNP的MAF雖然大于0.05，但是它們與已測(cè)的肢蹄結(jié)實(shí)度不關(guān)聯(lián)?？紤]到這個(gè)基因還有100多個(gè)多態(tài)位點(diǎn)沒(méi)有檢測(cè)，因此，不能排除其為因果基因的可能性。

4 結(jié)論

本研究建立了一種通過(guò)內(nèi)在的關(guān)節(jié)評(píng)分來(lái)評(píng)估肢蹄結(jié)實(shí)度的方法。相關(guān)分析結(jié)果表明外觀的蹄趾、肢蹄和步態(tài)評(píng)分與關(guān)節(jié)評(píng)分之間無(wú)顯著相關(guān)性，因此，關(guān)節(jié)評(píng)分是對(duì)現(xiàn)有肢蹄結(jié)實(shí)度度量方法的重要補(bǔ)充。性別對(duì)肢蹄結(jié)實(shí)度有顯著的影響，在進(jìn)行肢蹄結(jié)實(shí)度的遺傳解析中，需要考慮性別效應(yīng)。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果排除了ENSSSCG00000023160是肢蹄結(jié)實(shí)度因果基因的可能性，但是HMGA1和C6orf106的可能性沒(méi)有排除，有必要對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行更深入的研究。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

An Association Study of Positional and Functional Candidate Genes HMGA1， C6orf106 and ENSSSCG00000023160 with Leg Soundness in Pigs

ZHANG Xu-fei1，2， HOU Li-juan2， QIU Heng-qing2， HUANG Lu-sheng2， GUO Yuan-mei2

（1Laboratory Animal Center， Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， Zhejiang；2State Key Laboratory for Pig Genetic Improvement and Production Technology， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045）

【Objective】 The objective of this study is to develop a method to access the leg soundness through scoring the joint of limb bone and calculate the simple correlation coefficients among the scores for leg soundness in pigs. Furthermore， the association between three positional and functional candidate genes， namely HMGA1， C6orf106 and ENSSSCG0000023160， and leg soundness was also studied in F2， Laiwu， Erhualian， Sutai and DLY populations.【Method】The joint of five limb bones were scored according to the size and depth of rip on the joint surface and the worn-out degree of the joint. If the rip on the joint surface is very big and deep or the joint is seriously worn out， the joint is scored 1. On the other hand， if there is no rip on the joint surface and the joint doesn’t have any degree of worn-out， the joint is scored 5. Higher the joint score is， healthier the joint is and sounder the leg is. Based on the authors’ previous genome-wide association studies， three genes HMGA1， C6orf106 and ENSSSCG0000023160 were screened as positional and functional candidate genes to leg soundness in a 0.4 Mb region centered on the top SNP on SSC7. To search the polymorphic loci of the three genes in the F2population， their DNA sequences were determined by a short-gun DNA sequence method. A total of 11 polymorphic loci were picked out according to their conservations among 6 species. The genotypes of 3 loci for HMGA1 and 3 loci for C6orf106 were determined using the Taqman method， and the genotypes of the other 5 loci for the third gene were inferred by genotype imputation just in the F2population. At last， the GenABEL package of R was used to perform the association analysis between the loci with MAF＞0.05 and the traits.【Result】A total of 174 and 5 polymorphic loci were identified in C6orf106 and ENSSSCG00000023160 genes， respectively. Joint scores were positively correlated with each other and were negatively correlated with the length and weight of biceps brachii， but most of them had no correlation with toe， leg and gait scores. The male’s scapula joint score was significantly lower than the female’s， but arm shoulder joint score and focile hock joint score were significantly higher than the female’s corresponding joint score. In the F2population， all of the three genes were associated with leg soundness， but ENSSSCG00000023160 was weaker than the other two genes， therefore it was excluded as a candidate gene to leg soundness and was not genotyped in the other 4 populations. In the Erhualian population， two loci g.2029C＞T and g.3155A＞G of HMGA1 were significantly associated with leg soundness， and the other SNP lacked the polymorphism. In the other 3 populations， all of the 3 SNPs of HMGA1 were deficiently polymorphic. Only the g.6953T＞C locus of C6orf106 had enough polymorphic in the Laiwu population， and it was associated with leg soundness. In the Sutai and DLY populations， only two loci g.2054T＞C and g.6953T＞C of C6orf106 were polymorphic， but none was associated with leg soundness.【Conclusion】A method of accessing the leg soundness has been proposed by scoring the joint of limb bones in pigs， and it is a crucial supplement method to access the leg soundness. Because toe， leg and gait scores are not correlation with the joint scores， they can’t replace the joint scores. The association analysis results excluded the ENSSSCG00000023160 gene as candidate gene to leg soundness， but both HMGA1 and C6orf106 genes were not excluded. Therefore， the two genes are worthy for further investigations.

pig； leg soundness； joint score； association analysis； genotype imputation

2015-08-27；接受日期：2016-08-05

國(guó)家自然科學(xué)基金（31060153，31460590）、江西省自然科學(xué)基金（20142BAB204017）

聯(lián)系方式：張徐非，E-mail：604120811@qq.com。候利娟，E-mail：397999166@qq.com。張徐非和候利娟為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者郭源梅，Tel/Fax：0791-83813080；E-mail：gyuanmei@hotmail.com