流式細(xì)胞儀脈沖補(bǔ)償恢復(fù)算法研究

周 進(jìn), 婁小平,2, 張文昌,2, 劉 鋒,2

(1.北京信息科技大學(xué) 光電測試技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192;2.北京信息科技大學(xué) 光電信息與儀器北京市工程研究中心，北京 100192)

?

流式細(xì)胞儀脈沖補(bǔ)償恢復(fù)算法研究

周 進(jìn)1, 婁小平1,2, 張文昌1,2, 劉 鋒1,2

(1.北京信息科技大學(xué) 光電測試技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192;2.北京信息科技大學(xué) 光電信息與儀器北京市工程研究中心，北京 100192)

流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)采集過程中，觸發(fā)閾值的設(shè)定導(dǎo)致脈沖信號信息完整性的缺失,從而造成后續(xù)脈沖參數(shù)提取誤差增大；針對以上問題，根據(jù)流式細(xì)胞儀脈沖信號類高斯特性，利用MATLAB分別采用斜線法、高斯擬合法、拋物線法以及灰色預(yù)測法對閾值以下的脈沖缺失信息進(jìn)行補(bǔ)償恢復(fù)；同時，分別對4種方法補(bǔ)償恢復(fù)后的脈沖進(jìn)行脈沖峰值、脈寬、脈沖面積3個參數(shù)的提取，并進(jìn)行誤差比對；仿真結(jié)果表明，觸發(fā)閾值的設(shè)定主要對脈寬及脈沖面積產(chǎn)生影響；灰色預(yù)測法的脈沖補(bǔ)償恢復(fù)誤差最小，可用于流式細(xì)胞儀底層在線脈沖補(bǔ)償恢復(fù)。

流式細(xì)胞儀;信號預(yù)測;高斯脈沖;脈沖補(bǔ)償

0 引言

流式細(xì)胞儀是融合流體動力學(xué)、激光技術(shù)、電子工程、計(jì)算機(jī)技術(shù)和單克隆抗體染色技術(shù)為一體的新型高科技儀器。利用單一或多路激光，照射形成的單細(xì)胞流中的細(xì)胞，通過采集激發(fā)出來的熒光信息或(和)散射光信號進(jìn)行參數(shù)提取和分析，進(jìn)而對細(xì)胞(人體)的健康狀態(tài)進(jìn)行診斷。在細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞周期動力學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)及腫瘤學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。細(xì)胞中激發(fā)出來的熒光通過光電轉(zhuǎn)換、模擬放大、模數(shù)轉(zhuǎn)換，最終成為數(shù)字信號。數(shù)據(jù)采集過程中脈沖信號參數(shù)提取準(zhǔn)確性將直接影響整機(jī)檢測精度[1-4]。

數(shù)據(jù)采集過程中，為了去除一些雜散噪聲而設(shè)定一個觸發(fā)閾值，觸發(fā)閾值不為零導(dǎo)致脈沖信號閾值以下的信息缺失，目前國內(nèi)外主要用矩形補(bǔ)償?shù)姆椒▽θ笔У男畔⑦M(jìn)行恢復(fù)，矩形補(bǔ)償?shù)膶挾葹殚撝蹬c脈沖信號的相交長度，高度為閾值的大小。然而用此矩形對脈沖信號進(jìn)行補(bǔ)償只是對缺失信息進(jìn)行大致恢復(fù)，信號恢復(fù)精度較低，影響參數(shù)提取中的脈沖面積和脈沖寬度等參數(shù)，進(jìn)而造成流式細(xì)胞儀變異系數(shù)(coefficient of variable, CV)增大[5-10]。

本文借助MATLAB仿真工具，利用疊加了隨機(jī)噪聲的高斯信號模擬實(shí)際流式細(xì)胞儀采集到的數(shù)字信號，分別使用斜線法、高斯擬合法、拋物線法以及灰色預(yù)測法對閾值以下的脈沖信號進(jìn)行補(bǔ)償恢復(fù)，之后對補(bǔ)償恢復(fù)后的脈沖信號進(jìn)行參數(shù)提取并進(jìn)行誤差對比分析。

1 數(shù)據(jù)采集及參數(shù)提取

經(jīng)熒光染料標(biāo)記的細(xì)胞在激光的照射下激發(fā)出特征熒光及散射光，對特定光信號進(jìn)行測量并對表征細(xì)胞特征的脈沖參數(shù)進(jìn)行提取，最終根據(jù)脈沖參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及健康狀態(tài)診斷。其中，數(shù)據(jù)采集過程主要是接收前向散射光(forward scatter, FS)、側(cè)向散射光(side scatter, SS)及各路熒光信號(fluorescence, FLn)，通過光電轉(zhuǎn)換形成電脈沖信號，并對表征細(xì)胞特征的脈沖參數(shù)(峰值、寬度及面積)進(jìn)行快速提取[4]。

由于光電轉(zhuǎn)換之后的電脈沖信號帶有所檢測光脈沖信號的特征，故通過提取電脈沖信號中的參數(shù)(主要有脈沖峰值、脈沖面積和脈沖寬度)即可得到表征細(xì)胞脈沖的狀態(tài)信息。電信號參數(shù)提取的準(zhǔn)確性及實(shí)時性將直接影響到儀器的性能指標(biāo)以及醫(yī)療上進(jìn)行診斷的準(zhǔn)確性。脈沖信號及相應(yīng)參數(shù)定義如圖1所示。

圖1 脈沖參數(shù)示意圖

圖1中的閾值實(shí)際中用作ADC的觸發(fā)電壓，當(dāng)采集到的脈沖信號電壓超過閾值時，ADC開始進(jìn)行模/數(shù)轉(zhuǎn)換。設(shè)定閾值既可以減小由于模數(shù)轉(zhuǎn)換芯片工作在邊界轉(zhuǎn)換狀態(tài)下引入較大的轉(zhuǎn)換誤差，也可以避免由細(xì)胞碎片及其它雜散噪聲等引起的微小脈沖干擾，但同時也會導(dǎo)致信號信息的缺失，使得對脈沖面積及脈沖寬度的提取出現(xiàn)偏差。閾值設(shè)定對脈沖參數(shù)提取的影響如圖2所示。

圖2 閾值對脈沖參數(shù)提取的影響

在圖2中，當(dāng)不進(jìn)行脈沖補(bǔ)償恢復(fù)時，采集到的信號只有閾值之上的數(shù)據(jù)，此時，只能通過利用A2表示脈沖面積，L1表征脈沖寬度。

傳統(tǒng)的矩形脈沖恢復(fù)方法直接利用L1為寬，Th為高的矩形做補(bǔ)償。補(bǔ)償后，A2+A3表示脈沖面積、L1表示脈沖寬度。從圖中可以看出，矩形恢復(fù)算法相較于不進(jìn)行脈沖恢復(fù)，可以將脈沖面積進(jìn)行部分恢復(fù)，但無法對A1及A4進(jìn)行恢復(fù)，若閾值設(shè)置較高則對面積的提取存在比較大的缺失。此外，矩形恢復(fù)算法使脈沖寬度L2得不到補(bǔ)償。

2 脈沖補(bǔ)償恢復(fù)算法

在流式細(xì)胞儀中，熒光和散射光在激光照射下，其產(chǎn)生的脈沖信號具有類高斯特性，故采用疊加了隨機(jī)噪聲的高斯信號對其進(jìn)行表征。

閾值之上的數(shù)據(jù)可以用序列y表示：

(1)

式(1)中，x為表示熒光分布的高斯脈沖序列，r為疊加的隨機(jī)噪聲序列,y={y(1),y(2),…,y(n)}。

結(jié)合現(xiàn)在普遍使用且處理方式較為簡單的方法，對比了以下幾種補(bǔ)償方式：斜線法、高斯擬合法、拋物線法以及灰色預(yù)測法。其中，前3種方法均使用最小二乘法進(jìn)行曲線擬合并完成預(yù)測，灰色預(yù)測方法則利用已知的數(shù)據(jù)構(gòu)建模型對序列進(jìn)行逐個預(yù)測，并通過預(yù)測值不斷更新模型。上述方法均采用局部預(yù)測模型。

(2)

(3)

f=A0+A1x+A2x2

(4)

(5)

其中，公式(2)為斜線法(取m=1)和拋物線法(取m=2)的模型，公式(3)為高斯擬合法的模型。

通過對公式(3)兩邊取對數(shù)運(yùn)算，得到等式(4)，則將高斯擬合法構(gòu)建成為曲線擬合模型。最終3種方法均可通過求解得到類似公式(5)的一個矩陣，求得相應(yīng)系數(shù)，從而得到預(yù)測曲線[5-8]。

取序列(1)中y的兩端N項(xiàng)序列作為灰色預(yù)測模型的原始數(shù)據(jù)(以臨近右端閾值的N個序列作為恢復(fù)模型為例)Y0:

(6)

對Y0進(jìn)行一次累加，生成序列G0：

(7)

根據(jù)序列(7)的緊鄰均值生成序列S0:

(8)

建立所需的一階微分方程

(9)

將微分方程(9)用矩陣表示：

(10)

(11)

(12)

通過求解白化微分方程(12)，得到灰色微分式(9)的解為：

(13)

(14)

在處理過程中，斜線法、高斯擬合法和拋物線法都是利用閾值之下的數(shù)據(jù)具有變化趨勢平緩、向兩邊逐漸變?nèi)踮呌诹愕奶攸c(diǎn)，依照最小二乘法擬合出相應(yīng)的變化曲線，最終利用曲線進(jìn)行閾值之下的曲線恢復(fù)，得到所需的脈沖補(bǔ)償參數(shù)。

上述3種方法在進(jìn)行脈沖補(bǔ)償?shù)倪^程中，利用閾值邊界兩端的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。在處理過程中，如果選取較大的閾值，則閾值之下兩端數(shù)據(jù)變化較大，使得通過邊界兩端的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測導(dǎo)致較大的誤差；而如果選取較小的閾值，則采集了較多的接近零的數(shù)據(jù)，這部分的數(shù)值在利用模數(shù)轉(zhuǎn)換時，接近模數(shù)轉(zhuǎn)換器的轉(zhuǎn)換極限，且閾值選取過小會使得一些雜散噪聲進(jìn)入到轉(zhuǎn)換中，轉(zhuǎn)換之后的數(shù)值也會有較大的誤差。在實(shí)際應(yīng)用中，由于采集到的細(xì)胞所攜帶的信息量不同，所體現(xiàn)出來的熒光強(qiáng)度不同，所以固定一個閾值會使得對不同的信號而言有過大或過小的可能，而動態(tài)調(diào)節(jié)在快速處理中，實(shí)時性要求極高，目前還不利于實(shí)現(xiàn)動態(tài)調(diào)節(jié)閾值。因此在細(xì)胞變動大的情況下，會使得閾值選取不恰當(dāng)，這3種方法都不能提供較強(qiáng)的抗擾動能力。

為了提高抗擾動能力，選用灰色預(yù)測的方法。通過對閾值邊界以上的前N個值進(jìn)行計(jì)算，預(yù)測出下一個點(diǎn)的值，最后利用這N+1個數(shù)據(jù)，舍棄掉第一個數(shù)據(jù)，組成一個新的N個數(shù)據(jù)組，通過這新的N個數(shù)據(jù)，再進(jìn)行下一個數(shù)的預(yù)測，依次預(yù)測出閾值以下的數(shù)據(jù)。最后利用預(yù)測出來的數(shù)進(jìn)行更加精準(zhǔn)的參數(shù)計(jì)算。

利用灰色預(yù)測算法的優(yōu)點(diǎn)是抗擾動能力強(qiáng)，計(jì)算較為簡便，準(zhǔn)確度高；缺點(diǎn)是計(jì)算量相對復(fù)雜，消耗時間相對較多。

3 實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析

基于以上理論，利用MATLAB搭建仿真系統(tǒng)。

對高斯脈沖信號疊加隨機(jī)噪聲，并對最終的脈沖信號進(jìn)行S-G濾波處理。對處理過后的脈沖信號進(jìn)行閾值截?cái)?。利用上述方法，分別對該脈沖閾值以下的數(shù)據(jù)進(jìn)行恢復(fù)處理，并計(jì)算3個參數(shù)：峰值(P)、脈寬(L)和面積(S)。3個參數(shù)的計(jì)算方法一致，分別采取如下的計(jì)算方式得到參數(shù)值：

假定擬合之后的高斯脈沖序列為y(i)，其中i=1,2,3,…,n。

(15)

L=k2-k1+1

(16)

(17)

式(15)～(17)中，max表示取到最大值點(diǎn)的序列號，P表示所求峰值；L表示所求脈寬，其中k1,k2分別表示在取定有效高斯脈沖的情況下，脈沖左右兩端的序列值；S表示所求面積，在高頻采樣情況下，用分段直角梯形累加和來表示該段的積分面積是可行的。

利用上述3個參數(shù)的計(jì)算方法，分別對用不同恢復(fù)方法所得參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，得到表1所示的數(shù)據(jù)。

表中各行所對應(yīng)的值為該種方法與真值(取P=1.89V,L=3.00μs,S=139.00)的差值,Th為設(shè)定的閾值大小。

通過分析表1中數(shù)據(jù)，可以得出：

(1)進(jìn)行補(bǔ)償能夠大大減少計(jì)算脈寬和面積帶來的誤差，而在這些補(bǔ)償方法中，矩形補(bǔ)償所帶來的準(zhǔn)確性最小，灰色預(yù)測法穩(wěn)定性高，能達(dá)到很理想的補(bǔ)償效果。

(2)除灰色預(yù)測方法外，其他方法受閾值設(shè)定的影響因素都很大。

(3)這些補(bǔ)償方法中，閾值選取合適，對于這幾種方法能夠都能夠提高恢復(fù)信號的準(zhǔn)確性。因此，在實(shí)際檢測過程中，為進(jìn)一步滿足在線測量時的時效性，選取適當(dāng)?shù)拈撝?，通過對比表1中第一組和第四組可知，利用斜線法替換矩形補(bǔ)償也能達(dá)到接近灰色預(yù)測的準(zhǔn)確性效果。在考慮準(zhǔn)確性和時效性兩方面選用斜線法能得到較大的平衡。

4 結(jié)束語

本文針對流式細(xì)胞儀信號參數(shù)提取研究了補(bǔ)償算法，利用仿真實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了理論驗(yàn)證，通過對比實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了信號恢復(fù)的必要性以及提高信號恢復(fù)準(zhǔn)確性的方法。通過該實(shí)驗(yàn)，得出了利用灰色預(yù)測方法可以顯著提高參數(shù)準(zhǔn)確性的結(jié)論，并且在充分考慮快速檢測的基礎(chǔ)上，利用斜線法也能達(dá)到優(yōu)于矩形補(bǔ)償?shù)脑诰€優(yōu)化效果。依靠灰色預(yù)測方法，提高參數(shù)提取的準(zhǔn)確性，為醫(yī)學(xué)上利用完整數(shù)據(jù)離線分析、進(jìn)行二次確診提供更加有力的診斷依據(jù)。通過本次實(shí)驗(yàn)，可以驗(yàn)證所提補(bǔ)償方法的有效性。本文設(shè)計(jì)的恢復(fù)方法也將進(jìn)一步運(yùn)用于硬件設(shè)計(jì)，優(yōu)化硬件電路的參數(shù)提取算法。

表1 仿真方法結(jié)果誤差比對表

[1]OrmerodMG.Investigatingtherelationshipbetweenthecellcycleandapoptosisusingflowcytometry[J].J.Immunol.Methods,2002,265:73-80.

[2]SincockSA,RobinsonJP.Flowcytometricanalysisofmicroorganisms[J].MethodsCellBiol.,2001,64:511-537.

[3] 趙書濤,武曉東,王 策,等. 流式細(xì)胞儀的原理、應(yīng)用及最新進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,22:4378-4381.

[4] 王 輝,高 穎.應(yīng)用流式細(xì)胞儀的常見問題及解決對策[J].現(xiàn)代儀器,2012(1):64-65.

[5] 陳良波,鄭亞青. 基于最小二乘法的曲線擬合研究[J].無錫職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2012(5):52-55.

[6] 肖無云,魏義祥,艾憲蕓.多道脈沖幅度分析中的數(shù)字基線估計(jì)方法[J].核電子學(xué)與探測技術(shù),2005(6):35-38.

[7] 張繼龍,甄蜀春,曹 鵬,等. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的曲線擬合方法及其應(yīng)用[J].測試技術(shù)學(xué)報(bào),2003(3):255-257.

[8] 陳 光,任志良,孫海柱.最小二乘曲線擬合及Matlab實(shí)現(xiàn)[J]. 兵工自動化,2005(3):107-108.

[9] 曾 波,劉思峰,方志耕,等.灰色組合預(yù)測模型及其應(yīng)用[J]. 中國管理科學(xué),2009(5):150-155.

[10] 王中宇,孟 浩,付繼華.表面綜合形貌誤差的灰色分離方法[J].儀器儀表學(xué)報(bào),2008,29(9):1810-1815.

Study of Multiple Algorithms about Pulse Compensation

Zhou Jin1, Lou Xiaoping1,2, Zhang Wenchang1,2, Liu Feng1,2

(1.Beijing Key Laboratory of Optoelectronic Measurement Technology, Beijing information Science and Technology University, Beijing 100192,China; 2.Beijing Engineering Research Center for optoelectronic information and instrument,Beijing Information Science and Technology University，Beijing 100192，China)

In flow cytometer (FCM) researching field, pulse parameters (width, peak, area, etc.) extraction plays important role for particle information post-processing. According to principle of the flow cytometer, special circuit is designed to collect the pulses, and the threshold is used to trigger effective signal catching and parameters calculating. The measurement accuracy is affected by the information missing below system threshold. In order to improve system performance, pulse predicting algorithms are introduced in this paper. Three parameters by recovering are extracted and compared with the parameters of the signal obtained before the restoration.

FCM； signal predicting； Gaussian pulse； pulse compensation

2015-10-03；

2015-10-29。

北京市屬高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)與教師職業(yè)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(IDHT20130518)；長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助(IRT1212); 北京市教委科研計(jì)劃項(xiàng)目(KM201511232006)。

周 進(jìn)(1990-)，男，江西新余人，碩士研究生，主要從事生物醫(yī)療檢測技術(shù)及儀器方向的研究。

1671-4598(2016)03-0244-04

10.16526/j.cnki.11-4762/tp.2016.03.067

TP274

A