桂花優(yōu)良品種‘珍珠彩桂’遺傳多樣性的ISSR分析及指紋圖譜構建

喬中全， 王曉明， 李永欣， 蔡 能， 曾慧杰， 王湘瑩 (湖南省林業(yè)科學院 林木無性系育種技術湖南省重點實驗室， 湖南 長沙 410004)

桂花優(yōu)良品種‘珍珠彩桂’遺傳多樣性的ISSR分析及指紋圖譜構建

喬中全， 王曉明， 李永欣， 蔡 能， 曾慧杰， 王湘瑩
(湖南省林業(yè)科學院 林木無性系育種技術湖南省重點實驗室， 湖南 長沙 410004)

利用ISSR分子標記技術對44個桂花品種進行遺傳多樣性研究，從100條引物中篩選出10條引物對供試材料基因組總DNA進行PCR擴增，共擴增出條帶122條，其中多態(tài)性條帶112條，多態(tài)性比例為91.8%。經(jīng)PopGen32軟件包分析，44個桂花品種的平均有效等位基因數(shù)為1.592 8，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.341 9，平均Shannon信息指數(shù)為0.506 3，遺傳一致度介于0.475 4～0.926 2之間，說明桂花品種間遺傳多樣性較高。UPGMA聚類將44個品種分成7類。建立了新品種‘珍珠彩桂’和其它43個桂花品種的DNA指紋圖譜，可從分子水平將‘珍珠彩桂’與現(xiàn)有其它桂花栽培品種進行鑒別。研究結果為桂花分類、品種鑒定、分子育種和子代鑒定提供了重要依據(jù)。

桂花； ISSR； 遺傳多樣性； 指紋圖譜

桂花(Osmanthusfragrans)為木犀科(Oleaceae)木犀屬(Osmanthus)常綠植物，花簇生，香味濃郁，在我國有2 500余年的栽培歷史，是我國十大傳統(tǒng)名花之一，也是優(yōu)良的園林綠化樹種和香料植物[1]。目前，我國桂花品種記載的有170多個[2]。在長期栽培過程中，由于自然雜交、人工選擇及其它環(huán)境因素的影響，許多性狀發(fā)生變異，品種資源越來越豐富[3-4]。長久以來，都是以形態(tài)學為基礎對桂花品種進行分類，以葉、枝條、花、營養(yǎng)器官的特征及花期的早晚等為依據(jù)，將桂花分為4個品種群：金桂品種群、銀桂品種群、四季桂品種群和丹桂品種群[5-8]。由于研究者對桂花品種變異和進化規(guī)律掌握不夠清楚，導致不同地區(qū)的桂花品種很難進行比較，同物異名和同名異物的現(xiàn)象非常嚴重[4]，制約了桂花良種選育的進程。因此，使用現(xiàn)代生物學—分子標記技術，開展桂花品種分子標記研究，構建桂花品種指紋圖譜，有利于從分子水平進行桂花品種鑒別，促進桂花新品種選育。國內(nèi)外有利用同工酶與RAPD分子標記進行桂花品種分類[9-10]的報道，目前，使用ISSR標記技術構建桂花DNA指紋圖譜進行品種鑒定的報道還很少。ISSR標記技術克服了RAPD和RFLP的限制[11-12]，具有操作簡單、費用低、重復性好、穩(wěn)定性高和多態(tài)性水平高等特點，能夠檢測出豐富的遺傳多樣性。本研究利用ISSR分子標記技術對‘珍珠彩桂’等44個桂花品種進行分子標記研究，建立‘珍珠彩桂’等桂花品種的DNA指紋圖譜，為‘珍珠彩桂’及其它桂花植物的品種鑒定、種質(zhì)資源的保護和利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1供試材料

材料為44個桂花品種(見表1)，均于2014年4月取自常州市開心農(nóng)場，將葉片用硅膠干燥后帶回實驗室，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2基因組DNA提取

按照北京天根生物有限公司的植物DNA提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit、離心柱型)的說明書進行基因組DNA的提取。

1.3引物篩選

實驗所用引物為加拿大哥倫比亞大學(University of British Columbia Biotechnology，UBC)公布的植物通用ISSR引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成。從100條引物中篩選出擴增效果好的10條引物(見表2)。參考Tm值，采用梯度PCR確定不同引物的退火溫度。

1.4ISSR-PCR擴增

表1 供試材料Tab 1 MaterialsusedinISSRanalysis品種群品種品種代碼品種群品種品種代碼銀桂無名銀桂11日香桂29無名銀桂33紅日香桂30籽銀桂16金桂籽金桂11七月銀桂17曲葉金桂15無名銀桂2525紅雙喜43白潔27沉香桂32柳葉銀桂33蘇金桂22早銀桂40小葉檀香8丹桂大葉丹桂4大葉檀香13丹桂5柳葉金桂35朱砂桂6無名金桂37大花丹桂7無名籽金桂38早龍朱砂桂12老金桂44堰紅桂19小葉金桂24狀元紅2二葉金9軟葉丹桂34其它品種珍珠彩桂21橡皮朱砂桂41反紅黃桂10四季桂天香臺閣18青山桂26老四季桂23皖白桂31老四季桂28紅花籽蕾36月月桂42無名桂花2020佛頂珠14無名桂花3939

表2 ISSR引物名稱及序列Tab 2 ThenameandsequenceofISSRprimers引物編號序列Tm值(℃)退火溫度(℃)UBC810GAGAGAGAGAGAGAGAT5251UBC811GAGAGAGAGAGAGAGAC5050UBC815CTCTCTCTCTCTCTCTG5251UBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYT5051UBC835AGAGAGAGAGAGAGAGYC5050UBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYT5252UBC841GAGAGAGAGAGAGAGAYC5254UBC842GAGAGAGAGAGAGAGAYG5253UBC855ACACACACACACACACYT5053UBC856ACACACACACACACACYA5152

反應體系20 μL：30 ng模板DNA、0.60 μmol/L引物、1.5U TaqDNA聚合酶、0.20 mmol/L dNTPs、10×PCR buffer(Mg2+free)、2.0 mmol/L MgCl2、無菌水。PCR擴增程序：94 ℃ 5 min、 94 ℃ 30 s、50～54 ℃(不同引物不同退火溫度)45 s、72 ℃ 1.5 min、 35個循環(huán)、72 ℃ 2 min、4 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測、凝膠成像儀拍照記錄。所有實驗重復2次以上。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

統(tǒng)計清晰度高、重復性好、分辨率高的條帶計為1，條帶不清楚或沒有的計為0，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。用PopGen32分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析，用UPGMA法進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1ISSR多態(tài)性

44個樣本中，10條引物共擴增出122條效果好的條帶，其中112條為多態(tài)性條帶，分子量在200～3 000 bp之間(見表3、圖1)，平均每條引物可擴增出12.2條帶，11.2條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率(PPB)為91.8%。

表3 ISSR引物擴增結果及多態(tài)性Tab 3 Amplificationresultandpolymorphismofinter?simplesequencerepeat(ISSR)primers引物擴增總條帶數(shù)多態(tài)性條帶數(shù)多態(tài)性比率(%)UBC810111090 91UBC81112975 00UBC8151212100 00UBC834121191 67UBC8351212100 00UBC84012975 00UBC841121191 67UBC8421212100 00UBC8551212100 00UBC856151493 33總計12211291 80

圖1 UBC834擴增結果Fig.1 Amplified result of primer UBC834

2.2桂花品種間遺傳多樣性分析及聚類分析

通過PopGen32軟件對桂花品種分析，44個桂花品種的平均觀測位點數(shù)Na為1.918 0，有效等位位點數(shù)Ne為1.592 8，Nei’s基因多樣性H為0.341 9，Shonnon’s 信息指數(shù)為0.506 3，遺傳一致度介于0.475 4～0.926 2之間。其中，大葉丹桂和朱砂桂遺傳相似系數(shù)最高為0.926 2；天香臺閣與月月桂的相似性系數(shù)最低為0.475 4。

根據(jù)桂花品種間的遺傳相似系數(shù)，按UPGMA法進行聚類分析(見圖2)。從聚類圖可以看出，在相似性系數(shù)0.706處可將所有品種分為7個類群。第一類主要包括丹桂品種群的狀元紅、大葉丹桂、朱砂桂、丹桂、大花丹桂、早龍朱砂桂、堰紅桂，金桂品種群的大葉檀香、小葉檀香、籽金桂、二葉金，四季桂品種的佛頂珠和天香臺閣，銀桂品種群的無名銀桂1和無名銀桂3，其它桂花品種群中的反紅黃桂；第二類包括曲葉金桂、籽銀桂和七月銀桂三個品種；第三類是無名桂花20，單獨聚為一類；第四類包含蘇金桂、無名銀桂25、四季桂、青山桂、白潔、小葉金桂、老四季桂和日香桂；第五類含有紅日金桂、皖白桂、沉香桂、柳葉金桂、柳葉銀桂、軟葉丹桂、無名籽金桂38、紅花籽蕾、無名金桂37和無名桂花39；第六類含有珍珠彩桂、橡皮朱砂桂、月月桂和早銀桂；第七類為金桂的兩個品種，紅雙喜和老金桂。

圖2 ISSR分子聚類分析Fig.2 Dendrogram of UPGMA cluster based on ISSR Markers

2.3桂花品種鑒定

利用10條ISSR引物對44個桂花品種進行鑒定，結果表明，每條引物鑒定桂花品種的數(shù)量在22-44個之間，存在很大的差異，鑒定數(shù)量最多的是UBC856，共鑒定出44個桂花品種，鑒定數(shù)量最少的是UBC815、UBC834和UBC855，僅鑒定出22個桂花品種(見表4)。有5條引物可鑒定出30個以上桂花品種，分別是UBC810、UBC840、UBC841、UBC842和UBC856，表明篩選出的ISSR引物能很好地進行桂花品種鑒定。

表4 ISSR引物對桂花品種鑒定Tab 4 IdentificationofvarietiesofOsmanthusfragransbasedonISSRprimers引物編號鑒定數(shù)量鑒定品種編號UBC810341、3、8、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44UBC811252、5、8、11、12、14、17、18、19、20、23、24、26、27、28、29、30、32、34、36、39、40、41、42、44UBC815221、2、3、6、9、12、14、17、18、19、21、22、25、28、29、32、34、36、38、39、41、42、43UBC834221、2、15、16、17、20、22、23、26、28、29、30、31、33、36、37、38、39、40、42UBC835261、3、7、8、11、12、15、16、17、18、22、23、24、25、27、31、32、33、35、36、37、38、39、40、43、44UBC840301、3、9、10、14、17、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、36、37、38、39、40、41、42、43、44UBC841301、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24、25、31、35、36、37、40、41、42、UBC842381、2、3、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、27、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、43、44UBC855221、6、10、12、15、20、21、22、23、25、27、28、30、31、32、33、35、36、38、40、43、44UBC856441、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44

2.4桂花品種DNA指紋圖譜構建

10條ISSR引物中，UBC856能夠?qū)?4個品種進行很好地鑒定，因此，利用UBC856對44個桂花品種進行DNA指紋圖譜構建。UBC856對44個桂花品種均能進行很好的擴增，擴增片段長度在300～1700 bp之間，條帶清晰，多態(tài)性條帶豐富。片段長度小于300 bp或大于1700 bp，擴增片段模糊不清，因此不予統(tǒng)計。根據(jù)擴增條帶的有無，有條帶記為“1”，沒條帶記為“0”，建立44個桂花品種的計算機化DNA指紋圖譜，如表5所示。

表5 桂花品種的計算機化DNA指紋圖譜Tab 5 ThecomputerizedDNAfingerprintofvarietiesofOsmanthusfragrans編號名稱計算機化DNA指紋圖譜編號名稱計算機化DNA指紋圖譜編號名稱計算機化DNA指紋圖譜1無名銀桂101100110101110013大葉檀香00011111100110125無名銀桂250000001000111012狀元紅01101110101110014佛頂珠01111110101110026青山桂0000001011011113無名銀桂300101011101111115曲葉金桂00001111001111027白潔0000001001011014大葉丹桂01101111111110116籽銀桂00000111101110028四季桂0000011110111115丹桂01101111101110117七月銀桂01111011100101029日香桂0100101001011106朱砂桂00111111101110018天香臺閣11001010101111130紅日香桂0000101000111007大花丹桂01101110101111119堰紅桂00001110101110131皖白桂0000111000011118小葉檀香00001010101110020無名桂花2000100111010111032沉香桂0100101001011019二葉金00000011101111121珍珠彩桂00000110110111133柳葉銀桂01001110000110110反紅黃桂01011110101110122蘇金桂00000010001111134軟葉丹桂00000110011111111籽金桂00001110101110123老四季桂01000110100111035柳葉金桂00001010010110112早龍朱砂桂01011110101111024小葉金桂01000110100111136紅花籽蕾010000100001110

續(xù)表5 桂花品種的計算機化DNA指紋圖譜ContinuedTab 5 ThecomputerizedDNAfingerprintofvarietiesofOsmanthusfragrans編號名稱計算機化DNA指紋圖譜37無名金桂00000110010110138無名籽金桂01001111010111139無名桂花3901001110010110140早銀桂01001110000111041橡皮朱砂桂00001010001110142月月桂00000110000111043紅雙喜11000111010111044老金桂110011100101100

3 結論與討論

采用ISSR分子標記技術對44個桂花品種進行遺傳多樣性分析，得到的多態(tài)性條帶比率(PPB)達到91.8%，說明桂花品種間的變異較大，品種資源較豐富。這與我國勞動人民長期的栽培和選育密切相關。聚類分析結果(見圖2)表明，花色較深的金桂品種群和丹桂品種群中的多個品種往往聚在一起，說明這兩個品種群中某些品種有較近的親緣關系，這與趙小蘭等[13]同工酶分析、韓遠記等[14]AFLP聚類分析及邱英雄等[15]ISSR聚類分析的結果基本一致。花色較淺的銀桂品種群和四季桂品種群中的多個品種聚在一起，說明某些花色較淺的品種之間遺傳變異程度較低，存在著較近的親緣關系。而銀桂中的某些品種與金桂和丹桂類品種又有較高的遺傳相似度，表明基于形態(tài)學的品種分類體系與基于ISSR標記的品種分類體系不一致。本研究中所用的珍珠彩桂為新選育出的桂花新品種，其究竟屬于哪一個桂花品種群目前一直沒有確定。從聚類結果看，珍珠彩桂與橡皮朱砂桂、月月桂和早銀桂聚為一類，并不能判斷珍珠彩桂屬于哪個品種群，但在遺傳距離較遠處珍珠彩桂又與花色較淺的品種聚為一類，因此結合其開花特性將其歸為銀桂品種群。由此可見單獨的ISSR分子標記并不能確定其品種群的歸屬。

本研究利用ISSR分子標記技術建立了珍珠彩桂及其它43個桂花品種的DNA指紋圖譜，可以將桂花品種很好地區(qū)分開。本研究所選的10條引物中有5條能單獨區(qū)分出30個以上品種，鑒定品種最多的是引物UBC856，可以鑒定出全部44個品種。構建桂花DNA指紋圖譜，有利于桂花品種鑒定和真?zhèn)伪鎰e，有利于桂花新品種培育，子代檢測、鑒定，同時還可為桂花雜交育種提供指導，具有重要意義。

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GeneticdiversityandfingerprintconstructionofvarietiesofOsmanthusfragrans‘ZhenzhuCaigui’byISSRmarkers

QIAO Zhongquan， WANG Xiaoming， LI Yongxin， CAI Neng， ZENG Huijie， WANG Xiangying

(Hunan Academy of Forestry，Trees Clones Breeding Technology Key Laboratory of Hunan Province，Changsha 410004，China)

The genetic diversity of 44 varieties ofOsmanthusfragranswas analyzed by inter-simple sequence repeats(ISSR).10 ISSR primers which were selected from 100 ISSR primers were amplified by PCR.A total of 122 bands were amplified，112 of which were polymorphic bands，polymorphic ratio was 91.8%.After PopGen32 package analysis，the average effective number of alleles 44Osmanthusfragranswas 1.592 8，the average Nei’s genetic diversity index was 0.341 9，the average Shannon information index was 0.506 3，genetic identity between 0.475 4～0.926 2.This showed a high genetic diversity amongOsmanthusfragrans.These 44 varieties ofOsmanthusfragranswere divided into seven groups by UPGMA based on the similarity coefficient.The fingerprint of 44 varieties ofOsmanthusfragranswas established.The result could be used as a basis for classification ofOsmanthusfragrans，variety identification，molecular breeding and offspring identify.

Osmanthusfragrans； ISSR； genetic diversity； fingerprint

2016-03-23

長沙市科技計劃重點項目(科051003-22)。

喬中全(1985-)，男，山東曹縣人，碩士，助理研究員，研究方向為植物分子育種。

S 685.13

A

1003 — 5710(2016)03 — 0001 — 05

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2016. 03. 001

(文字編校：張 珉)