住院患者產(chǎn)CTX-M型ESBLs和KPC的大腸埃希菌感染分布與耐藥基因分析

蔣 偉, 王思淼, 金 鑫, 李佳佳

(解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，北京 100048)

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·論著·

住院患者產(chǎn)CTX-M型ESBLs和KPC的大腸埃希菌感染分布與耐藥基因分析

蔣 偉, 王思淼, 金 鑫, 李佳佳

(解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，北京 100048)

目的 了解住院患者產(chǎn)CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和碳青霉烯酶(KPC)大腸埃希菌感染的臨床分布與耐藥情況。方法 收集某院2011—2012年臨床送檢標本分離的多重耐藥大腸埃希菌，采用微量肉湯稀釋法檢測抗菌藥物最低抑菌濃度(MIC)；聚合酶鏈反應(PCR)擴增ESBLs和KPC基因，確定CTX-M和KPC基因型別及MLST分型。結(jié)果 48株多重耐藥大腸埃希菌中單產(chǎn)ESBLs 45株(93.75%)，攜帶blaCTX-M基因者44株(91.67%)，其中blaCTX-M-1組基因20株(41.67%)、blaCTX-M-9組基因32株(66.67%)，同時攜帶兩組基因者8株(16.67%)。經(jīng)基因測序確定的基因亞型有CTX-M-14(65.91%，29/44)、CTX-M-55(31.82%，14/44)、CTX-M-15(11.36%，5/44)、CTX-M-3(2.27%，1/44)、CTX-M-24(2.27%，1/44)和CTX-M-65(2.27%，1/44)，其中CTX-M-14+CTX-M-55(11.36%，5/44)、CTX-M-14+CTX-M-15(4.55%，2/44)和CTX-M-55+CTX-M-65(2.27%，1/44)。產(chǎn)ESBLs+KPC菌株中2株(4.17%)經(jīng)PCR擴增均攜帶blaKPC和blaCTX-M基因，經(jīng)測序分析1株為CTX-M-14+KPC-2，1株為CTX-M-3+KPC-2。ST131 (53.66%)是主要的MLST型別，檢測到ST648、ST405、ST167、ST1193等ST型。 結(jié)論 該院大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs基因型中CTX-M-14、CTX-M-55和CTX-M-15亞型最常見，存在多種不同亞型；ST131是主要的MLST型別，檢測到產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶菌。

大腸埃希菌； 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶； KPC酶； CTX-M； 多位點序列分析

[Chin J Infect Control，2016，15(10)：760-763]

產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase，ESBLs)和碳青霉烯酶(Klebsiellapneumoniaecarbapenemase，KPC)等是引起大腸埃希菌多重耐藥的主要原因，給臨床治療帶來嚴峻挑戰(zhàn)，已引起社會各界廣泛關注[1-4]。不同地區(qū)、醫(yī)院抗菌藥物使用不同，產(chǎn)生的ESBLs和KPC基因型別亦不同[1-4]。本研究分析某院住院患者分離的產(chǎn)ESBLs和KPC大腸埃希菌引起的感染分布和耐藥基因攜帶情況?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 菌株來源與鑒定 收集該院2011—2012年臨床送檢標本分離的多重耐藥大腸埃希菌，標本來源于尿、血、引流液、膿液、穿刺液、腦脊液及胸腹腔積液，經(jīng)Vitek Compact鑒定和藥敏試驗。

1.2 藥敏試驗 采用瓊脂稀釋法檢測研究菌株的最低抑菌濃度(MIC)，根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)2013年標準，應用WHONET 5.6軟件判斷敏感、中介和耐藥。對三類及三類以上抗菌藥物耐藥判斷為多重耐藥菌。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，陽性對照菌為大腸埃希菌ATCC 35218和肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.3 產(chǎn)KPC酶表型檢測 根據(jù)CLSI標準進行改良Hodge試驗(MHT)及結(jié)果判讀，篩選產(chǎn)KPC酶表型，陽性質(zhì)控菌為產(chǎn)KPC-2型肺炎克雷伯菌(北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，菌株編號K1)。

1.4 產(chǎn)ESBLs和KPC基因型檢測 DNA提取采用煮沸法。PCR擴增CTX-M型ESBLs引物序列和反應條件參考文獻[1]，KPC酶擴增引物序列和反應條件參考文獻[3]。引物合成委托上海生工生物工程公司。

1.5 DNA測序 DNA測序委托上海生工生物工程公司，所得序列閱讀和分析應用Chromas 2軟件，結(jié)果比對通過Genbank中Blast，基因亞型確定參考Lahey系統(tǒng) (www.lahey.org/studies/)。

1.6 MLST分型 根據(jù)文獻[1]合成7種看家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA)，與數(shù)據(jù)庫對比并分析ST型別。MLST網(wǎng)址：http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Ecoli。

2 結(jié)果

2.1 菌株分布 共分離48株多重耐藥大腸埃希菌。來源科室：重癥監(jiān)護病房(ICU)10株(20.83%)，外科病房18株(37.50%)，內(nèi)科病房19株(39.58%)，急診科1株；標本來源：尿21株(43.75%)，血18株(37.50%)，膽汁、腹腔積液和膿液各2株(各占4.17%)，引流液、腦脊液、穿刺液各1株(各占2.08%)；年齡17～91歲，平均年齡(61.6±14.0)歲，60歲以上占58.33%；感染患者基礎疾病包括：惡性腫瘤(胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、血液病等)、心腦血管疾病(心肌梗死、腦梗死等)、腎臟疾病(腎積水、泌尿系統(tǒng)感染，包括膀胱炎等)和外科手術(骨折切開內(nèi)固定術、腎切除術后、膽囊切除術后等)。

2.2 細菌耐藥情況 48株多重耐藥大腸埃希菌中有45株單產(chǎn)ESBLs菌株，對亞胺培南、美羅培南、厄他培南、替加環(huán)素和多粘菌素100.00%敏感；對阿米卡星敏感率為91.11%，對哌拉西林/他唑巴坦的敏感率較高，為82.22%。45株單產(chǎn)ESBLs菌株對頭孢曲松和頭孢噻肟耐藥率為100.00%，對環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、復方磺胺甲口惡唑的耐藥率分別為91.11%、86.67%、86.67%。3株同時產(chǎn)ESBLs和KPC菌株除對阿米卡星、替加環(huán)素、多粘菌素敏感外，對其他所有檢測抗菌藥物均表現(xiàn)為耐藥。見表1。

表1 45株單產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對常用抗菌藥物的藥敏結(jié)果(%，株)

Table 1 Antimicrobial susceptibility testing result of 45 ESBLs-producingE.coliisolates (%，No. of isolates)

抗菌藥物敏感中介耐藥哌拉西林/他唑巴坦82.22(37)2.22(1)15.56(7)頭孢他啶28.89(13)17.78(8)53.33(24)頭孢曲松0.00(0)0.00(0)100.00(45)頭孢噻肟0.00(0)0.00(0)100.00(45)頭孢吡肟6.67(3)6.67(3)86.66(39)頭孢哌酮/舒巴坦57.78(26)17.78(8)24.44(11)氨曲南15.56(7)17.78(8)66.67(30)亞胺培南100.00(45)0.00(0)0.00(0)美羅培南100.00(45)0.00(0)0.00(0)厄他培南100.00(45)0.00(0)0.00(0)阿米卡星91.11(41)4.44(2)4.44(2)替加環(huán)素100.00(45)0.00(0)0.00(0)米諾環(huán)素62.22(28)15.56(7)22.22(10)左氧氟沙星15.56(7)6.67(3)77.78(35)環(huán)丙沙星6.67(3)2.22(1)91.11(41)復方磺胺甲口惡唑13.33(6)0.00(0)86.67(39)多粘菌素100.00(45)0.00(0)0.00(0)

2.3 基因型別檢測結(jié)果 PCR擴增結(jié)果顯示，48株多重耐藥大腸埃希菌攜帶blaCTX-M基因者占91.67%(44株)，攜帶blaCTX-M-1組基因者41.67%(20株)、blaCTX-M-9組基因者66.67%(32株)，同時攜帶兩組基因者占16.67%(8株)。44株攜帶blaCTX-M基因的大腸埃希菌中，確定的基因亞型有CTX-M-14(65.91%，29株)、CTX-M-55(31.82%，14株)、CTX-M-15(11.36%，5株)、CTX-M-3(2.27%，1株)、CTX-M-24(2.27%，1株)和CTX-M-65(2.27%，1株)，其中檢測到CTX-M-14+CTX-M-55(11.36%，5株)、CTX-M-14+CTX-M-15(4.55%，2株)和CTX-M-55+CTX-M-65(2.27%，1株)。見表2。ESBLs+KPC菌株中2株(4.17%)經(jīng)PCR擴增均攜帶blaKPC和blaCTX-M基因，經(jīng)測序分析1株為CTX-M-14+KPC-2，1株為CTX-M-3+KPC-2。

2.4 MLST分型結(jié)果 48株菌均進行了MLST分型，其中能明確分型者41株，主要包括CTX-M-15型、CTX-M-55型和CTX-M-14型。其中ST131(53.66%，22株)為最主要ST型, 其次為ST1193(21.95%，9株)和ST648(19.51%, 8株)，ST405 (2.44%，1株)和ST167(2.44%，1株)。CTX-M-14 基因型中以ST131 (58.33%，14/24)為主，其次為ST648(33.33%，8/24)；CTX-M-55 基因型以ST1193(64.29%，9/14)和 ST131(35.71%，5/14)為主，而CTX-M-15基因型檢測到ST405(20%，1/5)、ST167(20%，1/5)和ST131(60%，3/5)。各ST型別分布于不同時期的不同病房，均為散發(fā)分布，未發(fā)現(xiàn)暴發(fā)流行趨勢。見表2。

表2 44株產(chǎn)CTX-M型ESBLs大腸埃希菌基因型、MLST型別及標本來源分布(株)

Table 2 Distribution of CTX-M genotypes, MLST types, and sources of specimens of 44 ESBLs-producingE.coliisolates (No. of isolates)

基因型菌株數(shù)標本來源尿血膽汁腹腔積液膿液腦脊液穿刺液MLST分型CTX-M-1群 CTX-M-5582500010ST1193,ST131 CTX-M-1531200000ST405,ST167,ST131 CTX-M-311000000未分型CTX-M-9群 CTX-M-142210721101ST131,ST648 CTX-M-6511000000未分型 CTX-M-2410000100未分型CTX-M-1群+CTX-M-9群 CTX-M-55+CTX-M-1454100000ST131,ST1193 CTX-M-15+CTX-M-1420101000ST131 CTX-M-55+CTX-M-6510100000ST1193合計44191722211

3 討論

CTX-M即頭孢噻肟酶，呈全球性分布，世界各地均有報道[1-2, 5-10]。我國CTX-M檢出率居高不下[1,5,8-10]。本研究顯示，該院CTX-M基因的總檢出率為91.67%，主要攜帶CTX-M-1基因(占41.67%)和CTX-M-9組基因(占66.67%)，且攜帶的CTX-M-9組基因檢出率更高，而同時攜帶兩組基因者占16.67%，高于我國以往的報道[8]。其中主要流行基因亞型為CTX-M-14、CTX-M-55和CTX-M-15，與國內(nèi)報道[1]一致。CTX-M-55和CTX-M-15的檢出率呈上升趨勢，CTX-M-14目前仍是該院主要的ESBLs亞型。CTX-M-55被認為是動物源性亞型，是由CTX-M-15在第77位發(fā)生Ala-Val氨基酸改變而來。同樣，CTX-M-65和CTX-M-24也被稱為食品動物源性，在該院臨床標本中亦有少量檢出。

研究[11]證實，高產(chǎn)ESBLs可導致碳青霉烯類抗菌藥物耐藥性上升。該院大腸埃希菌碳青霉烯類耐藥的原因可能與產(chǎn)KPC酶菌同時攜帶ESBLs相關，而非單一因素所致。

藥敏結(jié)果顯示，所有產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對亞胺培南、美羅培南、厄他培南、替加環(huán)素、多粘菌素、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦的敏感性較高，與國內(nèi)報道[12]一致，可作為治療該類感染的首選藥物。但碳氫霉烯類抗生素不敏感菌株的出現(xiàn)是臨床抗感染治療的難題，臨床應注意監(jiān)測。本組結(jié)果顯示，產(chǎn)KPC菌株對阿米卡星、替加環(huán)素、多粘菌素敏感性高，可作為嚴重感染者的用藥選擇。

MLST分型結(jié)果顯示，ST131是該院多重耐藥大腸埃希菌的主要型別(占53.66%)，在CTX-M-15 、CTX-M-55和 CTX-M-14基因型中均有檢出，分布于不同時期的不同病房，未出現(xiàn)暴發(fā)流行趨勢。而ST1193主要在CTX-M-55型大腸埃希菌中檢出，ST648在CTX-M-14型大腸埃希菌中檢出，同時檢出ST405和ST167，也說明該院存在多種ST型別的散在分布。本組未進行質(zhì)粒接合實驗和PFGE分型，是否存在質(zhì)粒的傳播播散需進一步證實。

研究[13-14]顯示，臨床上產(chǎn)ESBLs和KPC酶的腸桿菌科細菌感染病例日益增多，入住ICU、住院時間長(≥7 d)、留置各種導管、嚴重基礎疾病、機械通氣、年齡≥60歲等均是導致患者發(fā)生感染的危險因素。本組產(chǎn)CTX-M型ESBLs和KPC的大腸埃希菌來源于多種臨床標本和多個科室，感染患者年齡分布廣泛(17～92歲)，>60歲者占58.33%，提示住院患者中高危人群應引起臨床和微生物室的重點監(jiān)測和關注。從患者、菌株、各種酶基因型等不同方面加強產(chǎn)酶菌的檢測和監(jiān)測，采取有效的抗菌藥物管理和控制，嚴格遵守無菌操作規(guī)范，阻斷產(chǎn)ESBLs和KPC細菌的傳播途徑等綜合干預措施[13-14]，以有效防止和減少產(chǎn)ESBLs和KPC細菌在醫(yī)院內(nèi)的產(chǎn)生和傳播。

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(本文編輯：陳玉華)

Distribution and antimicrobial resistance genes of CTX-M extended-spectrum β-lactamase- andKlebsiellapneumoniaecarbapenemases-producingEscherichiacoliisolated from patients with infection

JIANGWei,WANGSi-miao,JINXin,LIJia-jia

(FirstAffiliatedHospitalofPLAGeneralHospital,Beijing100048,China)

Objective To investigate clinical distribution and antimicrobial resistance genes of CTX-M extended-spectrum β-lactamases (ESBLs)- andKlebsiellapneumoniaecarbapenemases (KPCs)-producingEscherichiacoli(E.coli) isolated from patients with infection. Methods Multidrug-resistantE.coli(MDR-E.coli) isolated from clinical specimens in a hospital in 2011-2012 were collected, minimal inhibitory concentrations (MICs) were detected by micro-broth dilution method; ESBLs and KPC genes were amplified by polymerase chain reaction (PCR), CTX-M and KPC genotypes，as well as multilocus sequence types (MLST) were identified. Results Of 48 MDR-E.coli, 45(93.75%) only produced ESBLs, 44(91.67%) carriedblaCTX-Mgene, 20(41.67%) of which wereblaCTX-M-1gene and 32(66.67%)wereblaCTX-M-9gene，8(16.67%)carried both genes. The following subtypes were identified through gene sequencing: CTX-M-14(65.91%，29/44), CTX-M-55(31.82%，14/44), CTX-M-15(11.36%，5/44), CTX-M-3(2.27%，1/44), CTX-M-24(2.27%，1/44),and CTX-M-65(2.27%，1/44). The detection rates of CTX-M-14+CTX-M-55, CTX-M-14+CTX-M-15, and CTX-M-55+CTX-M-65 were 11.36% (5/44), 4.55%(2/44), and 2.27%(1/44)respectively. PCR showed that 2(4.17%) ESBLs+KPC-producing strains carriedblaKPCandblaCTX-Mgenes, sequencing analysis showed that 1 was CTX-M-14+KPC-2，and the other was CTX-M-3+KPC-2. ST 131 (53.66%)was the main type of MLST, ST648, ST405, ST167, and ST1193 were also detected. Conclusion CTX-M-14, CTX-M-55 and CTX-M-15 are the most common genotypes of ESBLs-producingE.coliisolates, different subtypes exists, ST131 is the predominant MLST, KPC-2-producing isolate ofE.colihas been detected.

Escherichiacoli; extended-spectrum β-lactamase;Klebsiellapneumoniaecarbapenemase; KPC; CTX-M; multilocus sequence typing

2016-01-28

蔣偉(1968-)，女(漢族)，江蘇省南京市人，副主任技師，主要從事感染性疾病防控與細菌耐藥研究。

蔣偉 E-mail:jiangwei680808@163.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.10.010

R181.3+2

A

1671-9638(2016)10-0760-04