基于生物信息學分析溶質(zhì)載體15A1基因表達與孤獨癥譜系障礙的相關(guān)性

【摘要】目的 基于生物信息學分析溶質(zhì)載體（SLC）15A1基因表達與孤獨癥譜系障礙（ASD）的相關(guān)性，為臨床治療提供參考。方法 使用基因表達公共（GEO）數(shù)據(jù)庫，檢索溶質(zhì)載體相關(guān)基因（SCRGs）和孤獨癥譜系障礙（ASD）患者血液RNA表達譜芯片或測序的研究數(shù)據(jù)集得到2個訓練集（GSE6575、GSE77103數(shù)據(jù)集）和1個驗證集（GSE49105數(shù)據(jù)集），對2個訓練集進行去批次合并處理，將得到的新數(shù)據(jù)集作為本研究的訓練集。對訓練集進行差異表達分析，得到差異基因（DEGs），使用Venny 2.1獲取SCRGs和DEGs的交集靶點溶質(zhì)載體差異基因（DE-SCRGs）并建立DE-SCRGs的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖。對DE-SCRGs進行富集分析，得到其主要參與的生物學過程。通過機器學習方法[LASSO、隨機森林（RF）、支持向量機的遞歸特征消除（SVM-RFE）算法]在驗證集中篩選出生物標志物，并分析生物標志物在ASD中的預(yù)測價值。在訓練集和驗證集中比較ASD男童與健康對照（NC）組研究對象中DE-SCRGs的表達水平差異，在訓練集中比較ASD男童和女童樣本中DE-SCRGs的表達水平差異?；赟LC15A1、SLC5A4、SLC28A3、SLC50A1基因構(gòu)建列線圖，分析以上4個基因的表達水平與ASD發(fā)生的相關(guān)性。結(jié)果 GSE6575和GSE77103數(shù)據(jù)集去批次后數(shù)據(jù)分布較均勻，獲得1 010個DEGs，其中692個在ASD樣本中下調(diào)，318個在ASD樣本中上調(diào)，并獲得25個DE-SGRGs。關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖顯示：27個基因呈102對相關(guān)性，其中SLC15A1基因與其他分析的基因均正相關(guān)，具有代表性。GO通路富集分析結(jié)果顯示：DE-SCRGs參與的生物學過程主要是跨膜運輸?shù)裙δ埽籏EGG通路富集分析結(jié)果顯示：DE-SCRGs參與的部分信號通路主要是蛋白質(zhì)消化吸收、氮代謝等過程。通過LASSO、SVM-RFE、RF算法各得到16、16、7個候選特征基因，取交集后得到4個候選基因（SLC15A1、SLC5A4、SLC28A3、SLC50A1）作為生物標志物。受試者操作特征（ROC）曲線分析結(jié)果顯示：4個生物標志物預(yù)測ASD發(fā)生的曲線下面積（AUC）均＞0.7，整體模型的AUC=0.896。在訓練集和驗證集中，SLC15A1、SLC28A3、SLC50A1基因的表達趨勢保持一致，SLC5A4基因的表達在驗證集中無差異；訓練集中ASD男童、女童樣本的SLC50A1基因表達有差異。列線圖結(jié)果顯示：SLC15A1基因的表達與ASD的發(fā)生呈負相關(guān)。實驗驗證結(jié)果顯示：ASD組患兒血液樣品中SLC15A1基因表達水平低于NC組（P＜0.05）。結(jié)論 SLC15A1基因表達水平與ASD呈負相關(guān)，異常表達可降低寡肽物質(zhì)的轉(zhuǎn)運，進而影響ASD的發(fā)生或加重。

【關(guān)鍵詞】溶質(zhì)載體15A1基因；孤獨癥譜系障礙；差異基因

【中圖分類號】R729 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-2665.2024.14.0027.05

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.14.009

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder， ASD）是一種具有強遺傳性的多基因疾病，也是復雜的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，其特點包括社交溝通障礙、重復刻板行為、興趣狹窄等[1-2]。 ASD早期診斷較困難，需綜合觀察兒童的行為、發(fā)展狀況，且醫(yī)生需通過專業(yè)的評估工具和臨床經(jīng)驗判斷并確診，因此，探尋分子層面的易感基因?qū)膊〉脑缙谠\療至關(guān)重要。溶質(zhì)載體（SLC）家族有439個成員，由SLC基因編碼合成，是典型的跨膜蛋白，并基于基因特異性在不同組織細胞中差異性表達[3]。 SLC介導的跨膜運輸包含神經(jīng)遞質(zhì)前體，神經(jīng)遞質(zhì)在大腦中的正常傳遞和平衡對神經(jīng)功能（包括社交行為、認知和情感調(diào)節(jié)等）至關(guān)重要，因此， SLC基因突變與多種ASD表型相關(guān)[4-5]。例如， SLC6A4基因控制5-羥色胺再攝取，其啟動子區(qū)rs25531多態(tài)性與ASD密切相關(guān)[6]；在孤獨癥模式大鼠中， SLC9A9基因可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸表面的膜受體分布影響ASD的發(fā)生[7]； SLC6A8基因突變會導致神經(jīng)元攝取肌酸異常，神經(jīng)元的能量代謝失衡會影響神經(jīng)信號的傳遞、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育和功能，進而導致ASD的發(fā)生[8]。基于此，本研究基于基因表達公共數(shù)據(jù)庫（GEO），利用生物信息學方法，探尋與ASD相關(guān)的溶質(zhì)載體差異基因（DE-SCRGs），并分析其生物學意義，為其基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 分析流程 搜索GEO中關(guān)于ASD患者血液RNA表達譜芯片或測序的研究數(shù)據(jù)，共找到GSE6575、GSE77103、 GSE491053個數(shù)據(jù)集（均包含ASD患兒和健康對照的血液基因表達數(shù)據(jù)），使用GSE6575、GSE77103數(shù)據(jù)集作為訓練集， GSE49105數(shù)據(jù)集作為驗證集。分析流程如下：⑴下載GSE6575、 GSE77103、GSE49105數(shù)據(jù)集。⑵使用sva包中的ComBat函數(shù)對GSE6575和GSE77103數(shù)據(jù)集進行去批次合并處理，處理后作為本研究的訓練集進行后續(xù)分析。⑶在GEO中以“solute carrier”為關(guān)鍵詞，以“Score＞15”為篩選閾值，對檢索到的基因進行去重，得到本研究中的溶質(zhì)載體相關(guān)基因（SCRGs）數(shù)據(jù)。⑷通過limma包對訓練集進行差異表達分析，得到差異表達基因（DEGs），使用Venny 2.1軟件獲取SCRGs與DEGs的交集靶點DE-SCRGs，并繪制Venny圖。同時用R包中集群配置文件（clusterProfile）對獲得的DE-SCRGs進行功能富集分析。⑸用機器學習方法[LASSO算法、隨機森林（RF）、支持向量機的遞歸特征消除（SVM-RFE）]篩選出訓練集中的生物標志物。⑹分析生物標志物在ASD中的預(yù)測價值，使用R包“RMS”構(gòu)建生物標志物的列線圖，分析生物標志物與ASD發(fā)生的相關(guān)性，見圖1。

1.2 實驗驗證 ⑴標本采集及處理：選取2021年9月至2023年5月華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢兒童醫(yī)院收治的24例ASD的患兒和20例同期健康兒童為研究對象，分別作為ASD組和健康對照（NC）組。樣本的使用遵循人體生物樣本使用倫理規(guī)范[9]，所有兒童監(jiān)護人均對標本采集知情同意。采集兩組兒童空腹靜脈血4 mL，加入淋巴細胞分離液，以8 000 r/min（10 cm半徑）離心7 min，分離并收集有核細胞。經(jīng)trizol法提取RNA后立即經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈凍存?zhèn)溆?。⑵定量聚合酶鏈反?yīng)（qPCR）檢測： SLC15A1基因引物F： CAACATCATTGTGCTCATCGTG，R： GTAAGTATAGAACCGAGCCATGATG； β-肌動蛋白（β-actin）引物 F： AGAGCTACGAGCTGCCTGAC， R： AGCACTGTGTTGGCGTACAG。⑶統(tǒng)計學分析：采用2-△△ct法分析結(jié)果數(shù)據(jù)，行t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的篩選結(jié)果 GSE6575和GSE77103數(shù)據(jù)集去批次后數(shù)據(jù)分布較均勻，見圖2A。在去批次合并處理后的訓練集中共獲得1 010個DEGs，其中692個在ASD樣本中下調(diào)， 318個在ASD樣本中上調(diào)，見圖2B。將1 010個DEGs和417個SCRGs重疊，得到25個DE-SCRGs，見圖2C。使用“igraph”包建立DE-SCRGs（添加了額外兩個碳酸酐酶基因CA1和CA9）關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖，以相關(guān)性|r|＞0.3為閾值，該網(wǎng)絡(luò)圖中包含27個基因，分別為SLC44A3、 SLC25A37、 SLC50A1、 SLC1A5、 SLC12A5、SLC24A3、 SLC39A6、 SLC12A3、 SLC36A1、 SLC16A5、 SLC27A4、 SLC13A4、 SLC26A3、 OSCP1、 CA1、 SLC22A12、 SLC35F5、 SLC10A4、 SLC16A1、 SLC28A3、 SLC22A31、 SLC5A4、 SLC7A3、 SLC15A1、 SLCO6A1、 SLC16A8、 CA9，呈102對相關(guān)性，其中SLC15A1與其他分析的基因均呈正相關(guān)，具有代表性，見圖2D。

2.2 GO和KEGG通路富集分析結(jié)果 GO通路富集分析結(jié)果顯示， DE-SCRGs參與的生物學過程主要是跨膜運輸?shù)裙δ?，見圖3A； KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，DE-SCRGs參與的部分信號通路主要是蛋白質(zhì)消化吸收、氮代謝等過程，見圖3B。

2.3 機器學習方法驗證結(jié)果 通過LASSO算法檢索到16個候選特征基因，分別為SLC15A1、 SLC25A37、SLC5A4、 SLC12A5、 SLC28A3、 SLC7A3、 SLC13A4、SLC10A4、 SLC16A5、 SLCO6A1、 SLC27A4、 OSCP1、SLC16A8、 SLC24A3、 SLC44A3、 SLC50A1，見圖4A。選擇所有特征通過SVM-RFE算法檢索到16個候選特征基因，分別為SLC27A4、 SLC5A4、 SLC44A3、 SLC16A5、OSCP1、 SLC16A8、 SLC50A1、 SLC10A4、 SLC16A1、SLC12A5、 SLC25A37、 SLCO6A1、 SLC13A4、 SLC22A31、SLC28A3、 SLC15A1，結(jié)果為選擇前16個特征時誤差最小，故選這16個特征基因作為候選生物標志物，見圖4B。通過RF算法挖掘出7個候選特征基因，分別為SLC15A1、 SLC5A4、 SLC28A3、 SLC16A1、 SLC35F5、SLC50A1、 SLC26A3，見圖4C。通過重疊機器學習方法對所有獲得的候選特征基因取交集，識別出4個特征基因即為生物標志物，分別為SLC15A1、 SLC5A4、 SLC28A3、 SLC50A1，見圖4D。預(yù)測價值采用受試者操作特征（ROC）曲線進行分析，結(jié)果以曲線下面積（AUC）表示，以AUC＞0.7為準確性高。 ROC曲線分析結(jié)果顯示：4個生物標志物預(yù)測ASD發(fā)生的AUC值均＞0.7，整體模型的AUC值=0.896，見圖4E。

2.4 DE-SCRGs表達情況及相關(guān)性分析結(jié)果 計算DE-SCRGs在ASD組男童健康對照的血液基因表達數(shù)據(jù)表達水平并作圖。在訓練集和驗證集中， SLC15A1、 SLC28A3、 SLC50A1基因的表達趨勢保持一致， SLC5A4基因的表達在驗證集中無差異，見圖5A、圖5B。進一步比較訓練集中ASD男童、女童樣本的差異基因表達，發(fā)現(xiàn)SLC50A1基因表達有差異，見圖5C。利用“rms”包基于SLC15A1、SLC5A4、 SLC28A3、 SLC50A1基因構(gòu)建列線圖，通過各因素評分推斷ASD發(fā)生率，其中SLC15A1基因的表達水平與ASD的發(fā)生呈負相關(guān)，見圖5D。

2.5 實驗驗證結(jié)果 ASD組患兒SLC15A1基因表達水平低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖6。

3 討論

ASD是一種復雜的神經(jīng)發(fā)育障礙，基因在其發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，部分基因突變或異常表達（如多個基因上的微小變異、染色體拷貝數(shù)變異等），可影響兒童神經(jīng)發(fā)育過程（包括神經(jīng)元的連接、突觸的形成和功能等）進而影響大腦的正常發(fā)育和功能。在診斷ASD上引入譜系概念，可概括一大類具有不同程度的類似臨床癥狀的綜合征。其功能障礙發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，相應(yīng)的歸因研究中發(fā)現(xiàn)，在大體相同的外部因素下，篩選出疾病易感性相關(guān)的基因表達差異是較為有效的方法[10]。本研究通過生物信息學方法，在已公開的測序和芯片RNA表達數(shù)據(jù)中篩選出ASD相關(guān)的DESCRGs，在此基礎(chǔ)上探索DE-SCRGs作為易感基因的分子基礎(chǔ)，并找出可能參與其中的外部誘導因素。

差異基因可視作疾病的易感基因，其負責的功能所涉及的外源性分子可成為疾病易感的外部誘因，SLC15A1負責跨膜轉(zhuǎn)運二肽或三肽等寡肽，理論上如果其負責轉(zhuǎn)運的寡肽出現(xiàn)蓄積可能導致相應(yīng)的病理生理過程[11]。本研究結(jié)果顯示，ASD患兒血液SLC15A1基因表達水平低于NC組研究對象，這提示SLC15A1基因表達不足，會導致神經(jīng)發(fā)育過程中的某些環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，增加 ASD 發(fā)生的風險。分析原因為，SLC15A1基因表達水平降低，會導致血細胞緩沖系統(tǒng)清除血液中二肽類物質(zhì)的能力減弱，使有害二肽進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的含量增加，影響其功能加重ASD癥狀。有研究指出，ASD患者中SLC15A1基因的表達或功能發(fā)生改變，可能影響神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞、免疫系統(tǒng)的功能或其他與ASD相關(guān)的生理過程[12-13]。然而，要確定SLC15A1基因表達與ASD發(fā)病的確切相關(guān)性，還需從以下研究方向進行。⑴基因研究：分析更多ASD患者的SLC15A1基因，尋找突變或多態(tài)性，并研究其與ASD的關(guān)聯(lián)；⑵功能研究：探究SLC15A1基因表達在神經(jīng)細胞中的具體功能，以及其如何影響神經(jīng)遞質(zhì)的運輸和信號傳導；⑶動物模型：建立SLC15A1基因敲除或突變的動物模型，觀察它們是否表現(xiàn)出類似ASD的行為和生理特征；⑷臨床研究：通過大規(guī)模的臨床研究，確定SLC15A1基因在ASD診斷或治療中的潛在應(yīng)用價值。

綜上所述，SLC15A1基因表達水平與ASD呈負相關(guān)，其異常表達可影響寡肽物質(zhì)的轉(zhuǎn)運過程，進而影響ASD的發(fā)生或加重。

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