口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍耳病三種疫苗同步兩點免疫新技術研究與應用

周建國張應國段博芳楊余山羅曼榕濮永華匡繼才劉紹陽彭正啟黃 杰

（1.云南省動物疫病預防控制中心，云南昆明　650051；2.保山市動物疫病預防控制中心，云南保山　678000；3.云南省獸醫(yī)生物制品研制中心，云南保山 678000；4.施甸縣動物疫病預防控制中心，云南施甸 678200）

口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍耳病三種疫苗同步兩點免疫新技術研究與應用

周建國1張應國1段博芳1楊余山1羅曼榕1濮永華2匡繼才2劉紹陽3彭正啟3黃 杰4

（1.云南省動物疫病預防控制中心，云南昆明650051；2.保山市動物疫病預防控制中心，云南保山678000；3.云南省獸醫(yī)生物制品研制中心，云南保山 678000；4.施甸縣動物疫病預防控制中心，云南施甸 678200）

本研究采用豬口蹄疫（FMD）滅活疫苗和合成肽疫苗、豬瘟（CSF）脾淋活疫苗和高致病性豬藍耳?。℉PPRRS）活疫苗同步兩點免疫技術，對被免疫豬只分別進行了小組試驗、免疫持續(xù)期觀察等試驗研究，并用ELISA方法定期對各階段血清抗體進行檢測，旨在探索一種適合基層應用的FMD、CSF、HPPRRS三種疫苗同步分點注射免疫技術，提高免疫密度和免疫效果，降低基層防疫人員勞動強度，提高工作效率，破解基層強制免疫工作難題。本研究得出下列結論:（1）建立了口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍耳病三種疫苗同步兩點免疫技術方法并證明了其臨床應用的可行性與科學性。（2）口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍耳病三種疫苗同步兩點免疫證明了三種疫苗同步分點免疫相互間未出現免疫干擾現象。同時，對應用三種疫苗同步兩點免疫技術中各病種免疫效果的同步評估需在免疫后35～40d期間進行監(jiān)測為佳。（3）三種疫苗同步兩點免疫技術列入云南省2013年重大動物疫病免疫方案，在全省范圍內推廣應用至今。本研究證明了三種疫苗同步分點注射的可行性和科學性，并將三種疫苗同步兩點免疫技術大面積應用于免疫工作，解決了困擾基層臨床免疫的難點問題，為其臨床應用提供了科學依據和數據支持，在生產實際的臨床應用中具有重要意義。

口蹄疫豬瘟藍耳病疫苗兩點免疫技術研究與應用

口蹄疫（Foot-and-mouth Disease，FMD）、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），又稱“藍耳病”、豬瘟（Swine Fever；Hog Cholera，CSF）是近年來危害養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病，世界動物衛(wèi)生組織將口蹄疫、豬瘟列為 A 類家畜傳染病，將藍耳病列為B 類傳染病，并將這三種疾病列為世界范圍內重要傳染病研究病種[1-5］。我國對上述三種疫病采取強制免疫和撲殺相結合的綜合防控措施，國家發(fā)布的免疫計劃中，高致病性豬藍耳病、口蹄疫和豬瘟的免疫程序是散養(yǎng)生豬每年春秋兩季各免疫1次，規(guī)模養(yǎng)殖場按程序化進行免疫，三種疫苗要分3個階段3次注射免疫，每次免疫間隔一定時間。隨著這3種疫病陸續(xù)納入國家重大動物疫病強制免疫病種，基層防疫員按傳統(tǒng)方免疫式每季防疫要完成3種動物疫病的免疫任務需要分3個階段開展強制免疫工作，免疫周期長達60～75d，工作量較以往呈幾何倍數增加，勞動強度非常大，工作效率低、疫苗利用率低。為探索一種適合基層生豬口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍耳病同步免疫的新技術，優(yōu)化免疫程序，降低基層防疫人員勞動強度，提高工作效率，提高免疫質量，破解強制免疫工作中的難點問題，本研究在豬口蹄疫（滅活疫苗、合成肽疫苗）、豬瘟脾淋活疫苗高致病性豬藍耳病活疫苗三種疫苗同步三點免疫技術研究與應用[6］基礎上，采用三種疫苗同步兩點免疫新技術，通過小組試驗、免疫持續(xù)期觀察試驗研究，建立了適合臨床操作且免疫效果理想的生豬三種疫苗同步兩點注射一次完成的免疫技術方法（生豬“321”免疫新技術）。

1　材料與方法

1.1實驗動物和疫苗

選取45～60日齡斷奶仔豬，且滿足口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍耳病基礎抗體和病原同時為陰性，試驗地點為云南省獸醫(yī)生物制品研發(fā)中心。

豬O型口蹄疫合成肽疫苗為申聯(lián)生物醫(yī)藥（上海）有限公司產品，批號20111001。豬O型口蹄疫滅活疫苗為中牧實業(yè)股份有限公司產品，批號20120303001。豬瘟活疫苗（脾淋源）為云南生物制藥有限公司產品，批號20120302。高致病性豬藍耳病活疫苗（豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗NVDC-JXA1株）為洛陽普萊柯生物工程股份有限公司產品，批號1202021。

1.2試劑和儀器

口蹄疫病毒O型抗體檢測試劑盒（阻斷ELISA）為韓國金諾（北京金諾百特科技有限公司）產品，批號107SD298。豬瘟病毒抗體檢測試劑盒（阻斷ELISA）為韓國金諾（北京金諾百特科技有限公司）產品，批號107SD340。LSI豬繁殖和呼吸綜合征抗體檢測試劑盒（間接ELISA）為北京天之泰生物科技有限公司產品，批號5—VE7PRA—024。

酶標儀為安圖實驗儀器（鄭州）有限公司產品，型號：PHOMO

1.3免疫試驗分組與免疫方法

為確保各免疫組免疫劑量，各病種疫苗免疫劑量均為1.2頭份。

第1組，30頭，口蹄疫合成肽疫苗、豬瘟和高致病性豬藍耳病三種疫苗同步兩點免疫注射組，即口蹄疫合成肽疫苗于頸部左側注射，在同等規(guī)格下將豬瘟疫苗和高致病性豬藍耳病疫苗用豬瘟稀釋液按1：1：1比例進行稀釋后于頸部右側注射。

第2組，30頭，口蹄疫滅活疫苗、豬瘟和高致病性豬藍耳病三種疫苗同步兩點免疫注射組，即口蹄疫滅活疫苗于頸部左側注射，在同等規(guī)格下將豬瘟疫苗和高致病性豬藍耳病疫苗用豬瘟稀釋液按1：1：1比例進行稀釋后于頸部右側注射。

第3組，17頭，口蹄疫合成肽疫苗單苗免疫對照組，頸部左側深部肌肉注射。

第4組，18頭，口蹄疫滅活疫疫苗單苗免疫對照組，頸部左側深部肌肉注射。

第5組，18頭，豬瘟疫苗單苗免疫對照組，頸部右側深部肌肉注射。

第6組，21頭，高致病性豬藍耳病疫苗單苗免疫對照組，頸部深部肌肉注射。

第7組，21頭，免疫效果持續(xù)期觀察試驗組，即口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍耳病三種疫苗同步兩點免疫效果持續(xù)期觀察免疫組，即口蹄疫合成肽疫苗于頸部左側注射，豬瘟疫苗和高致病性豬藍耳病疫苗用豬瘟稀釋液按1：1：1比例進行稀釋后于頸部右側注射。

1.4抗體檢測和觀察

第1～7組免疫后每15d采集1次血清，進行各組相應病種免疫抗體轉陽情況檢測，其中1～6組檢測4次。第7組檢測8次。

各組實施免疫后觀察24h，主要觀察精神、飲食和排泄物等有無異常情況。

1.5統(tǒng)計學分析

采用SAS 8.0統(tǒng)計分析軟件進行卡方檢驗。P≥0.05為差異不顯著，0.01≥P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2　結果

到并高于國家要求，至免疫后60d監(jiān)測時仍高于國家要求以上。統(tǒng)計學分析，免疫后15～60d第1組與第6組之間、第2組與第6組之間的差異極顯著（P＜0.01），而30～60d抗體轉陽率第1組與第6組之間、第2組與第6組之間的差異不顯著（P≥0.05）。（見表1）

2.1試驗免疫效果

2.1.1免疫抗體

第1組、第2組與第5組豬瘟免疫抗體轉陽率結果相比較，三組均于免疫后15d達到并高于國家要求，3個試驗組免疫抗體轉陽率至免疫后60d監(jiān)測時轉陽率仍保持100%。統(tǒng)計學分析，免疫后15～60d第1組與第5組、第2組與第5組之間的差異不顯著（P≥0.05）。（見表1）

王加啟等[38]利用瘤胃持續(xù)模擬裝置研究了日糧精粗比為7∶3、1∶1和3∶3時對NDF降解率的影響，結果表明日糧精粗比為1∶1時，NDF降解率最高，當精粗比增加到7∶3時，NDF降解率降低。趙祥等[39]報道，綿羊瘤胃中不同精粗比TMR的NDF有效降解率隨精料水平提高而降低。胡琳等[40]研究了以木薯莖葉為粗料、不同精粗比全混合日糧養(yǎng)分在山羊瘤胃中的降解率，結果表明日糧精粗比為5∶5時NDF有效降解率顯著高于精粗比為2∶8、3∶7、4∶6、6∶4和7∶3的實驗組（P＜0.05）。

第1組、與第3組口蹄疫合成肽疫苗免疫抗體轉陽率相比較，兩組均于免疫后30d達到并高于國家要求，并至免疫后60d監(jiān)測仍高于國家要求以上。統(tǒng)計學分析，免疫后15～60d兩組之間差異極顯著（P＜0.01），而30～60d兩組之間差異不顯著（P≥0.05）（見表1）

第2組、第4組口蹄疫滅活疫苗免疫抗體轉陽率結果相比較，兩組于免疫后45d達到并高于國家要求，至免疫后60d時檢測抗體轉陽率仍高于國家要求。統(tǒng)計學分析，免疫后15～60d兩組之間的差異極顯著（P＜0.01），而45～60d兩組之間差異不顯著（P≥0.05）。（見表1）

第1組、第2組、第6組高致病性豬藍耳病免疫抗體轉陽率結果相比較，三組高致病性豬藍耳病免疫抗體轉陽率均于免疫后30d達

表1 各免疫組免疫抗體轉陽率

2.1.2免疫抗體持續(xù)期效果

豬瘟和高致病性豬藍耳病均在免疫后30d達到國家要求標準，口蹄疫于免疫后45d達到國家要求標準以上，且三種疫病有效免疫抗體維持期長，至免疫后120d時口蹄疫與豬瘟免疫抗體轉陽率仍為100%，高致病性豬藍耳病免疫抗體轉陽率仍為77.78%。（見表2）

表2　免疫抗體持續(xù)期抗體轉陽率

2.2免疫應激反應

各試驗組在免疫后24h內均未出現精神沉郁、飲食減退、嘔吐、腹瀉和死亡等免疫應激反應情況。

3　討論

綜合分析，采用“321”免疫技術的第1組、第2組各病種各階段免疫抗體產生的規(guī)律特點，豬瘟活疫苗、口蹄疫合成肽疫苗、口蹄疫滅活疫苗、高致病性豬藍耳病活疫苗分別于免疫后15d、30d、45d、30d達到國家要求，免疫抗體持續(xù)期至免疫后120d以上，三種疫苗同步兩點免疫未表現各疫苗間相互干擾現象，且可同步產生有效免疫抗體，擴大應用試驗與小組試驗免疫抗體產生規(guī)律較為一致，無論是免疫效果還是實際可操作性均優(yōu)于與之前報告[6］的三種疫苗同步三點免疫，更適用于基層防疫推廣應用。同時，研究結果提示，對三種疫苗同步兩點免疫有效抗體的同步評估需在免疫后35～40d期間為佳。無論是免疫效果還是實際可操作性均優(yōu)于三點免疫。

對應用三種疫苗同步兩點免疫技術中各病種免疫效果的同步評估需在免疫后35～40d期間進行監(jiān)測為佳。

本研究結果表明，“321”免疫技術適用于基層防疫推廣應用，可提高防疫工作效率，縮短免疫周期和免疫空白期，降低基層防疫成本和疫病發(fā)病風險。

4　結論

建立了口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍耳病三種疫苗同步分點兩點免疫技術方法并證明了其臨床應用的可行性與科學性。

口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍耳病三種疫苗同步兩點免疫證明了三種疫苗同步免疫相互間未出現免疫干擾現象，且兩點免疫

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