寧夏地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原體分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

康曉冬劉溪源高?；?/p>

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002；2.寧夏銀川市畜牧技術(shù)推廣服務(wù)中心，寧夏銀川 750001）

寧夏地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原體分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

康曉冬1劉溪源2高?；?

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002；2.寧夏銀川市畜牧技術(shù)推廣服務(wù)中心，寧夏銀川 750001）

為了弄清楚寧夏地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要病原菌的種類、分布情況及藥物敏感性，為防治提供理論依據(jù)，對在寧夏地區(qū)部分奶牛場采集的180份子宮內(nèi)膜炎分泌物進(jìn)行病原菌分離鑒定，并對主要病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。檢出細(xì)菌265株，酵母樣真菌5株，其中葡萄球菌33株（12.22%），鏈球菌3株（1.11%），其他革蘭氏陽性球菌32株（11.85%），革蘭氏陰性桿菌190株（70.37%），芽孢桿菌6株（2.22%），陽性桿菌1株，沒有分離出專性厭氧菌。22種藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明:病原菌對磺胺類、林可酰胺類藥物均已產(chǎn)生不同程度的耐藥性，而氨基糖苷類、喹諾酮類、頭孢類藥物則表現(xiàn)出較好的抑菌效果。

子宮內(nèi)膜炎病原菌分離鑒定藥敏試驗(yàn)

子宮內(nèi)膜炎（Endometritis）是指炎癥僅局限于子宮內(nèi)膜的病理過程。本病是奶牛的常見病和多發(fā)病。該病發(fā)生后，由于子宮黏膜的炎癥變化、炎性產(chǎn)物及細(xì)菌毒素的影響，使奶牛的性周期紊亂，危害精子的活性及胚胎的著床，致使屢配不孕，成為引起奶牛不孕癥的主要原因之一，如果治療不及時或治療不當(dāng)，往往影響奶牛的繁殖力和產(chǎn)奶量，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率很高，據(jù)報道，我國奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率約為20%-50%，奶牛不孕癥的60%-80%是由奶牛子宮內(nèi)膜炎引起。目前，國內(nèi)外針對其感染的主要治療藥物還是以抗微生物類藥物為主。大量的研究表明，奶牛因?yàn)樗幍赜虻淖匀画h(huán)境不同、飼養(yǎng)管理方式的差異、臨床用藥習(xí)慣方式的不同等各種因素，奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌種類存在差異，致病菌的藥物敏感性也存在很大的差異，在藥物選擇壓力作用下，病原菌中的耐藥菌株不斷增多，不僅嚴(yán)重影響了奶牛子宮內(nèi)膜炎的防治，而且奶牛源性病原菌對抗微生物藥物耐藥性的形成也給人類健康帶來了嚴(yán)重的潛在威脅。

因此，針對奶牛子宮內(nèi)膜炎主要病原菌進(jìn)行分離鑒定，明確主要致病菌的種類及分布流行情況，對病原菌進(jìn)行危害性分析和評估，在此基礎(chǔ)上針對主要致病菌進(jìn)行體外抗微生物藥物敏感試驗(yàn)，對于提高奶牛子宮內(nèi)膜炎的治愈率，指導(dǎo)臨床用藥具有積極的意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1培養(yǎng)基、微生物鑒定卡等

營養(yǎng)瓊脂（批號130716），北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；麥康凱瓊脂（MAC，批號：20130624）、伊紅美蘭瓊脂（EMB，批號20120928）、甘露醇高鹽瓊脂（MSA，批號20131114）、TTC-沙堡羅培養(yǎng)基（批號20121017）、硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基（批號20132529）、固體厭氧培養(yǎng)基（批號20131223）、2.5L厭氧培養(yǎng)帶（含厭氧產(chǎn)氣包、氧氣指示劑），青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；脫纖維綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制。

革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡、革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定卡、酵母菌鑒定卡由美國 BioMerieux，Inc生產(chǎn)。

1.1.2抗生素藥敏紙片

四環(huán)素（30ug/片，批號20150521）、慶大霉素（10ug/片，批號20150429）、鏈霉素（10ug/片，批號20150513）、卡那霉素（30ug/片，批號201505/9）、丁胺卡那霉素（30ug/片，批號20150524）、阿莫西林（10ug/片，批號20150511）、林可霉素（2ug/片，批號20150727）、環(huán)丙諾氟沙星（5ug/片，批號20150727）、氧氟沙星（5ug/片，批號20150514）、諾氟沙星（10ug/片，批號20150813）、先鋒霉素Ⅳ（30ug/片，批號20150525）、先鋒霉素Ⅴ（30ug/片，批號20150816）、先鋒霉素Ⅵ（30ug/片，批號20150423）、頭孢曲松（30ug/片，批號20150720）、哌拉西林（100ug/片，批號150508）、紅霉素（15ug/片，批號150521）、氨芐西林（10ug/片，150407）、恩諾沙星（5ug/片，批號150519）、氟苯尼考（30ug/片，批號150609）、頭孢噻肟（30ug/片，批號150416）、復(fù)方新諾明（23.75ug/片，批號150520）、萬古霉素（30ug/片，批號150514）等22種藥敏試紙片，杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.3主要儀器

超凈工作臺（SW-CJ-1FD，蘇凈集團(tuán)安泰公司）

全自動微生物鑒定系統(tǒng)（VITEK-2-Compact15，法國梅里埃公司）電熱恒溫培養(yǎng)箱（PHP-9162，浙江托普儀器有限公司）電子比濁儀（DensiCHEK Plus，美國 BioMerieux，Inc）

1.2方法

1.2.1子宮內(nèi)膜炎子宮分泌物采集

選擇臨床檢查判定為子宮內(nèi)膜炎奶牛，先掏空奶牛直腸宿糞，并用1%的高錳酸鉀溶液清洗外陰周圍；然后用75%的酒精棉球?qū)﹃幍肋吘壖皟?nèi)側(cè)進(jìn)行消毒；采用直把輸精的方法子宮內(nèi)插入改造并滅菌的輸精槍外套，抽去輸精槍，用一次性滅菌注射器輸入50ml滅菌生理鹽水，輕輕按摩子宮，回吸子宮內(nèi)液體約10ml左右，置于保溫箱內(nèi)速送實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2.2病原菌分離培養(yǎng)

（1）病原菌的好氧培養(yǎng)

搖勻采集的樣品，用無菌棉簽蘸取并均勻分別平鋪于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、脫纖維綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MAC）、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基（EMB）、甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基（MSA）、TTC-沙堡羅培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h（沙堡羅氏培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)48h），觀察平皿上的菌落形態(tài)、大小、顏色，挑取典型菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色、鏡檢，并將所有初步分離的菌株進(jìn)一步純化培養(yǎng)。

（2）病原菌的厭氧培養(yǎng)

搖勻采集的樣品，用滅菌移液器槍頭吸取1ml接種于硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基9ml中，置入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋，培養(yǎng)帶中放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋和氧氣指示劑，迅速盡量擠凈培養(yǎng)帶內(nèi)氣體，封口，37℃恒溫厭氧增菌培養(yǎng)72h；將厭氧增菌培養(yǎng)物接種厭氧固體培養(yǎng)基同上述方法厭氧培養(yǎng)72h；挑取疑似厭氧菌接種脫纖維綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基做耐氧試驗(yàn)，同時繼續(xù)接種固體厭氧培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，如同時在兩種培養(yǎng)基上都生長，表明該菌為兼性厭氧，棄去，如在脫纖維綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)不生長而在厭氧培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)的情況下生長，表明該菌為專性厭氧菌，保存待菌種鑒定。

1.2.3病原菌鑒定

將已經(jīng)分離純化的菌種新鮮培養(yǎng)物，用滅菌0.45%氯化鈉溶液制成3ml菌懸液，電子比濁儀測定菌懸液濃度，調(diào)整其濃度為BioMerieux，Inc鑒定卡要求濃度。根據(jù)革蘭氏染色鏡檢的結(jié)果，用相對應(yīng)的鑒定卡，VITEK-2-Compact15全自動微生物鑒定系統(tǒng)上機(jī)進(jìn)行菌種鑒定。

1.2.4藥敏試驗(yàn)

（1）菌懸液濃度調(diào)節(jié)挑取純培養(yǎng)的菌落到滅菌生理鹽水，用電子比濁儀測定菌懸液濃度，調(diào)節(jié)其濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝弧?/p>

（2）菌液涂布接種和貼藥敏紙片滅菌棉簽蘸取菌懸液，均勻涂布在9cm普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（鏈球菌屬和巴士桿菌屬涂布接種血清瓊脂培養(yǎng)基），菌液吸附數(shù)分鐘后，再用滅菌鑷子將藥敏紙片逐一貼于培養(yǎng)基的表面，37℃培養(yǎng)18h后用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑。

（3）藥敏試驗(yàn)結(jié)果的判定及記錄游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑并記錄。結(jié)果判定選用臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）的標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法規(guī)定（2012版）。

2　結(jié)果與分析

2.1分離鑒定結(jié)果

采自寧夏地區(qū)的180份奶牛子宮內(nèi)膜炎子宮分泌物樣本，共分離鑒定出細(xì)菌265株，占98.15%（265/270），其中葡萄球菌屬33株，占12.22%，產(chǎn)色葡萄球菌、緩慢葡萄球菌等10種；鏈球菌3株，占1.11%，包括豬鏈球菌Ⅰ2株和不解乳鏈球菌1株；其他陽性球菌32株，占11.85%，包括鶉雞腸球菌、毗鄰顆粒鏈菌等13種；革蘭氏陰性桿菌190株，占70.37%，包括大腸埃希菌、放射根瘤菌、少動鞘氨醇桿菌等21種；芽孢桿菌6株，2.22%；其他革蘭氏陽性桿菌1株。酵母樣真菌5株，占1.85%（5/270），包括克柔假絲酵母4株和熱帶假絲酵母1株。沒有分離出專性厭氧菌。寧夏地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌的優(yōu)勢菌依次分別為：大腸埃希菌（55/270）、放射根瘤菌（39/270）、少動鞘氨醇桿菌（31/270）、巴斯德菌（28/270）、產(chǎn)色葡萄球菌（28/270）。2種以上菌混合感染樣本98份，占總數(shù)54.44%（98/180）。

2.2藥敏試驗(yàn)

從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可以看出：大腸埃希菌對紅霉素、萬古霉素、克林霉素耐藥，對四環(huán)素、恩諾沙星中介，對其余17種抗菌藥物表現(xiàn)敏感；放射根瘤菌克林霉素耐藥，對氨芐西林中介，對其余20種抗菌藥物表現(xiàn)敏感；少動鞘氨醇桿菌對阿莫西林、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明、克林霉素中介，對其余18種抗菌藥物均表現(xiàn)敏感；巴斯德菌對復(fù)方新諾明耐藥，對頭孢曲松、阿莫西林、頭孢噻肟、克林霉素中介，對其余17種抗菌藥物均表現(xiàn)敏感；產(chǎn)色葡萄球菌對萬古霉素耐藥，對紅霉素、恩諾沙星、復(fù)方新諾明中介，對其余18種抗菌藥物均表現(xiàn)敏感。具體見表1。

表1 寧夏地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌藥敏試驗(yàn)?。▎挝唬簃m）

3　討論

（1）通過對寧夏地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎子宮分泌物108個樣本進(jìn)行病原微生物的分離鑒定后發(fā)現(xiàn)，分離出的微生物種類較多，但優(yōu)勢菌依次分別為大腸埃希菌、放射根瘤菌、少動鞘氨醇桿菌、巴斯德菌、產(chǎn)色葡萄球菌，特別是放射根瘤菌的分離率較高，這與國內(nèi)其他學(xué)者的相關(guān)報道不同。放射根瘤菌屬于根瘤菌科，土壤桿菌屬，是雙子葉植物和裸子植物的根瘤菌，可以與植物形成共生關(guān)系，廣泛存在于土壤中，常被作為生物工程菌。一般對人不致病，但當(dāng)人體免疫力低下時易造成機(jī)會感染，可引起敗血癥、心內(nèi)膜炎、尿路感染或腹膜炎等，是人臨床少見的條件致病菌[1-3］。動物實(shí)驗(yàn)表明，放射根瘤菌在正常情況下對動物不致病[4］，但都伴隨其他致病菌在子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮分泌物檢出，提示在其他致病菌感染乳腺引起奶牛子宮內(nèi)膜炎，奶牛機(jī)體免疫力低下的情況下，作為一種條件性致病菌，放射根瘤菌可能成為奶牛子宮內(nèi)膜炎的致病菌。關(guān)于放射根瘤菌對奶牛子宮內(nèi)膜炎的致病性問題，有必要做進(jìn)一步的深入研究。

（2）隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株不斷增多，細(xì)菌微生物對常用抗菌藥物的耐藥性愈來愈強(qiáng)，給奶牛疫病治療的藥物選擇帶來很大的困難。而且有研究表明，這些存在于質(zhì)?；蛉旧w的耐藥基因可以結(jié)合方式在各菌種、動物及人類之間傳播。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同細(xì)菌對同種藥物的敏感性和同種細(xì)菌對不同藥物的敏感性均有差異。因此，在臨床治療程中，如選擇幾種比較敏感的藥物合用或交替使用，可以減少單個藥物的使用劑量或使用時間，減緩耐藥菌株的產(chǎn)生。

[1]高峰平.血培養(yǎng)檢出放射根瘤菌1例[J］.試驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，30 （4）：333-336.

[2]秦潔，錢揚(yáng)會.腎臟穿刺液檢出放射根瘤菌1例[J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育，2012，19（4）：40.

[3]張月紅，陸建紅，陳國軍，等.腹腔積液檢出放射根瘤菌1例[J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2013，23（20）：5031.

[4]康曉冬，劉溪源，楊慧君，等.寧夏地區(qū)奶牛乳腺炎源性放射根瘤菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35 （12）：92-95.

寧夏農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新先導(dǎo)資金項(xiàng)目“寧夏地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要病原菌分離鑒定及多重PCR檢測方法的建立”（項(xiàng)目編號: NKYG-14-19）.

康曉冬（1971-），男，寧夏中寧縣人，研究員，研究方向:牛羊反芻家畜疫病防制研究。