上海地區(qū)人博卡病毒在兒童急性呼吸道感染的研究

宋靖榮 高寒春 林珍 亢娟 葉劍敏 楊子珍 謝志萍

201900 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院兒科(宋靖榮、林珍、亢娟)；100052 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(高寒春、謝志萍)；201900 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院(葉劍敏)；201900 上海普陀區(qū)中心醫(yī)院(楊子珍)

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·論著·

上海地區(qū)人博卡病毒在兒童急性呼吸道感染的研究

宋靖榮 高寒春 林珍 亢娟 葉劍敏 楊子珍 謝志萍

201900 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院兒科(宋靖榮、林珍、亢娟)；100052 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(高寒春、謝志萍)；201900 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院(葉劍敏)；201900 上海普陀區(qū)中心醫(yī)院(楊子珍)

宋靖榮、高寒春為共同第一作者

目的 了解上海地區(qū)人博卡病毒(HBoV)在兒童急性呼吸道感染中的流行情況和臨床特點。方法 上海地區(qū)在2012年1月至2012年12月共收集271例急性呼吸道感染患兒的鼻咽抽吸物，采用巢式聚合酶鏈反應(yīng)(Nested PCR)方法檢測人博卡病毒NS1基因、并經(jīng)測序確認(rèn)，對所獲得的基因序列進(jìn)行同源性和進(jìn)化分析，博卡病毒陽性樣本同時檢測鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等8種呼吸道相關(guān)病毒。結(jié)果 271例標(biāo)本中共檢出HBoV陽性31例，檢出率11.4%；21例存在混合感染，全年均有檢出，陽性患兒中位年齡17個月(4個月-4歲)，診斷包括上呼吸道及下呼吸道感染，臨床表現(xiàn)包括發(fā)熱、陣發(fā)性咳嗽、咳痰、腹瀉、嘔吐、咽充血、濕羅音等，無死亡病例，門診患者檢出率明顯高于住院患者；序列分析表明其中29例為HBoV1、2例為HBoV2、與參考株的核苷酸同源性為99%-100%，氨基酸同源性96%-100%。結(jié)論 HBoV1是上海地區(qū)急性呼吸道感染患兒中的重要病原，HBoV2在該地區(qū)首次檢出，臨床癥狀及診斷無特異性。

Fund programs: National Natural Science Foundation of China(81100005)

急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection ARTI)是兒童常見疾病，是引起死亡的常見原因，除目前公認(rèn)的呼吸道合胞病毒，流感病毒，副流感病毒，腺病毒，鼻病毒，冠狀病毒外，仍有約60%兒童的急性呼吸道感染，雖然被認(rèn)為是由于病毒引起，但其確切的病原尚未闡明。瑞典學(xué)者Tobias Allander在2005年通過對兒童急性呼吸道感染樣本大規(guī)模采用隨機(jī)PCR擴(kuò)增測序和生物信息學(xué)結(jié)合的方法進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)了新的細(xì)小病毒，人博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)[1]。隨后在世界范圍引起重視，據(jù)報道呼吸道標(biāo)本的HBoV DNA陽性檢出率為0．8%-19 %，并在血清，糞便及尿液標(biāo)本中均有檢出[2-4]，并有證實HBoV感染與兒童急性呼吸道感染有關(guān)[4]。目前將Allander發(fā)現(xiàn)的人博卡病毒稱為HBoV1，后來報道的與HBoV親緣關(guān)系相近的三種病毒分別命名為人類博卡病毒2，3,4(HBoV2,3,4)。本課題組前期已證實HBoV1在蘭州地區(qū)呼吸道標(biāo)本中存在，并首先檢出HBoV2[5]，近期在蘭州呼吸道標(biāo)本中又發(fā)現(xiàn)有HBoV3的檢出[6]。但HBoV4尚未在呼吸道標(biāo)本中檢出。為更好了解HBoV在我國分布及流行特點，我們收集上海地區(qū)2012年1月至2012年12月急性呼吸道感染兒童的鼻咽抽吸物標(biāo)本，探討該地區(qū)HBoV的分子流行病學(xué)及臨床特點。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集 收集2012年1月至2012年12月因急性呼吸道感染在上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院，上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院，上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院就診的患兒的鼻咽抽吸物標(biāo)本，共271份，急性呼吸道感染診斷符合《諸福棠實用兒科學(xué)》第7版。所有患兒于就診當(dāng)日采集標(biāo)本，方法參見文獻(xiàn)[5]，采集過程均告知患兒家屬并征得同意。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本處理：快速溶解鼻咽分泌物樣本，置于漩渦振蕩器上充分震蕩混勻，1 500×g離心10 min，提取樣本核酸(德國Qiagen公司)進(jìn)行病毒檢測，操作過程均按說明書進(jìn)行。

1.2.2 HBoV核酸檢測：合成針對HBOV病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因的特異性引物,采用巢式PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，實驗引物及反應(yīng)條件參見文獻(xiàn)[5]。引物由英俊生物公司(北京)合成，每次PCR反應(yīng)均設(shè)陽性(HBoV陽性質(zhì)粒)及陰性(無菌水)對照，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳進(jìn)行鑒定。exTaq 酶為日本TaKaRa 公司產(chǎn)品。

1.2.3 序列測定及分析：擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，所用引物為通用引物。所測得的序列與GenBank 中細(xì)小病毒科其他成員及已發(fā)現(xiàn)的HBoV基因序列進(jìn)行比較分析。序列比較和進(jìn)化分析所用到的基因序列在Genbank中的序列號為EU984232, EF450717, DQ000496, DQ000495, FJ170279，F(xiàn)J170282, NC001540, NC004442, NC000883,EU918736.1,FJ973561.2。

1.3 混合感染分析 HBoV陽性標(biāo)本通過文獻(xiàn)[5]所報道的RT-PCR或PCR方法，進(jìn)行流感病毒(IFV)、副流感病毒(PIV)，冠狀病毒HKU1(HCoV-HKU1)、冠狀病毒NL63( HCoV-NL63)、偏肺病毒(HMPV)等其他常見呼吸道病毒檢測，了解混合感染的情況。

1.4 臨床資料分析 患兒臨床資料由本課題組醫(yī)生統(tǒng)一登記，根據(jù)檢測結(jié)果進(jìn)行HBoV的臨床及流行病學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用Chi-square檢驗或校正Chi-square檢驗,計量資料采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

圖1 HBV上海株(SH)與HBoV標(biāo)準(zhǔn)株EU984232, EF450717, DQ000496, DQ000495,FJ170279,FJ170282,NC001540,NC004442,NC000883,EU918736.1,FJ973561.2基于NS1基因部分序列親緣性關(guān)系樹 Fig.1 Phylogenetic trees based on the partial nonstructural protein 1(NS1) nucleotide sequences of human bocavirus in this study and those of reference strains(EU984232, EF450717,DQ000496, DQ000495,FJ170279,FJ170282, NC001540,NC004442,NC000883,EU918736.1,FJ973561.2) form GenBank

2.1 HBoV基因檢測結(jié)果及序列分析 271例NAPs樣本中有31例檢測陽性，將測序結(jié)果在美國生物醫(yī)學(xué)信息中心(NCBI)GeneBank中多株已知HBoV序列進(jìn)行Blast比較,結(jié)果顯示29例陽性樣本與HBoV1屬于同一進(jìn)化簇，其氨基酸同源性在96%-100%之間，核苷酸同源性在99%-100%之間，2例(SH137,SH212)與HBoV2標(biāo)準(zhǔn)株FJ170282的核苷酸同源性分別為99%，氨基酸同源性99%，屬同一進(jìn)化簇，未發(fā)現(xiàn)HBoV3，HBoV4。進(jìn)一步系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果見圖1。

2.2 混合感染的檢測結(jié)果 出的29例HBoV1陽性標(biāo)本中19例為混合感染，10例為單獨HBoV感染，混合感染率65.5%，其中有14例同時感染1種病毒(3例ADV,2例RSV，4例HRV，3例PIV3,2例PIV4)，5例同時感染2 種病毒(2例ADV+PIV3，1例ADV+PIV4,1例ADV+HRV，1例HRV+PIV4)。 2例HBoV2均同時感染PIV3及ADV。

2.3 流行病學(xué)分析 全年共收集鼻咽抽吸物樣本271例，男性181例，女性90例；男女之比為2∶1,共檢出陽性31例，檢出率11.4%(31/271)；其中HBoV1的檢出率為10.7%(29/271)，陽性患兒中男性23例，女性8例，男女檢出率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.865，P>0.05)；陽性患兒中位年齡17個月(4個月-4歲)，其中12-23月患兒檢出率最高，大部分集中在6個月到2歲，各年齡組檢出分布見圖2。各年齡組間有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.25，P<0.05)，HBoV在研究年中各月均有檢出，7月檢出率最高，具體分布見圖3。其中門診樣本120例，住院樣本151例，門診患兒檢出24例(20.0%)，住院患兒中檢出7例(4.6%)，門診和住院患兒檢出率之間有差異統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.58，P<0.05)。

圖2 人博卡病毒陽性患兒年齡分布Fig.2 Age of HBoV in children with actue respiratory tract infection

圖3 人博卡病毒陽性患兒時間分布圖Fig.3 Seasonal distribution of HBoV in children with actue respiratory tract infection

2.4 HBoV患兒感染臨床特征 29例HBoV1陽性患兒臨床診斷包括8例上呼吸道感染和21例下呼吸道感染，其中診斷為上呼吸道感染7例，扁桃體炎1例，支氣管炎11例，支氣管肺炎7例，肺炎2例，毛細(xì)支氣管炎1例?；純褐?例發(fā)熱，平均熱程2.7 d，咽充血29例，咳嗽28例，咯痰12例，鼻塞流涕等卡他癥狀17例，發(fā)紺1例，19例肺部有濕啰音，其中4例有哮鳴音。部分患兒伴有腹瀉(4例)、嘔吐(3例)。無死亡病例。6例住院患兒，住院天數(shù)4-10 d，平均天數(shù)為 6.8 d。HBoV陽性患兒中2例有基礎(chǔ)疾病者.均為先天性心臟病。

2例HBoV2患兒感染特征如下：SH137:男性，36個月，2012年8月發(fā)病，合并感染ADV,診斷為支氣管肺炎，住院治療11 d，治愈出院，臨床癥狀有發(fā)熱(39.5 ℃)，咳嗽，咳痰，咽充血，流涕，肺部濕啰音。SH212:女，12個月，2012年11月發(fā)病，合并感染PIV3,診斷為急性上呼吸道感染，門診治療5 d，治愈，臨床癥狀有咳嗽，咽充血，流涕。

3 討論

人博卡病毒(HBoV)屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒亞科，博卡病毒屬，為線性單鏈DNA(ssDNA)，是除B19細(xì)小病毒和人細(xì)小病毒4(PARV4)外，被發(fā)現(xiàn)的與人類疾病相關(guān)的細(xì)小病毒之一，目前HBoV已分為1-4型，其在世界各國廣泛流行，世界各地均有報道在呼吸道、腸道、血清及尿液標(biāo)本中檢出HBoV，其中HBoV1，HBoV2和HBoV3在呼吸道及腸道標(biāo)本中均有檢出，HBoV4僅在腸道標(biāo)本中檢出。

綜合前期相關(guān)研究，HBoV1在許多國家已被檢測到，呈世界范圍流行，在我國，多地區(qū)也有HBoV1的流行病學(xué)報道，檢出率在1.4%-19%不等，大多數(shù)感染HBoV1的兒童年齡<2歲，一年四季均可發(fā)生，未表現(xiàn)出明顯的季節(jié)分布，臨床診斷以肺炎居多，同時可能伴有腹瀉，與其他呼吸道病毒混合感染較常見[7]，我們的研究表明，在本研究年中，上海地區(qū)HBoV1的檢出率為10.7%，高于上海2006-2008年的檢出率[8]，同時也高于蘭州，天津，南京的檢出率[6，9，10]，與韓國[11]相仿，與文獻(xiàn)報道多發(fā)生在冬春季節(jié)不同，本研究檢出以夏秋季節(jié)為主，年齡在6個月至2歲的兒童陽性率最高，與年齡小于6個月及兩歲以上的兒童相比有統(tǒng)計學(xué)意義，與上海地區(qū)既往研究不同[8]，而這種年齡分布可能與生后6個月前有母親胎傳的免疫保護(hù)及隨年齡增加逐漸增強(qiáng)的細(xì)胞免疫有關(guān)。大部分HBoV1為下吸呼道感染，混合感染率65.5%，ADV是混合感染的主要病毒，HBoV1感染患兒的臨床表現(xiàn)主要為陣發(fā)性咳嗽，發(fā)熱等，X胸片改變無特殊，一些研究報道HBoV1與重癥肺疾病及兒童喘息密切相關(guān)[4]，本研究中我們發(fā)現(xiàn)門診的感染率明顯高于住院患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明可能HBoV感染后臨床癥狀較輕，并且本研究中29例HBoV1患者中，4例出現(xiàn)喘息癥狀，其中3例為混合感染，分別是RSV,PIV3，ADV+PIV3各1例，故暫不能說明與喘息有關(guān)。

2009年Arthur在糞便標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)HBoV2后[12]，本課題組繼而從呼吸道標(biāo)本中檢出HBoV2[5],后續(xù)研究顯示HBoV2型在兒童糞便標(biāo)本中檢出率較高，呼吸道標(biāo)本中檢出率低，且陽性患者較多出現(xiàn)胃腸道癥狀[7]，蘭州地區(qū)既往研究顯示，急性呼吸道感染兒童的呼吸道標(biāo)本中HBoV2的檢出率0.38%-4.2%，且均有腹瀉癥狀及混合感染[6]，本研究在上海地區(qū)呼吸道鼻咽分泌物標(biāo)本中檢出HBoV2 兩例，檢出率0.7%，年齡均<2歲，在夏秋季發(fā)病，均同時感染PIV3及ADV,診斷包括上呼吸道及下呼吸感染，臨床表現(xiàn)與HBoV1無殊，均無腹瀉，無喘息，由于陽性標(biāo)本少，需要后期更大樣本及長期的流行病檢測了解HBoV2的流行情況。

HBoVs作為一種新出現(xiàn)的病原體，從HBoV1到HBoV4的發(fā)現(xiàn)提示不同地區(qū)流行的病毒株的核苷酸序列有較高的多樣性。HBoV1與HBoV2的氨基酸同源性為67%-8O%，HBoV3被認(rèn)為可能是來自HBoV1和HBoV2的重組株；同樣，HBoV4被認(rèn)為是由HBoV2和HBoV3結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)重組產(chǎn)生[7]。目前不排除我國HBoV存在重組和變異的可能，而病毒重組可導(dǎo)致病毒抗原性變異，引起大流行，因此對我國HBoV的分子流行病進(jìn)行長期監(jiān)測有著重要意義。我們采用巢式PCR方法擴(kuò)增HBoV NS1片段，共檢出31例HBoV，經(jīng)測序分析并與已公布的標(biāo)準(zhǔn)株序列同源性在99%-100%之間，氨基酸序列同源性在96%-100%之間，確定為人博卡病毒，進(jìn)一步系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果提示，29例陽性標(biāo)本屬于HBoV1,2例屬于HBoV2，與既往上海地區(qū)不同，我們首次在上海地區(qū)檢出HBoV2，但未檢出HBoV3和HBoV4。

通過對上海地區(qū)急性呼吸道感染患兒呼吸道分泌物中HBoV基因的檢測和分析證實，上海地區(qū)HBoV流行已HBoV1為主，同時首次發(fā)現(xiàn)有HBoV2出現(xiàn)，由于發(fā)現(xiàn)HBoV時間不長，本研究為回顧性研究，時間段較為局限，臨床較難設(shè)置正常對照組等不足，仍需要更廣泛深入研究更好了解其與兒童急性呼吸道感染相關(guān)性及感染后臨床嚴(yán)重程度等問題，同時了解HBoV在兒童急性呼吸道感染中的病原學(xué)及流行病學(xué)規(guī)律。

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Molecular epidemiological and clinical features of human bocavirus in children with acute respiratory tract infection in Shanghai.

SongJingrong,GaoHanchun,LinZhen,KangJuan,YeJianmin,YangZizhen,XieZhiping

ShanghaiNinthPeople’sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,DepartmentofPediatrics,Shanghai201900,China(SongJR,LinZ,KangJ);NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100052,China.(GaoHC,XieZP);XinhuaHospitalAffiliatedtoMedicineSchoolofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai201900,China(YeJM);ShanghaiPutuoDistrictCentralHospital,Shanghai201900,China(YangZZ)

SongJingrongandGaoHanchunarethefirstauthorswhocontributedequallytothearticle

SongJingrong,Email:songyang92006@163.com,XieZhiping,Email:xiezhiping@126.com

Objective To investigate the molecular epidemiology and clinical characteristics of human bocavirus in children with acute respiratory tract infection in Shanghai, China. Methods Between January 2012 and December 2012, 271 nasopharyngeal aspiration (NPA) samples were collected from children who had been hospitalized for acute respiratory tract infection at Shanghai, China. HBoV NS1 gene was detected by the nested polymerase chain reaction.In the further, other common respiratory viruses (HRV,RSV, ADV et al) was screened in HBoV positive samples, All PCR positive products were sequenced and phylogenetic analysis. Results The overall frequency of HBoV, infection was 11.4%. 21of 31 HBoV positive sample tested were mix-infection. HBoV was detected from all over year. Children with HBoV varied in age from 4 months to 4-years (median age,17 months).The clinical diagnoses of HBoV positive patients included acute upper respiratory tract infection and lower respiratory tract infection. The clinical presentations of HBoV positive children included fever, cough, sputum production, diarrhea, vomiting; pharynx engorgement, crackles, wheezing. There being a statistically significant difference in the detection rates of HBoV between the outpatients and inpatients. The HBoV NS1 gene sequences phylogenetic analysis revealed that 29 HBoV1 NS1 sequences shared 99%-100% nucleotide identity with the human bocavirus strain, whereas the amino acid identity was 96%-100%. The two HBoV2 NS1 sequences shared 99% nucleotide sequence identity with HBoV2 strain FJ170282 respectively. Conclusions Human bocavirus was distributed in Shanghai region, HBoV1 was dominant and HBoV2 was detected at the first time. The symptom and clinical diagnoses has no specificity with patients with other common respiratory viruses.

Respiratory tract infection; Human bocavirus; Epidemiology; Child

宋靖榮Email: songyang92006@163.com;謝志萍 Email：xiezhiping@126.com；

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.009

呼吸道感染；人博卡病毒；流行病學(xué)；兒童

國家自然科學(xué)基金(81100005)

2016-01-16)