不同精粗比飼糧中添加甘露寡糖對綿羊體外瘤胃發(fā)酵的影響

陳志龍　曾燕霞　王　林　趙　臣　鄭　琛

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州730070)

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不同精粗比飼糧中添加甘露寡糖對綿羊體外瘤胃發(fā)酵的影響

陳志龍曾燕霞王林趙臣鄭琛*

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州730070)

本試驗旨在研究不同精粗比飼糧中添加甘露寡糖(MOS)對綿羊體外瘤胃發(fā)酵的影響。采用4×6二因子析因試驗設(shè)計，在4種不同精粗比(20∶80、30∶70、40∶60、50∶50)飼糧中分別添加6個水平(0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%)的MOS，制備出24種底物，以體外產(chǎn)氣法對各底物培養(yǎng)3、6、9、12和24 h，對體外培養(yǎng)液pH、氨態(tài)氮(NH3-N)濃度和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度進行測定。結(jié)果表明：精粗比對培養(yǎng)液pH、NH3-N濃度、總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度和丁酸含量產(chǎn)生了顯著影響(P<0.05)，MOS水平對培養(yǎng)液NH3-N濃度產(chǎn)生了顯著影響(P<0.05)，精粗比與MOS水平對培養(yǎng)液NH3-N濃度產(chǎn)生顯著的交互作用(P<0.05)。隨著精粗比的提高，培養(yǎng)液TVFA濃度和丁酸含量升高，而pH和NH3-N濃度降低；隨著MOS水平升高，培養(yǎng)液NH3-N濃度略有升高。綜合得出，不同精粗比飼糧中添加MOS對綿羊體外瘤胃發(fā)酵NH3-N濃度有顯著影響，其中MOS的影響較輕微，尚未呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，主體起作用的仍是精粗比；飼糧精粗比的提高增加了綿羊體外瘤胃發(fā)酵VFA濃度，降低了pH和NH3-N濃度。

精粗比；甘露寡糖；綿羊；pH；揮發(fā)性脂肪酸；氨態(tài)氮

功能性寡糖無論在體內(nèi)還是體外都能促進有益菌群如雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖，改善腸道微生態(tài)環(huán)境[1]。甘露寡糖(mannanoligosaccharides，MOS)因其具有穩(wěn)定、安全無毒、無殘留等特點以及改善腸道菌群、提高免疫力等益生作用成為功能性寡糖應(yīng)用較為廣泛的一種[2-6]。曾有報道認(rèn)為，因為反芻動物瘤胃微生物對寡糖的強烈降解作用以及可以利用纖維素、半纖維素、果膠等物質(zhì)合成寡糖，所以對反芻動物添加寡糖意義不大[7]。而且由于寡糖可以改善動物胃腸道內(nèi)環(huán)境，對幼齡反芻動物如腹瀉等胃腸道疾病具有良好的緩解及預(yù)防作用，以及寡糖可通過幼齡反芻動物尚不健全的瘤胃到達腸道發(fā)揮其益生作用等一系列原因，使寡糖有限的研究也集中在幼齡反芻動物上[8]。事實上，無論瘤胃微生物對寡糖有多大降解作用，反芻動物瘤胃中仍然有一定水平的寡糖發(fā)揮其益生作用，寡糖對反芻動物瘤胃發(fā)酵也具有重要的調(diào)控作用[9]。

飼糧結(jié)構(gòu)如精粗比以及飼糧類型的不同會導(dǎo)致瘤胃微生物環(huán)境如pH、瘤胃微生物區(qū)系等的改變，從而改變其對寡糖的發(fā)酵效率，可能會與MOS產(chǎn)生一定的交互作用，因此本試驗選用西北地區(qū)綿羊飼養(yǎng)中常用的飼草料并固定飼糧組成，通過體外培養(yǎng)的方法，探討不同精粗比飼糧條件下MOS對綿羊體外瘤胃發(fā)酵的作用，為MOS在反芻動物上的進一步研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

MOS購自奧特奇生物制品(中國)有限公司。

1.2試驗設(shè)計

試驗采用4×6二因子析因試驗設(shè)計，設(shè)精粗比(A)和MOS(B)2個因子，飼糧精粗比分別為20∶80(A1)、30∶70(A2)、40∶60(A3)及50∶50(A4)，在每個精粗比飼糧中分別添加6個水平的MOS，即0(B1)、0.4%(B2)、0.8%(B3)、1.2%(B4)、1.6%(B5)和2.0%(B6)，共制成24種底物進行體外瘤胃發(fā)酵試驗。

1.3試驗動物及飼養(yǎng)管理

1.4試驗飼糧

參照我國《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)中育成公羊營養(yǎng)需要量(體重30 kg，日增重100 g)，配制4個不同精粗比的飼糧，以此為發(fā)酵底物。試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1　試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供Premix provided the following per kg of diets:S 200 mg,Fe 25 mg,Zn 40 mg,Cu 8 mg,I 0.3 mg, Mn 40 mg, Se 0.2 mg, Co 0.1 mg，VA 940 IU,VE 20 IU。

2)計算值 Calculated values。

1.5體外產(chǎn)氣試驗

試驗參照Menke等[10]推薦的方法進行體外產(chǎn)氣試驗。

晨飼(08:00)前在4只綿羊瘤胃內(nèi)不同位點采集足量瘤胃液，經(jīng)4層紗布過濾飼料顆粒后灌入已經(jīng)預(yù)熱達39 ℃并通有CO2的暖瓶中，待采集足量瘤胃液后立即蓋嚴(yán)瓶口，迅速返回實驗室，持續(xù)通入CO2氣體5 min，然后迅速與緩沖液以1∶2的比例制成混合液。在已加好樣品(取樣量0.2 g左右)和MOS的玻璃注射器(德國Haeberle)中加混合液30 mL，并排盡注射器內(nèi)的氣體，放入已預(yù)熱(39 ℃)的恒溫振蕩水浴箱中培養(yǎng)3、6、9、12和24 h。每個水浴箱設(shè)置2個空白對照(100 mL玻璃注射器只加入30 mL混合液)。每個樣品每個時間點做3個重復(fù)。

1.6測定指標(biāo)

1.6.1培養(yǎng)液pH

各時間段培養(yǎng)結(jié)束后，將消化液及殘渣完全轉(zhuǎn)入至100 mL的塑料離心管中，立即采用高精度酸度計(PB-10，德國Sartorius)測定培養(yǎng)液pH。

1.6.2培養(yǎng)液氨態(tài)氮(NH3-N)濃度

將測定pH后的塑料離心管3 000 r/min離心15 min，離心后采集上清液并存儲在-20 ℃冰箱待測。NH3-N濃度參照馮宗慈等[11]改進的比色法使用分光光度計測定，培養(yǎng)液取樣量為0.2 mL。本試驗測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

Y=1.767 6X-0.027 6(R2=0.997 9)。

式中：Y為NH3-N質(zhì)量(mg)；X為吸光度值。

根據(jù)曲線得到的質(zhì)量換算為濃度。

1.6.3培養(yǎng)液揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度

使用Aglient 6890N型氣相色譜儀測定VFA濃度。色譜柱為HP 19091N-213毛細(xì)管柱(美國Aglient)。色譜條件為：進樣口溫度200 ℃，N2流量2.0 mL/min，分流比40∶1，程序升溫模式(120 ℃ 3 min，然后10 ℃/min至180 ℃，保持1 min)，火焰離子檢測器(FID)溫度250 ℃，F(xiàn)ID空氣、H2和尾吹氣(N2)流量分別為450、40和45 mL/min。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件進行二因子方差分析，差異顯著時，采用Tukey法(方差齊)或Tamhane法(方差不齊)進行多重比較。以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果與分析

2.1不同精粗比飼糧中添加MOS對體外培養(yǎng)液pH的影響

從表2可以看出，隨精粗比的增加，除了3 h外各時間點的pH逐漸降低，精粗比對培養(yǎng)液pH產(chǎn)生了顯著影響(P<0.05)；MOS水平對體外培養(yǎng)液pH未產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)；精粗比與MOS水平也沒有對培養(yǎng)液pH產(chǎn)生顯著交互作用(P>0.05)。培養(yǎng)3 h，A2組培養(yǎng)液pH顯著高于A4組(P<0.05)；培養(yǎng)6和9 h，A4組培養(yǎng)液pH顯著低于其余3組(P<0.05)；培養(yǎng)12和24 h，A1組培養(yǎng)液pH顯著高于其余3組(P<0.05)，且在培養(yǎng)24 h時A2和A3組培養(yǎng)液pH也顯著高于A4組(P<0.05)。

表2　不同時間點體外培養(yǎng)液pH

續(xù)表2精粗比C/RMOS水平MOSlevel時間Time/h369122450∶50(A4)0(B1)6．467．157．267．167．150．4%(B2)6．797．167．327．177．120．8%(B3)6．707．207．267．127．181．2%(B4)6．487．157．237．147．211．6%(B5)6．457．217．257．167．252．0%(B6)6．647．177．287．117．16精粗比C/R20∶80(A1)6．74ab7．30a7．36a7．28a7．40a30∶70(A2)6．83a7．21a7．35a7．18b7．33b40∶60(A3)6．66ab7．22a7．36a7．18b7．28b50∶50(A4)6．59b7．19b7．27b7．14b7．18cMOS水平MOSlevel0(B1)6．687．227．317．237．290．4%(B2)6．747．267．327．217．280．8%(B3)6．777．237．317．207．321．2%(B4)6．657．237．317．187．311．6%(B5)6．677．207．337．217．312．0%(B6)6．717．237．307．167．26SEM0．020．010．010．010．01P值P?value精粗比C/R0．002<0．001<0．001<0．0010．036MOS水平MOSlevel0．5640．0550．0630．0920．591精粗比×MOS水平C/R×MOSlevel0．0900．0620．0541．0000．375

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2不同精粗比飼糧中添加MOS對體外培養(yǎng)液NH3-N濃度的影響

從表3可以看出，精粗比、MOS水平及二者交互作用對各時間點培養(yǎng)液中NH3-N濃度均產(chǎn)生了顯著的影響(P<0.05)。培養(yǎng)3 h，A2組培養(yǎng)液中NH3-N濃度顯著高于A1組(P<0.05)；培養(yǎng)6 h，A1組培養(yǎng)液中NH3-N濃度顯著高于其余3組(P<0.05)，A2組顯著高于A3和A4組(P<0.05)，B3組培養(yǎng)液中NH3-N濃度顯著高于B5組(P<0.05)；培養(yǎng)9 h，B2、B3和B5組培養(yǎng)液中NH3-N濃度顯著高于B4組(P<0.05)；培養(yǎng)12 h，A1組培養(yǎng)液中NH3-N濃度顯著高于其余3組(P<0.05)，A3、A4組顯著高于A2組(P<0.05)，B5和B6組顯著高于B3組(P<0.05)；培養(yǎng)24 h，A3組培養(yǎng)液中NH3-N濃度顯著低于其余3組(P<0.05)，B5和B6組顯著高于B2和B4組(P<0.05)，B1組顯著高于B2組(P<0.05)。

2.3不同精粗比飼糧中添加MOS對體外培養(yǎng)液VFA濃度的影響

從表4可以看出，精粗比對培養(yǎng)液中總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度和丁酸含量產(chǎn)生了顯著影響(P<0.05)，MOS水平對培養(yǎng)液中TVFA濃度和各VFA含量未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，精粗比與MOS水平也沒有對培養(yǎng)液中TVFA濃度和各VFA含量產(chǎn)生顯著交互作用(P>0.05)。隨精粗比提高，TVFA濃度和丁酸含量升高。A1組培養(yǎng)液中TVFA濃度顯著低于其余3組(P<0.05)，且丁酸含量顯著低于A4組(P<0.05)。

表3　不同時間點體外培養(yǎng)液中NH3-N濃度

表4　體外培養(yǎng)液中TVFA濃度及各種VFA含量

3　討　論

3.1不同精粗比飼糧中添加MOS對體外培養(yǎng)液pH的影響

瘤胃液pH是反映瘤胃內(nèi)環(huán)境的一個重要生理指標(biāo)，能直觀反映瘤胃發(fā)酵是否正常，pH過高或過低對于正常的瘤胃微生物的生長、增殖及瘤胃發(fā)酵均不利[12]。瘤胃內(nèi)pH維持在一個正常的范圍是保證瘤胃正常發(fā)酵的前提。本試驗中，各組體外培養(yǎng)液pH變動范圍為6.45～7.45，均在瘤胃液pH的正常變化范圍(5.5～7.5)內(nèi)變化[13]。本試驗中，精粗比對各時間點體外培養(yǎng)液中pH都產(chǎn)生了顯著影響，且pH隨精粗比的提高而降低。這是由于精粗比提高時，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的比例也隨之上升，發(fā)酵產(chǎn)物累積，從而產(chǎn)生更多的VFA使pH降低。MOS水平在各時間點對培養(yǎng)液pH沒有產(chǎn)生顯著影響，與肖宇等[14]的結(jié)果，即MOS顯著降低奶山羊瘤胃液pH的結(jié)果不一致。這可能是由于本試驗中MOS的添加水平較低(最高2.0%，0.04 g左右)，致使MOS的作用不明顯；也可能是因為體外培養(yǎng)不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境，沒有瘤胃上皮細(xì)胞對VFA的吸收作用而使pH變化不明顯。

3.2不同精粗比飼糧中添加MOS對體外培養(yǎng)液NH3-N濃度的影響

NH3-N是瘤胃代謝中含氮物降解的產(chǎn)物，也是瘤胃微生物合成菌體蛋白的主要氮源，一定程度上可以反映出瘤胃微生物分解含氮物質(zhì)產(chǎn)生NH3-N及對其攝取利用的情況，是瘤胃內(nèi)環(huán)境的重要指標(biāo)。如果NH3-N濃度過高，則說明瘤胃微生物降解氮源釋放氨的速率超過了微生物利用其合成自身蛋白質(zhì)的速率，這會增加瘤胃氮循環(huán)中氮素的損失，而NH3-N濃度過低會限制纖維素分解菌分解纖維素的效率[15]。NH3-N作為菌體蛋白合成的氮源,其最適濃度各國學(xué)者比較一致的看法是10～50 mg/dL[16]，而要保證動物的最高采食量和消化率，瘤胃內(nèi)NH3-N的濃度應(yīng)不低于20 mg/dL。本試驗中，體外培養(yǎng)液中NH3-N濃度在25.58～131.57 mg/dL之間變動，較反芻動物瘤胃內(nèi)正常NH3-N濃度高，這可能是由于體外培養(yǎng)中發(fā)酵產(chǎn)物與代謝終產(chǎn)物無法移出且沒有反芻動物瘤胃壁可以吸收氨的緣故，導(dǎo)致氨在培養(yǎng)液中積累。整個培養(yǎng)期，培養(yǎng)液中NH3-N濃度隨飼糧精粗比升高而降低，這可能是由于精飼料比例升高時易降解能源物質(zhì)含量升高，促進瘤胃微生物增殖而加速培養(yǎng)液中NH3-N的消耗，促進菌體蛋白的合成[6]。MOS水平也對整個培養(yǎng)期體外培養(yǎng)液中NH3-N濃度產(chǎn)生了顯著的影響，但并未表現(xiàn)出規(guī)律性的變化，僅在培養(yǎng)后期呈現(xiàn)出NH3-N濃度隨MOS添加水平升高而略有升高。這可能是由于MOS對瘤胃微生物的促增殖作用較為緩慢，試驗初期作用不明顯，而在培養(yǎng)后期，隨著MOS作用的逐漸呈現(xiàn)，使培養(yǎng)液中NH3-N濃度隨MOS添加水平升高而略有增加。此外，體外發(fā)酵畢竟不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境，尤其是隨著發(fā)酵時間延長、產(chǎn)物積累及pH降低均對微生物的發(fā)酵產(chǎn)生不利影響，因此，體外培養(yǎng)液中NH3-N濃度并未表現(xiàn)出非常規(guī)律性的變化。

3.3不同精粗比飼糧中添加MOS對體外培養(yǎng)液TVFA濃度和VFA含量的影響

VFA是反芻動物瘤胃中碳水化合物發(fā)酵的主要產(chǎn)物，也是反芻動物最主要的能量來源，用于合成體脂肪、乳脂肪等或者轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)提供能量[17]。由于VFA主要來源于微生物對碳水化合物的發(fā)酵，所以瘤胃發(fā)酵類型及VFA產(chǎn)量主要與飼糧的類型密切相關(guān)[18]。本試驗中，A1組培養(yǎng)液TVFA濃度顯著低于其余3組，是由于精飼料中非纖維性碳水化合物含量更高，能夠快速完全地降解從而使TVFA濃度上升，這也與本試驗中隨精粗比提高pH降低的結(jié)果相對應(yīng)。本試驗中乙酸、丙酸含量及乙酸/丙酸變化不明顯，可能是由于發(fā)酵底物較少，導(dǎo)致僅在VFA發(fā)酵總量上出現(xiàn)差異而不能顯著影響到各種脂肪酸的含量，也有可能是在體外研究條件下，瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生的VFA不能像體內(nèi)一樣，被瘤胃壁和網(wǎng)胃壁等吸收，從而使乙酸和丙酸等單個脂肪酸的含量變化不明顯。肖宇等[14]報道，外源添加功能性寡糖可以增加奶山羊瘤胃中乙酸和TVFA濃度；而Mwenya等[19]報道飼糧中添加異麥芽寡糖對綿羊瘤胃中VFA含量均不產(chǎn)生顯著影響。本試驗中MOS對體外培養(yǎng)液中TVFA濃度、乙酸/丙酸及各種酸的含量沒有產(chǎn)生顯著的影響，可能是因為MOS的添加水平較低(最高0.04 g/kg)導(dǎo)致其作用不明顯，因此對于MOS在反芻動物上的適宜添加水平以及添加方式還需進一步研究。

4　結(jié)　論

① 不同精粗比飼糧中添加MOS對綿羊體外瘤胃發(fā)酵NH3-N濃度有顯著影響，其中MOS的影響較輕微，尚未呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，主體起作用的仍是精粗比。

② 飼糧精粗比的提高增加了綿羊體外瘤胃發(fā)酵VFA濃度，降低了pH和NH3-N濃度。

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(責(zé)任編輯王智航)

Effects of Mannanoligosaccharides Supplementation in Diets with Different Concentrate to Roughage Ratios oninVitroRuminal Fermentation of Sheep

CHEN ZhilongZENG YanxiaWANG LinZHAO ChenZHENG Chen*

(College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The purpose of this study was to investigate the effects of mannanoligosaccharides (MOS) supplementation in diets with different concentrate to roughage ratios oninvitroruminal fermentation of sheep. Six levels (0, 0.4%, 0.8%, 1.2%, 1.6% and 2.0%) of MOS were supplemented in diets with four concentrate to roughage ratios (20∶80, 30∶70, 40∶60 and 50∶50) to formulate 24 kinds of subtract using a 4×6 two factorial experiment design. The subtracts were cultured for 3, 6, 9, 12 and 24 h usinginvitrogas production method, respectively, and pH, ammonia nitrogen (NH3-N) and volatile fatty acid (VFA) concentrations in cultivated fluid were determined. The results showed as follows: the pH, NH3-N concentration, total VFA concentration and butyrate content in cultivated fluid were significantly affected by concentrate to roughage ratio (P<0.05), NH3-N concentration was significantly influenced by MOS level (P<0.05), and NH3-N concentration was also significantly influenced by the interaction between MOS level and concentrate to roughage ratio (P<0.05). With the increase of concentrate to roughage ratio, total VFA concentration and butyrate content in cultivated fluid tended to be increased, while the pH and NH3-N concentration in cultivated fluid tended to be decreased; with the increase of MOS level, NH3-N concentration in cultivated fluid was slightly increased. In conclusion, MOS supplementation in diets with different concentrate to roughage ratios can significantly affect NH3-N concentration ofinvitrofermentation of sheep, the effect of MOS is slightly, and the main influencing factor still is concentrate to roughage ratio; the increase of concentrate to roughage ratio increases VFA concentration, but decreases pH and NH3-N concentration ofinvitrofermentation of sheep.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(10)：3292-3300]

concentrate to roughage ratio; mannamoligosaccharides; sheep; pH; volatile fatty acid; ammonia nitrogen

, associate professor, E-mail: zhengc@gsau.edu.cn

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.10.033

2016-04-08

國家自然科學(xué)基金(31560646)

陳志龍(1992—)，男，甘肅天水人，碩士研究生，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail： judy.happy@outlook.com

鄭琛，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: zhengc@gsau.edu.cn

S826;S816.7

A

1006-267X(2016)10-3292-09