不同糖種類及糖水平對(duì)松浦鏡鯉腸道消化酶活性及腸道和肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

李晉南　王常安　王連生　趙志剛　羅　亮　都　雪　徐奇友

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱150070)

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不同糖種類及糖水平對(duì)松浦鏡鯉腸道消化酶活性及腸道和肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

李晉南王常安王連生趙志剛羅亮都雪徐奇友*

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱150070)

本研究旨在探討不同糖種類及糖水平對(duì)松浦鏡鯉腸道消化酶活性及腸道和肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響。以酪蛋白和魚粉為主要蛋白質(zhì)源，魚油和豆油為脂肪源，葡萄糖和淀粉分別為糖源，配制糖水平分別為25.0%和50.0%的4種等氮等脂的試驗(yàn)飼料。選用初始體重為(8.30±0.15) g的松浦鏡鯉420尾，隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)35尾魚。4組試驗(yàn)魚飼喂2種糖類型和2種糖水平的4種等氮等脂的試驗(yàn)飼料，分別命名為低淀粉(LS)組、高淀粉(HS)組、低葡萄糖(LG)組和高葡萄糖(HG)組。試驗(yàn)期為60 d。結(jié)果表明：HS組的腸道淀粉酶活性顯著高于其他各組(P<0.05)，蛋白酶活性顯著高于HG組和LG組(P<0.05)；HG組和LG組的腸道脂肪酶活性顯著高于LS組(P<0.05)。HG組的前腸皺襞高度顯著低于LG組(P<0.05)，中腸皺襞高度顯著低于LS組(P<0.05)，后腸皺襞高度顯著低于其他各組(P<0.05)。各組前腸、中腸和后腸肌層厚度沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。HG組的前腸和中腸皺襞寬而短，皺襞密度低于LS組和LG組。HS組和HG組的肝細(xì)胞膜破裂，出現(xiàn)空泡現(xiàn)象。綜上，含50%淀粉的飼料可增加松浦鏡鯉腸道消化酶活性，含50%葡萄糖的飼料則會(huì)降低腸道皺襞高度，且飼料糖水平為50%時(shí)對(duì)松浦鏡鯉肝臟組織結(jié)構(gòu)造成了一定程度的負(fù)面影響。

松浦鏡鯉；葡萄糖；淀粉；腸道形態(tài)；肝臟

糖作為一種營(yíng)養(yǎng)素對(duì)魚類生長(zhǎng)具有重要作用[1-4]，其既是魚體熱能的主要來(lái)源，也是構(gòu)成體組織的重要物質(zhì)。飼料糖除提供魚類活動(dòng)所需的熱能外，多余部分可用于合成糖原(肝糖原和肌糖原)，或轉(zhuǎn)化為脂肪存于體內(nèi)。糖類物質(zhì)作為飼料中最廉價(jià)的能源物質(zhì)，在飼料中添加適宜水平的糖不但可以節(jié)約蛋白質(zhì)、降低飼料成本，同時(shí)可以增加ATP的形成，有利于氨基酸的活化，促進(jìn)魚體自身蛋白質(zhì)的合成，更重要的是可以減少氮、磷的排放，減輕水體污染，實(shí)現(xiàn)飼料工業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展[5-6]。但是，魚類攝入高糖飼料后，其生長(zhǎng)性能下降、抗病能力下降，同時(shí)肝糖原含量增高，容易損害魚類肝臟的正常功能，使其代謝功能下降[7-9]。

目前，關(guān)于不同糖種類或糖水平對(duì)不同種類魚生長(zhǎng)性能影響的研究已經(jīng)很多[10-12]，但是對(duì)于高糖水平對(duì)魚類腸道和肝臟組織結(jié)構(gòu)影響的研究報(bào)道不多。蔣利和等[13]研究表明，飼料糖水平分別為40%和45%時(shí)，肝臟組織切片有明顯的細(xì)胞脂滴空泡狀、核偏移和細(xì)胞質(zhì)消失現(xiàn)象。對(duì)異育銀鯽的研究表明，其可以耐受50%的飼料糖水平，但長(zhǎng)期攝食高糖飼料會(huì)引起一定程度的肝臟功能和結(jié)構(gòu)的損傷[1]。松浦鏡鯉是中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所在德國(guó)鏡鯉選育系(F4)的基礎(chǔ)上選育的新品種，具有鱗片少、生長(zhǎng)速度快、含肉率高、肉質(zhì)好等特點(diǎn)，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。松浦鏡鯉作為雜食性魚類，對(duì)糖類物質(zhì)的利用能力較強(qiáng)，Wilson[9]的研究表明鯉魚利用淀粉的能力優(yōu)于葡萄糖，并且能耐受400 g/kg的糖類物質(zhì)。本試驗(yàn)以松浦鏡鯉為研究對(duì)象，選用葡萄糖和淀粉2種糖源，設(shè)定25.0%低糖水平和50.0%高糖水平，在前期研究了不同糖種類及糖水平對(duì)松浦鏡鯉生長(zhǎng)性能及血液學(xué)指標(biāo)影響[14]的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究不同糖種類及糖水平對(duì)松浦鏡鯉腸道消化酶活性及腸道和肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響，為更好地理解魚類糖代謝機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物及飼料

松浦鏡鯉選自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所。以酪蛋白和魚粉為主要蛋白質(zhì)源，魚油和豆油為脂肪源，葡萄糖和淀粉分別為糖源，配制糖水平分別為25.0%和50.0%的4種等氮等脂的試驗(yàn)飼料，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。飼料原料經(jīng)粉碎按配比混合均勻，少量的組分采用逐級(jí)擴(kuò)大法混合，然后用顆粒機(jī)制成粒徑為2 mm的顆粒飼料，置于-20 ℃冰箱中保存待用。

表1　試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

維生素預(yù)混料和礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼料提供Vitamin premix and mineral premix provided the following per kg of diets: VA 8 000 IU，VE 70 mg，VB118 mg，VB235 mg，VB618 mg，泛酸 pantothenic acid 60 mg，煙酸 niacin 200 mg，生物素 biotin 2.5 mg，VB120.6 mg，葉酸 folic acid 6 mg，肌醇 1 000 mg，VC 500 mg，VD32 000 IU，VK 7 mg，Zn 65 mg，F(xiàn)e 75 mg，Cu 3.5 mg，Mn 16 mg，I 0.65 mg，Co 0.1 mg，Se 0.1 mg。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼料管理

試驗(yàn)選擇規(guī)格一致的初始體重為(8.30±0.15) g的健康松浦鏡鯉420尾，預(yù)飼2周后按照投喂試驗(yàn)飼料的不同隨機(jī)分為4組，分別命名為低淀粉(LS)組、高淀粉(HS)組、低葡萄糖(LG)組和高葡萄糖(HG)組。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)35尾魚。試驗(yàn)周期為60 d，每天定時(shí)投喂4次，每次投喂以飽食無(wú)殘餌為準(zhǔn)。試驗(yàn)在室內(nèi)控溫循環(huán)水族箱里進(jìn)行，溫度為(24±1) ℃，24 h不間斷供氧，溶氧濃度大于5 mg/L，每日吸污，每周換去水族箱內(nèi)2/3的水并注入已曝氣的水，每日觀察記錄試驗(yàn)魚的攝食和死亡情況。

1.3腸道消化酶活性的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束后，將試驗(yàn)魚饑餓24 h，每箱隨機(jī)選取3尾魚，置于冰盤上解剖，取腸道組織，去除脂肪和內(nèi)含物，用冰浴的0.86%生理鹽水洗凈腸道中的內(nèi)容物，濾紙吸干水分，稱量腸重。按質(zhì)量體積比1∶9加入生理鹽水，以FJ-200CL高速組織勻漿機(jī)勻漿，4 ℃條件下4 000 r/min離心10 min，取上清液作為腸道組織粗酶液，分裝于1.5 mL離心管中，-20 ℃保存，待測(cè)蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性測(cè)定方法見參考文獻(xiàn)[15]。

1.4腸道和肝臟組織切片制備

試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)取3尾魚，置于冰盤上迅速解剖，分別取肝臟組織和前腸、中腸和后腸腸段，以0.86%的生理鹽水沖洗干凈，固定于Bouin氏液中。固定24 h后，經(jīng)過(guò)乙醇逐級(jí)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度5 μm)、蘇木精-伊紅(HE)染色、脫水、透明、中性樹脂封片。用Leica MD 4000B顯微鏡觀察肝臟和腸道組織切片，并拍照分析。圖像由Motic Images Plus 2.0軟件進(jìn)行分析，每段腸樣測(cè)量15個(gè)以上完整皺襞高度和肌層厚度，取其平均值作為該樣品皺襞高度和肌層厚度的測(cè)定結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素和雙因素方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，顯著性水平為P<0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1不同糖種類及糖水平對(duì)松浦鏡鯉腸道消化酶活性的影響

各試驗(yàn)組腸道消化酶活性的結(jié)果見表2。HS組的腸道蛋白酶活性顯著高于HG組和LG組(P<0.05)，淀粉酶活性顯著高于其他各組(P<0.05)；HG組和LG組的腸道脂肪酶活性顯著高于LS組(P<0.05)。飼料糖種類和糖水平對(duì)松浦鏡鯉腸道消化酶活性不存在交互作用(P>0.05)。

表2　不同糖種類及糖水平對(duì)松浦鏡鯉腸道消化酶活性的影響

CL:糖水平；CT：糖種類。下表同。

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無(wú)字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

CL: carbohydrate level; CT: carbohydrate type. The same as below.

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.2不同糖種類及糖水平對(duì)松浦鏡鯉腸道形態(tài)的影響

由表3可知，前腸、中腸和后腸肌層厚度各組間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，且雙因素方差分析顯示飼料糖種類和糖水平對(duì)各腸段肌層厚度不存在交互作用(P>0.05)。HG組的前腸皺襞高度顯著低于LG組(P<0.05)，中腸皺襞高度顯著低于LS組(P<0.05)，后腸皺襞高度顯著低于其他各組(P<0.05)。飼料糖水平顯著影響前腸和中腸腸道皺襞高度(P<0.05)，糖種類顯著影響后腸皺襞高度(P<0.05)，且飼料糖水平和糖種類對(duì)松浦鏡鯉前腸和后腸的皺襞高度存在交互作用(P<0.05)。

表3　不同糖種類及糖水平對(duì)松浦鏡鯉腸道形態(tài)的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)無(wú)字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

In the same column, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.3腸道組織切片觀察

各組松浦鏡鯉前腸組織切片見圖1。HS組前腸褶皺密度低于LG組，LS組和LG組的皺襞高而細(xì)，排列緊密；HG組的前腸皺襞短小，低于LG組。

各組松浦鏡鯉中腸組織切片見圖2。除HG組外，松浦鏡鯉中腸腸道褶皺高且細(xì)，排列緊密；HG組中腸表現(xiàn)出腸褶皺寬而短，排列較為稀疏。

FH:皺襞高度 fold height；MT:肌層厚度 muscular thickness。

圖1松浦鏡鯉前腸組織切片

Fig.1Tissue slices of foregut ofSongpumirror carp (200×)

各組松浦鏡鯉后腸組織切片見圖3。相較于LS組和LG組，HS組和HG組松浦鏡鯉后腸腸道褶皺略顯短，但都排列緊密，形態(tài)較完整。

2.4肝臟組織切片觀察

各組松浦鏡鯉肝臟組織切片見圖4。與LS組相比，HS組的肝細(xì)胞邊緣模糊，輪廓不清晰，肝細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的網(wǎng)狀支架破壞，一些細(xì)胞核聚集在一起每組3個(gè)試驗(yàn)樣本，其發(fā)生組織病變的概率為60%～70%，致使一些生化相關(guān)指標(biāo)升高。LG組與HG組相比，肝細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞輪廓清晰有序。HG組中有60%左右的試驗(yàn)樣本的切片顯示，肝細(xì)胞邊緣模糊，細(xì)胞排列不整齊。

3　討　論

魚類腸道是機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收的重要場(chǎng)所，其中所含消化酶的活性可以作為衡量魚類對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成分消化、吸收和利用的重要指標(biāo)[16-17]。淀粉酶的分泌量及活性直接決定魚類對(duì)飼料中糖類物質(zhì)的消化能力[18]。有研究表明淀粉酶活性主要由遺傳因素決定[19-20]，一些研究認(rèn)為提高飼料中糖水平能提高淀粉酶活性[21]。李弋等[22]的研究表明飼料中添加淀粉能夠提高大黃魚的腸道淀粉酶活性。本試驗(yàn)的結(jié)果顯示HS組的腸道淀粉酶活性顯著高于葡萄糖組(HG組和LG組)和LS組，同樣，腸道蛋白酶活性在HS組中也是最高的，這種消化酶活性的協(xié)同作用在方斑東風(fēng)螺的糖營(yíng)養(yǎng)代謝研究[23]中也得到同樣結(jié)果，但葡萄糖組的腸道脂肪酶活性要顯著高于LS組。這些結(jié)果說(shuō)明飼料糖種類及糖水平對(duì)松浦鏡鯉腸道消化酶活性有一定的影響，但具體的機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

圖2　松浦鏡鯉中腸組織切片

圖3　松浦鏡鯉后腸組織切片

魚類是較低等的脊椎動(dòng)物，腸道組織雖與陸生動(dòng)物相似，但卻不及陸生動(dòng)物發(fā)達(dá)，因此魚類的腸道皺襞的密度、高度及排列狀態(tài)就能反映出魚類腸道的消化吸收能力[24-25]。腸道的正常發(fā)育對(duì)魚類的消化能力有著重要的影響[26]。目前，關(guān)于糖類物質(zhì)對(duì)魚類腸道形態(tài)的報(bào)道還不多見，本試驗(yàn)的結(jié)果表明飼料中以50.0%的葡萄糖作為糖源的組的前腸、中腸、后腸皺襞高度顯著降低，而高淀粉飼料對(duì)腸道皺襞高度沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響，說(shuō)明高水平的葡萄糖對(duì)腸道皺襞高度產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，從組織切片上也可以看出，HG組的腸道皺襞高度明顯降低，皺襞寬而短，排列稀疏，尤其是前腸和中腸，嚴(yán)重影響了腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，這與本課題組前期試驗(yàn)得出的高葡萄糖飼料降低了松浦鏡鯉的生長(zhǎng)性能，HG組的增重率和特定增長(zhǎng)率最低，而飼料系數(shù)最高，蛋白質(zhì)效率也顯著低于其他各組[14]的結(jié)論相印證。

肝臟是魚類進(jìn)行糖代謝的重要器官，攝食過(guò)高水平糖飼料在組織學(xué)上對(duì)魚類會(huì)產(chǎn)生一定的營(yíng)養(yǎng)脅迫，在魚體肝臟組織學(xué)上有明顯的表現(xiàn)。成成等[27]研究指出，飼料糖水平分別為15%和30%時(shí)，南方鲇幼魚肝細(xì)胞出現(xiàn)較多腫脹和脂滴，部分肝細(xì)胞膜破裂，肝細(xì)胞核多移至細(xì)胞邊位。徐祥泰等[28]研究表明，攝食含10%蠟質(zhì)玉米淀粉、小麥淀粉或木薯淀粉飼糧的大口黑鱸肝細(xì)胞的細(xì)胞核移至細(xì)胞邊位，出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象。研究表明，分別用含51.7%和42.43%糖的飼料喂養(yǎng)南亞野鯪，其肝細(xì)胞均發(fā)生腫脹和空泡化[29-30]。有研究認(rèn)為，細(xì)胞腫脹和空泡化可能是由于糖代謝的負(fù)擔(dān)過(guò)重而引起的應(yīng)激或脅迫狀態(tài)，也可能是糖原積累所導(dǎo)致的[30]。本試驗(yàn)中，HS組和HG組中肝細(xì)胞多數(shù)出現(xiàn)細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞輪廓不清晰，這些現(xiàn)象說(shuō)明高糖飼料可以在一定程度上對(duì)魚體肝臟功能造成損害，從而對(duì)生長(zhǎng)指標(biāo)、體成分和血清生化指標(biāo)造成一定的負(fù)面影響[14,31]。

→:細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞輪廓不清晰 The membranes of hepatocyte were ruptured, and the cell contour was not clear。

圖4松浦鏡鯉肝臟組織切片

Fig.4Tissue slices of liver ofSongpumirror carp (200×)

4　結(jié)　論

含50%淀粉的飼料可增加松浦鏡鯉腸道消化酶活性，含50%葡萄糖的飼料則會(huì)降低腸道皺襞高度，且飼料糖水平為50%時(shí)對(duì)松浦鏡鯉肝臟組織結(jié)構(gòu)造成了一定程度的負(fù)面影響。

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(責(zé)任編輯菅景穎)

Effects of Different Carbohydrate Types and Carbohydrate Levels on Intestinal Digestive Enzyme Activities, Intestinal and Liver Histological Structure ofSongpuMirror Carp (Cyprinuscarpiospecularis)

LI JinnanWANG Chang’anWANG LianshengZHAO ZhigangLUO LiangDU XueXU Qiyou*

(Heilongjiang River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin 150070, China)

This experiment was aimed to study the effects of different carbohydrate types and carbohydrate levels on intestinal digestive enzyme activities, intestinal and liver histological structure ofSongpumirror carp (Cyprinuscarpiospecularis). A total of 420Songpumirror carp with the average body weight of (8.30±0.15) g were randomly divided into 4 groups with 3 replicates and 35 fish per replicate. The fish in 4 groups were fed 4 isonitrogenous and isolipidic experimental diets with two carbohydrate types (starch and glucose) and two carbohydrate levels (25.0% and 50.0%), and the groups were named as low starch (LS) group, high starch (HS) group, low glucose (LG) group and high glucose (HG) group, respectively. The experiment lasted for 60 days. The results showed that the intestinal amylase activity of HS group was significantly higher than that of other groups (P<0.05). The intestinal protease activity of HS group was significantly higher than that of HG and LG groups (P<0.05). The intestinal lipase activity of HG and LG groups was significantly higher than that of LS group (P<0.05). The fold height of foregut of HG group was significantly lower than that of LG group (P<0.05). The fold height of midgut of HG group was significantly lower than that of LS group (P<0.05). The fold height of hindgut of HG group was significantly lower than that of other groups (P<0.05). The muscular thickness of foregut, midgut and hindgut had no significant difference among groups (P>0.05). The folds of foregut and midgut of HG group was wide and short, and the fold density of foregut and midgut was lower than that of LS and LG groups. The membranes of hepatocyte of HS and HG groups were ruptured and demonstrated vacuolation. In conclusion, dietary contained 50% starch can improve intestinal digestive enzyme activities inSongpumirror carp, but dietary contained 50% glucose can decrease the intestine fold height, and 50% dietary carbohydrate level has a negative impact on the histological structure of liver inSongpumirror carp.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(10)：3217-3224]

Songpumirror carp; glucose; starch; intestinal morphology; liver

, professor, E-mail: xuqiyou@sina.com

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.10.025

2016-04-06

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(HSY201306)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-46)

李晉南(1983—)，女，黑龍江哈爾濱人，助理研究員，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料。E-mail： lijinnan123@163.com

徐奇友，研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail： xuqiyou@sina.com

S963

A

1006-267X(2016)10-3217-08