山羊毛囊外根鞘細胞系的建立

崔志峰　于會國*　張　忠　王　慧　曾勇慶

(1.山東科技職業(yè)學院，濰坊261053；2.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安271018)

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山羊毛囊外根鞘細胞系的建立

崔志峰1于會國1*張忠1王慧2曾勇慶2

(1.山東科技職業(yè)學院，濰坊261053；2.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安271018)

本試驗旨在建立純一、穩(wěn)定的山羊毛囊外根鞘細胞系。活體采集濟寧青山羊羔羊背部皮膚，采用機械分離與酶消化相結(jié)合的方法，分離外根鞘細胞，培養(yǎng)于含有表皮生長因子(EGF)、類胰島素生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和氫化可的松的無血清角質(zhì)細胞培養(yǎng)液中，置5% CO2濃度的37 ℃培養(yǎng)箱中啟動原代培養(yǎng)。待原代細胞長成良好的單層后即可進行傳代培養(yǎng)，細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)至第8～10代時，更換含EGF、IGF-Ⅰ、氫化可的松和FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液進行長期培養(yǎng)。選取傳至第40代的外根鞘細胞進行生長特性研究與染色體分析。結(jié)果表明：體外培養(yǎng)的細胞倍增時間為51.9 h，培養(yǎng)細胞的染色體數(shù)仍以2n=60為主，但是出現(xiàn)了非整倍體性染色體特征；免疫細胞化學鑒定結(jié)果表明，該細胞系角蛋白19表達呈陽性。結(jié)果提示，本試驗分離培養(yǎng)的細胞確為由山羊毛囊干細胞分化來的外根鞘細胞，體外培養(yǎng)的山羊毛囊外根鞘細胞系得到了成功建立。

毛囊外根鞘細胞；細胞系；濟寧青山羊；生長特性；染色體數(shù)目

毛囊(hair follicle)是表皮向真皮凹陷后形成的能控制毛發(fā)生長的皮膚附屬器官，具有獨特的結(jié)構(gòu)、合成多種特異角質(zhì)蛋白的功能以及周期性再生的能力。毛囊在形成與分化過程中至少涉及到20余種不同的細胞群，主要由毛乳頭、毛母質(zhì)、內(nèi)根鞘和外根鞘等細胞組成[1-2]。其中，外根鞘細胞(outer root sheath cell,ORSC)作為一種重要的毛囊上皮細胞，因具有高度增生的潛能，在毛發(fā)再生、傷口愈合、初級毛囊和次級毛囊分化等生理過程中均起著重要作用而越來越受到關(guān)注。

自Wetering等[3]利用經(jīng)鈷源照射后的牛晶狀體包膜囊作為支持物，成功誘導(dǎo)人毛囊外根鞘細胞遷移出游離毛囊以來，已有不少學者針對外根鞘細胞體外培養(yǎng)體系與技術(shù)進行過改進。其中，Oshima等[4]將分離的毛囊直接接種到塑料培養(yǎng)皿中，在控制培養(yǎng)液pH不高于7.2的條件下，貼壁毛囊周圍便可游離出外根鞘細胞，但該方法獲得的外根鞘細胞產(chǎn)量低且再生能力差，不便于進行進一步的研究與大量的應(yīng)用。迄今，已有多種細胞分離技術(shù)和細胞培養(yǎng)方法運用于外根鞘細胞的體外培養(yǎng)，其中，較為常用的培養(yǎng)方法有2種：一種是將分離的毛囊經(jīng)胰蛋白酶消化處理后，用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)液制成細胞懸液，然后接種于經(jīng)絲裂霉素處理的3T3細胞滋養(yǎng)層上，37 ℃、5% CO2條件下進行原代培養(yǎng)[5-8]；另一種則是利用膠原包埋法進行外根鞘細胞的培養(yǎng)，分離帶有外根鞘部位的毛囊，37 ℃下進行胰酶消化處理，隨后將毛囊轉(zhuǎn)移至Ⅰ型和Ⅳ型膠原包被的塑料培養(yǎng)皿中，加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，待毛囊牢固貼附于培養(yǎng)皿底壁后，換用無血清的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)[9-10]。以上2種方法雖均能獲得毛囊外根鞘細胞，但仍存在少量非外根鞘細胞，且細胞傳至第8～10代后出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，以致無法繼續(xù)進行傳代培養(yǎng)。

上述外根鞘細胞的培養(yǎng)多以人的毛囊為細胞的組織來源。對于其他哺乳動物外根鞘細胞的培養(yǎng)，主要借鑒人毛發(fā)外根鞘細胞培養(yǎng)方法。研究表明，將分離得到的小鼠觸須毛囊接種于含有表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)及10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中，且細胞培養(yǎng)板預(yù)先用經(jīng)絲裂霉素C處理的表皮細胞滋養(yǎng)層覆蓋，可成功分離得到純一的外根鞘細胞并穩(wěn)定生長至第8～10代[11]。亦有學者在上述分離培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上加以改進，成功分離培養(yǎng)了大鼠、牛、羊駝、豬、兔等動物的毛外根鞘細胞及其他毛囊細胞[12-13]。盡管許多學者在動物毛囊細胞培養(yǎng)方面進行了大量的研究，但有關(guān)山羊毛囊細胞體外培養(yǎng)研究，尤其是外根鞘細胞系建立等方面的報道相對較少，可應(yīng)用于動物毛囊研究方面的細胞株與細胞系亦不多。本試驗在借鑒國內(nèi)外其他學者分離、純化與接種方法的基礎(chǔ)上，擬對蛋白酶處理皮膚組織和次級毛囊分離方法進行改進，提高外根鞘細胞獲得率；傳代培養(yǎng)達第40代時，進行外根鞘細胞生長特性研究與染色體分析，以建立動物毛囊研究方面的細胞株與細胞系。

因此，建立體外培養(yǎng)的毛囊外根鞘細胞系，完善外根鞘細胞分離培養(yǎng)方法，可為進一步研究動物皮膚毛囊的生長發(fā)育規(guī)律及其影響因素奠定基礎(chǔ)。同時也可為進一步研究毛囊細胞的生長、發(fā)育、分化的研究建立離體的細胞模型。對山羊毛囊外根鞘細胞進行研究，探討毛囊生長調(diào)節(jié)機制以及羊的絨毛生長退化機理，最終將為提高品種毛、絨、皮產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量等開拓新的途徑。另外，以山羊毛囊外根鞘細胞系為模型，研究外根鞘細胞與毛乳頭、內(nèi)根鞘、皮膚成纖維等細胞的相互作用，還可為醫(yī)學領(lǐng)域的毛囊再生、脫發(fā)禿頂?shù)忍峁┲匾獏⒖肌?/p>

1　材料與方法

1.1主要試劑與藥品

DMEM/F12培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品；無血清角質(zhì)細胞培養(yǎng)液(keratinocyte-serum free medium,K-SFM)為Gibco公司產(chǎn)品；FBS為MDgenics公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為Sigma公司產(chǎn)品；EGF為Sigma公司產(chǎn)品；胰島素樣生長因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)和氫化可的松(hydrocortisone)為Peprotech公司產(chǎn)品；青霉素鈉(benzylpenicillin sodium)為山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；硫酸鏈霉素(streptomycin sulfate)為山東瑞陽藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；秋水仙堿(colchicine)為Sigma公司產(chǎn)品；Giemsa染液(Giemsa stain)為Fluka公司產(chǎn)品；細胞角蛋白19(cytokeratin-19,CK-19)抗體為Acris公司產(chǎn)品；即用型Biotin SP-HRP免疫組化試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒為北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

完全培養(yǎng)液：含10 ng/mL EGF、10 ng/mL IGF-Ⅰ、0.4 μg/mL氫化可的松和10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液。

工作培養(yǎng)液：含10 ng/mL IGF-Ⅰ、10 ng/mL EGF、0.4 μg/mL氫化可的松的無血清角質(zhì)細胞培養(yǎng)液。

維持培養(yǎng)液：含10 ng/mL IGF-Ⅰ、10 ng/mL EGF、0.4 μg/mL氫化可的松和2% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液。

D-Hank’s液：由8 g/L NaCl、0.4 g/L KCl、0.06 g/L Na2HPO4·H2O、0.06 g/L KH2PO4、0.35 g/L NaHCO3和0.4 g/L苯酚紅組成。

磷酸鹽緩沖液(PBS)：由8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.56 g/L Na2HPO4·H2O和0.2 g/L KH2PO4組成。

凍存培養(yǎng)液：含10%二甲基亞砜(DMSO)和30% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液。

Carnoy’s固定液：3倍體積的甲醇加1倍體積的冰醋酸，現(xiàn)配現(xiàn)用并于冰上保存。

1.2試驗動物與樣品采集

懷孕母羊購自山東省濟寧市嘉祥縣種羊場，飼養(yǎng)于山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院畜牧科技試驗站羊場。運用外科手術(shù)的方法，隨機活體采集出生1～3日齡的羔羊背部面積約0.5 cm×0.5 cm的皮膚組織塊，將皮膚組織塊放入碘酒和酒精約30 s進行消毒，再用生理鹽水洗凈酒精，迅速將皮膚組織塊放入無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，于冰盒中帶回實驗室。在12 h內(nèi)進行分離培養(yǎng)。

1.3外根鞘細胞原代培養(yǎng)用細胞培養(yǎng)板的處理

將預(yù)先培養(yǎng)的山羊皮膚成纖維細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入3 mL含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2濃度的飽和濕度條件下進行培養(yǎng)。經(jīng)3～5 d細胞生長至匯合時，除去培養(yǎng)液。加入約3 mL的無菌1% Triton X-100于單層細胞上，37 ℃孵育30 min后，去除Triton X-100溶液，用無菌超純水沖洗干凈，置于4 ℃下備用。

1.4山羊毛囊外根鞘細胞的原代培養(yǎng)

將活體采集的皮膚組織塊帶回實驗室，經(jīng)70%酒精浸泡消毒，D-Hank’s液洗凈酒精后，隨即置于體式顯微鏡下，用彎頭眼科剪和解剖針在培養(yǎng)皿中盡量刮去殘余裸露毛干及皮下脂肪，無菌生理鹽水沖洗去表面污物，碘酒擦拭及75%乙醇脫碘，用含有青霉素(400 U/mL)、鏈霉素(400 μg/mL)和泰樂菌素(Tylosin)(250 μg/mL)的D-Hank’s液再清洗皮膚組織塊，直至上清液清亮。浸入新的D-Hank’s液中帶入無菌間進行下一步的操作。

進入無菌間后，吸去D-Hank’s液，將前期進行處理的皮膚組織塊，浸入約10 mL 0.25%中性蛋白酶，4 ℃消化過夜。然后放入新的D-Hank’s液中，手術(shù)刀在真皮與皮下組織之間切開，再用無菌彎頭鑷揭去表皮層后，在體式顯微鏡下用滅菌鑷子夾住次級毛囊遠端，順毛囊方向拔出毛囊，置于0.25%胰蛋白酶中消化5 min，隨后將游離毛囊均勻貼附于預(yù)先鋪有山羊皮膚成纖維細胞的胞外基質(zhì)的6孔培養(yǎng)板中，按照每孔3 mL加入完全培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2濃度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待毛囊周圍遷移出大量細胞后，更換為相同體積的工作培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2濃度下啟動原代培養(yǎng)。待游離出的毛囊外根鞘細胞生長成單層后，消化移入培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，2～3 d更換1次工作培養(yǎng)液。

1.5細胞的傳代培養(yǎng)

當毛囊外根鞘細胞生長至會合狀態(tài)后，進行傳代。首先棄掉舊培養(yǎng)液，D-Hank’s液沖洗細胞1次，加入約1 mL濃度為0.25%的胰蛋白酶浸潤細胞數(shù)秒。棄去液體后，再加入4 mL濃度為0.25%的胰蛋白酶，常溫下消化處理約5 min。當觀察到有細胞貼附的瓶壁逐漸變白，且輕輕晃動有微小細胞團塊脫落時，便可加入6 mL完全培養(yǎng)液終止消化，吹打并懸浮細胞，計數(shù)，稀釋細胞密度至10個/mL，取5 mL懸液加入25 cm2(最大培養(yǎng)面積)培養(yǎng)瓶中，按每瓶10 mL量加入工作培養(yǎng)液放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，此后每3 d更換工作培養(yǎng)液1次。待外根鞘細胞穩(wěn)定生長至第8～10代時，更換等量的維持培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，以利于外根鞘細胞在體外長期傳代。挑選可穩(wěn)定遺傳的對數(shù)生長期毛囊外根鞘細胞進行形態(tài)學觀察并測定生長曲線。

1.6山羊毛囊外根鞘細胞的Giemsa染色

將滅菌蓋玻片放入一次性細胞培養(yǎng)皿中，取2 mL第5代毛囊外根鞘細胞懸液加入培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待外根鞘細胞在蓋玻片上長成良好單層后，取出玻片并浸入無水甲醇中固定15 min，再用新的無水甲醇沖洗細胞，隨即放入純的Giemsa染液中染色5～10 min。從Giemsa染液中取出玻片經(jīng)過干燥和二甲苯透明。最后，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察、拍照。

1.7細胞生長曲線的測定

收獲第5代處于對數(shù)生長期外根鞘細胞，采用細胞傳代的方法制成細胞懸液。經(jīng)計數(shù)后，將密度為1.02×104個/mL的細胞懸液接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1 mL。每隔24 h取出3個孔的細胞分別進行計數(shù)，取平均值。以培養(yǎng)時間為橫軸，每天的細胞數(shù)平均值為縱軸，繪制體外培養(yǎng)毛囊外根鞘細胞的生長曲線。

1.8山羊毛囊外根鞘細胞的染色體核型分析

待傳代培養(yǎng)第40代的外根鞘細胞生長至對數(shù)生長期時，將細胞移入25 mL培養(yǎng)瓶中，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)54 h。將0.5 μg/mL秋水仙素加入維持培養(yǎng)液中，37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)約8 h，大部分細胞處于分裂中期。胰蛋白酶消化分離細胞，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，1 000 r/min，4 ℃離心10 min收集細胞。吸去上清液逐滴加入0.5 mL預(yù)溫37 ℃的低滲液(即0.075 mol/L的KCl溶液)并混勻，隨即補加低滲液至10 mL，用吸管輕輕吹打均勻，37 ℃孵育30 min。低滲處理后向管中加入1 mL新鮮Carnoy’s固定液進行預(yù)固定，離心去上清后加入10 mL新鮮Carnoy’s液進行固定，重復(fù)離心加液進行再固定。將清潔載玻片進行4 ℃預(yù)冷處理，取出后將其傾斜45°放置，在上方約1 m高度用吸管迅速滴加2～3滴固定后的細胞懸液，室溫干燥。最后，進行Giemsa染色，中性樹脂封片，先用低倍鏡尋找良好分裂相，再用高倍鏡觀察。

1.9毛囊外根鞘細胞的免疫細胞化學鑒定

取1.5 mL第5代外根鞘細胞懸液均勻接種于清潔無菌的蓋玻片上，置于37 ℃、5% CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待外根鞘細胞長至蓋玻片80%以上面積時，取出蓋玻片經(jīng)PBS清洗后，用-20 ℃預(yù)冷的醋酸乙醇固定液固定20 min，PBS清洗3次(每次3 min)。按照即用型Biotin SP-HRP免疫組化試劑盒說明步驟進行細胞角蛋白19(CK-19)免疫細胞化學檢測。最后用DAB于暗處顯色3～10 min，蒸餾水清洗后，觀察，照相。

1.10毛囊外根鞘細胞的冷凍保存與復(fù)蘇

選擇第5代對數(shù)生長期細胞，利用傳代培養(yǎng)的方法制成細胞懸液，1 000 r/min，離心10 min，取上清后加入凍存培養(yǎng)液(含10% DMSO和30% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液)，調(diào)整細胞密度為5×106個/mL，分裝入5 mL無菌凍存管中，封口，標記。將凍存管依次置于4 ℃ 1 h、-20 ℃ 1 h、-70 ℃ 12 h，最后移入液氮中長期保存細胞。

復(fù)蘇細胞時，用40 ℃溫水快速解凍細胞，然后轉(zhuǎn)入15 mL離心管，逐滴加入10 mL維持培養(yǎng)液緩慢稀釋凍存液，無菌吸管輕輕吹打混勻后，1 000 r/min離心10 min，棄上清。再用維持培養(yǎng)液適當稀釋后，按5×105個/mL的細胞密度接種于培養(yǎng)瓶。

1.11細胞活率與貼壁率的測定

運用臺盼藍染料排斥法，計數(shù)1 000個細胞，測定細胞凍存前和復(fù)蘇后的活率，并觀察細胞復(fù)蘇后的貼壁情況，統(tǒng)計分析細胞活率與貼壁率。

1.12毛囊外根鞘細胞的形態(tài)回復(fù)試驗

收獲傳至第40代的生長良好的單層外根鞘細胞，在37 ℃、5% CO2濃度的條件下，用10 mL維持培養(yǎng)液和10 mL工作培養(yǎng)液進行傳代培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液，觀察外根鞘細胞的生長情況和形態(tài)變化。

2　結(jié)果與分析

2.1原代培養(yǎng)的毛囊外根鞘細胞的形態(tài)學觀察

利用貼壁法分離毛囊外根鞘細胞，在含完全培養(yǎng)液中，4～5 d便可見毛囊外根鞘邊緣向外游離生長出單個細胞，細胞呈圓形，隨后伸展成多角形的形態(tài)(圖1-a)。培養(yǎng)7 d即可明顯看到大量細胞從外根鞘邊緣生長出來(圖1-b)。隨著游離生長細胞的增多，生長速率逐漸加快，在15 d時，細胞進入對數(shù)生長期。在倒置相差顯微鏡下觀察，可見游離出的毛囊外根鞘細胞以短梭形和多角形為主，細胞飽滿，透明度高，胞體向外伸出2～4個片足，胞核卵圓形，胞質(zhì)較少(圖1-c)。隨后細胞向四周呈克隆狀生長，形成致密單層后細胞變化為短梭狀平行排列(圖1-d)。

圖1　體外培養(yǎng)的青山羊原代毛囊外根鞘細胞

2.2毛囊外根鞘細胞Giemsa染色的觀察

體外培養(yǎng)的毛囊外根鞘細胞經(jīng)Giemsa染色后，可見細胞質(zhì)呈淡藍色，胞體近中央處有橢圓形的細胞核，呈深藍色，其中可見1～2個核仁(圖2-a)。觀察處于對數(shù)生長期的外根鞘細胞，視野中可見較多量的有絲分裂相細胞，采用該染色法可較清晰地顯示出細胞分裂的不同時相(圖2-b)。當培養(yǎng)瓶內(nèi)的細胞形成良好單層(即達到匯合狀態(tài))后，經(jīng)染色可見只有極少量細胞處于分裂周期(M期)，大部分細胞出現(xiàn)接觸抑制(圖2-c)。其中，個別細胞出現(xiàn)胞核分裂，胞質(zhì)未分裂的現(xiàn)象，形成合胞體狀(第40代，圖2-d)。

圖2　體外培養(yǎng)的青山羊毛囊外根鞘細胞Giemsa染色

2.3傳代培養(yǎng)的毛囊外根鞘細胞的生長特性

傳代培養(yǎng)的外根鞘細胞與其原代細胞在形態(tài)及生長速度上均無明顯差異，細胞生長與分裂依然十分旺盛。單層細胞傳代約7 d后便可重新長成單層，其對于胰蛋白酶消化的敏感性也較原代培養(yǎng)細胞明顯增強。從體外培養(yǎng)的外根鞘細胞的生長曲線(圖3)可以看出，細胞貼壁生長的前2 d為遲緩期；3～5 d為對數(shù)生長期；5 d后便進入平穩(wěn)期和衰退期。細胞群體倍增時間為51.9 h，說明外根鞘細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后其生長與分裂能力依然旺盛。

圖3　青山羊毛囊外根鞘細胞生長曲線

2.4毛囊外根鞘細胞的染色體分析

選取傳至第40代的細胞，進行染色體標本計數(shù)。結(jié)果表明，濟寧青山羊染色體為2n=60的細胞占主體，但是個別細胞的染色體發(fā)生缺失與丟失，出現(xiàn)了典型的非整倍體性細胞系染色體特征，說明體外培養(yǎng)環(huán)境對細胞的遺傳穩(wěn)定性有影響作用；然而，在選取進行計數(shù)培養(yǎng)細胞中，擁有60條染色體的細胞數(shù)仍可占總細胞數(shù)的58.3%，且這些細胞的核型均正常(圖4)。因此，所建立的細胞系確為青山羊細胞系。

2.5毛囊外根鞘細胞免疫細胞化學鑒定

應(yīng)用免疫細胞化學染色技術(shù)檢測體外培養(yǎng)的低傳代次數(shù)(第5代)的外根鞘細胞的骨架蛋白-細胞角蛋白19表達情況。顯微鏡觀察結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的細胞質(zhì)呈黃褐色，表明外根鞘細胞角蛋白19表達呈陽性(圖5)，而角蛋白19為毛外根鞘細胞和皮膚干細胞的標記，因此證實本試驗分離培養(yǎng)的細胞確為由毛囊干細胞分化來的外根鞘細胞。

2.6毛囊外根鞘細胞的活率與貼壁率

利用血球計數(shù)板測定細胞凍存前24 h的平均活率及細胞復(fù)蘇后24 h的平均活率與貼壁率，統(tǒng)計分析結(jié)果表明，青山羊毛囊外根鞘細胞東存前和復(fù)蘇后平均活率分別為94.4%和92.1%，復(fù)蘇24 h后約有85%細胞貼附瓶底生長。由此可見，凍存和復(fù)蘇對傳代細胞活力狀況的損害較小，細胞生長狀態(tài)良好(圖6)。

2.7毛囊外根鞘細胞的形態(tài)回復(fù)

將傳代培養(yǎng)至第40代的外根鞘細胞，在工作培養(yǎng)液進行持續(xù)培養(yǎng)。7 d后可觀察到，在工作培養(yǎng)液中的外根鞘細胞，其形態(tài)由原來的以成纖維樣細胞形態(tài)為主，逐漸轉(zhuǎn)變成以內(nèi)皮樣細胞形態(tài)為主(圖7-a)；而外根鞘細胞在含維持培養(yǎng)液中持續(xù)培養(yǎng)，其形態(tài)仍以成纖維樣細胞形態(tài)為主(圖7-b)。

3　討　論

動物毛囊是由多種細胞組成的皮膚附屬器官，對毛囊內(nèi)各種細胞的體外培養(yǎng)是揭示毛囊發(fā)育機制的基礎(chǔ)。毛囊外根鞘細胞在組織發(fā)生、生物學特性等方面與毛囊干細胞密切相關(guān)，獲得可在體外長期培養(yǎng)的毛囊外根鞘細胞系，可為研究外根鞘細胞與毛乳頭細胞等相關(guān)細胞的相互作用，最終在體外成功誘導(dǎo)毛發(fā)再生奠定基礎(chǔ)。

a：第40代外根鞘細胞染色體數(shù)；b：第40代外根鞘細胞分裂中期染色體。

a: chromosome count of passage 40 outer root sheath cells; b: passage 40 outer root sheath cells at metaphase of cell division.

圖4第40代青山羊毛囊外根鞘細胞的染色體分析

Fig.4Chromosome analysis of passage 40 outer root sheath cells of grey goats

圖5　青山羊毛囊外根鞘細胞免疫細胞化學染色

a：凍存前的毛囊外根鞘細胞；b:復(fù)蘇后24 h的毛囊外根鞘細胞。

a: outer root sheath cells before cryopreservation; b: outer root sheath cells after 24 h of recovery.

圖6凍存前與復(fù)蘇后的青山羊毛囊外根鞘細胞

Fig.6Outer root sheath cells of grey goats before cryopreservation and after recovery (100×)

a:培養(yǎng)于工作培養(yǎng)液中的外根鞘細胞；b:培養(yǎng)于維持培養(yǎng)液中的外根鞘細胞。

a: outer root sheath cells cultured in working culture medium; b: outer root sheath cells cultured in feeding medium.

圖7第40代青山羊毛囊外根鞘細胞的形態(tài)回復(fù)

Fig.7Morphology recovery of passage 40 outer root sheath cells of grey goats (100×)

3.1皮膚成纖維細胞的胞外基質(zhì)對外根鞘細胞貼壁的促進作用

以往對于毛囊外根鞘細胞的培養(yǎng)，常用的方法是將細胞接種于輻射或絲裂霉素處理過的滋養(yǎng)層細胞上，培養(yǎng)液含血清和一些添加劑。這種培養(yǎng)方法不但準備步驟多，而且操作過程中易出現(xiàn)污染[14]。

本試驗將游離毛囊接種于預(yù)先鋪有山羊皮膚成纖維細胞的胞外基質(zhì)的培養(yǎng)瓶中，在毛囊外根鞘細胞游離出來后，可見細胞生長迅速，經(jīng)10～15 d便可形成一層膜相結(jié)構(gòu)。分析其中的原因，可能是由于皮膚成纖維細胞對毛囊外根鞘細胞的貼壁生長有促進作用，而且，體內(nèi)狀態(tài)下的成熟毛囊，外根鞘細胞和皮膚成纖維細胞緊密相連，關(guān)系極為密切。

本試驗所建立的這種方法，不僅可以在短時間內(nèi)獲得大量單層外根鞘細胞，而且操作步驟較建立滋養(yǎng)層細胞法更簡便易行，并且，有效地避免了操作過程中的微生物污染與雜細胞的混入。此外，利用青山羊皮膚成纖維細胞的胞外基質(zhì)做培養(yǎng)瓶表面覆蓋物，能夠為原代培養(yǎng)的細胞提供更為接近體內(nèi)的細胞外環(huán)境，有利于刺激毛囊外根鞘細胞重新恢復(fù)分裂能力，這也是能夠成功進行細胞傳代培養(yǎng)的重要條件之一。

3.2酶消化法與機械分離法相結(jié)合

1982年，Wells[15]采用機械分離方法獲得游離毛囊，然后將其直接培養(yǎng)于塑料培養(yǎng)皿中。該方法雖然可獲得毛囊外根鞘細胞，但是游離毛囊需經(jīng)15～20 d才有細胞外遷，且外根鞘細胞的產(chǎn)量較低，再生能力較差，無法進行傳代培養(yǎng)。1994年，Kurata等[16]將分離出的毛囊經(jīng)胰蛋白酶消化處理后，獲得外根鞘細胞懸液進行培養(yǎng)，但該方法不僅前期準備煩瑣費時，且易出現(xiàn)細胞污染。此后，國內(nèi)外學者對毛囊外根鞘細胞的分離培養(yǎng)相繼展開了研究，采用機械分離毛囊貼壁方法培養(yǎng)，雖然容易成功，但費時費力，且細胞增殖緩慢；而采用單純酶解方法進行培養(yǎng)，也能獲得成功，但是，存在其他細胞污染與微生物污染的可能性[17-18]。本試驗將在2種培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上進行改進和結(jié)合既具有操作簡便、獲得細胞量大、細胞貼壁好等優(yōu)點，又可有效地避免細胞增殖緩慢、不易傳代、細胞與微生物污染等方面的不足。

3.3生長因子對毛囊外根鞘細胞的調(diào)節(jié)作用

本試驗在培養(yǎng)液中添加了10 ng/mL IGF-Ⅰ、10 ng/mL EGF和0.4 μg/mL氫化可的松，這些生長因子是能夠順利啟動外根鞘細胞原代培養(yǎng)以及成功進行傳代培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。

大量研究表明，向培養(yǎng)液中添加適宜濃度的生長因子，對毛囊外根鞘細胞的貼壁與增殖具有明顯的促進作用[19-20]，許多學者在哺乳動物毛囊外根鞘細胞的體外培養(yǎng)中使用了IGF-Ⅰ和EGF，發(fā)現(xiàn)它們能夠促進毛囊外根鞘細胞的生長[21-22]。IGF-Ⅰ具有胰島素樣代謝作用，能夠刺激毛囊外根鞘細胞、毛乳頭細胞以及黑色素細胞的增殖與分化。運用免疫組化方法證實，在毛囊生長周期的不同階段均有IGF-Ⅰ存在于動物毛囊外根鞘細胞和毛囊其他細胞中，表明IGF-Ⅰ對毛囊細胞的分化和生長有著廣泛且必需的作用。EGF是一種調(diào)節(jié)細胞周期的外源性生長因子，能調(diào)節(jié)細胞周期進程，對多種細胞增殖有刺激作用。國內(nèi)外研究者運用免疫組織化學和放射自顯影技術(shù)發(fā)現(xiàn)，離體或在體狀態(tài)下毛囊外根鞘部位均有EGF和EGF受體的存在。提示，EGF與毛囊外根鞘細胞上的EGF受體結(jié)合，可促進細胞內(nèi)DNA、RNA和羥脯氨酸的合成，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成，引起外根鞘細胞的生長、合成與分泌活動的變化[23]。近年來，一些學者就糖皮質(zhì)激素(氫化可的松)對毛囊外根鞘細胞和毛乳頭細胞體外培養(yǎng)的影響作了深入的研究。發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的外根鞘細胞和毛乳頭細胞均有氫化可的松及其受體的表達，并且向培養(yǎng)體系中添加氫化可的松對細胞有較強的有絲分裂作用[24]。

本試驗在前人研究和對比試驗的基礎(chǔ)上，向培養(yǎng)液中添加了10 ng/mL IGF-Ⅰ、10 ng/mL EGF和0.4 μg/mL氫化可的松，這些生長因子順利協(xié)助啟動了外根鞘細胞的原代培養(yǎng)以及傳代培養(yǎng)。

3.4非毛囊外根鞘細胞的生長抑制與去除

非毛囊外根鞘細胞的生長抑制與去除是保證外根鞘細胞體外培養(yǎng)的原代啟動及成功傳代的關(guān)鍵因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，細胞培養(yǎng)液中的血清成分含有多種黏附因子，可促進細胞的分化與形態(tài)變化，且有利于成纖維細胞的增殖，從而抑制了上皮樣細胞的生長[25-26]。Jahoda等[27]采用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)原代表皮干細胞與毛外根鞘細胞，接種96 h后觀察發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞的增殖得到明顯抑制，而表皮干細胞與毛外根鞘細胞的增殖時間縮短、增殖細胞數(shù)量增加。近年來無血清角質(zhì)細胞培養(yǎng)液越來越多的應(yīng)用于毛囊干細胞與毛外根鞘細胞的純化培養(yǎng)，無血清角質(zhì)細胞培養(yǎng)液富含銅、硒、鋅等微量元素和豐富的必需氨基酸，可以作為外根鞘細胞培養(yǎng)與純化的最好選擇。除培養(yǎng)液與血清能夠影響毛外根鞘細胞純度外，游離毛囊的分離與接種方法亦可影響毛外根鞘與其他細胞的比例。Limat等[28]首先在顯微鏡下直接從新鮮采集皮膚中拔出毛囊，隨后制成游離毛囊混懸液接種于培養(yǎng)基質(zhì)上進行培養(yǎng)，該方法雖然個別游離毛囊能夠貼壁并向周圍生長出細胞，然而多數(shù)分離毛囊因未貼壁或貼壁不牢而無法向外游離生長細胞。且該方法因前期未對皮膚組織樣品進行消化處理，所獲毛囊其外根鞘部分受損傷嚴重，分離出的細胞中皮脂腺細胞及成纖維細胞居多，不利于進一步的外根鞘細胞純化培養(yǎng)。Hoeller等[29]將分離毛囊經(jīng)胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)溶液處理后，加入到培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，獲得了較多量的外根鞘細胞，然而該方法在分離毛囊時亦有部分外根鞘遺留在組織內(nèi)，且易混雜生長較多成纖維細胞，影響后期的細胞純化。

本試驗在借鑒國內(nèi)外其他學者分離與接種方法的基礎(chǔ)上，首先，利用4 ℃ 0.25%中性蛋白酶對皮膚組織進行預(yù)處理，保證所分離得到的游離次級毛囊外根鞘部分的完整性；其次，將分離的次級毛囊采用先貼附培養(yǎng)基質(zhì)再進行0.25%胰蛋白酶消化處理以及加入少量含高濃度血清(10% FBS)培養(yǎng)液促貼壁等試驗手段，提高了游離毛囊的貼壁率及獲得細胞中外根鞘細胞所占比例，利于進一步獲取純一的外根鞘細胞。

4　結(jié)　論

本試驗利用皮膚成纖維細胞外基質(zhì)誘導(dǎo)和機械分離與酶消化結(jié)合方法成功啟動了外根鞘細胞的原代培養(yǎng)，添加多種生長因子成功建立了山羊毛囊外根鞘細胞系。該細胞系已穩(wěn)定傳至第40代，生長分裂狀態(tài)良好，細胞群體倍增時間約為51.9 h。經(jīng)細胞染色體分析與形態(tài)回復(fù)的試驗鑒定結(jié)果表明，所建毛囊外根鞘細胞系特征明顯，可為研究毛囊生長與分化機制，尤其是毛囊主要細胞間的相互作用機制提供良好模型。

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Author, CUI Zhifeng, lecturer, E-mail: cuizfeng@sdau.edu.cn

*Contributed equally

(責任編輯王智航)

Establishment of Outer Root Sheath Cell Line of Goats

CUI Zhifeng1YU Huiguo1*ZHANG Zhong1WANG Hui2ZENG Yongqing2

(1. Shandong Vocational College of Science and Technology, Weifang 261053, China; 2. College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China)

This study was conducted to establish a pure and genetically stable outer root sheath cell (ORSC) line of goats. Dorsal skin of lambs ofJininggrey goats was collected under living condition. The method of mechanical separation conjugation with enzyme digestive was conducted to obtain ORSCs. ORSCs were cultured in keratinocyte-serum free medium with epithelial growth factor (EGF), insulin-like growth factor-Ⅰ (IGF-Ⅰ), and hydrocortisone for primary culture under the conditions of 5% carbon dioxide and 37 ℃. After primary cells spread the culture flask, the subculture was started. The cells at passages 8 to 10 were then cultured in DMEM/F12 with EGF, IGF-Ⅰ, hydrocortisone and FBS for long-term culture. Growth characteristic and karyotype analysis were carried out using passage 40 cells. The results showed that theinvitrocultured cell population cost 51.9 h to perform doubling, the most of chromosome type was 2n=60 type, but appeared the uncompleted chromosome; the immunocytochemecal results showed that cytokeratin-19 was positively expressed in the cell line. In conclusion， the cells separated and cultured in the present study were ORSCs that differentiated from stem cells of hair follicle of goats, and a ORSC line of goatsinvitroculture was successfully established.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(10)：3207-3216]

outer root sheath cell; cell line;Jininggrey goat; growth characteristic; chromosome count

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.10.024

2016-04-02

山東省優(yōu)秀中青年科學家科研獎勵基金“山羊毛囊發(fā)育和毛發(fā)再生機制與毛囊體外重塑研究”(2014BSB09001)；山東省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新體系蝦蟹類創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-15-011-02)

崔志峰(1983—)，男，遼寧本溪人，講師，博士研究生，主要從事動物健康養(yǎng)殖研究。E-mail： cuizfeng@sdau.edu.cn

S826

A

1006-267X(2016)10-3207-10

*同等貢獻作者