油松針葉揮發(fā)油成分與含量動態(tài)變化分析*

段輝，樊世勇,汪文琦，劉鎮(zhèn)林，蔡興

(1.甘肅省分析測試中心，甘肅　蘭州 730000；2.甘肅省科技廳培訓中心，甘肅　蘭州 730030)

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油松針葉揮發(fā)油成分與含量動態(tài)變化分析*

段輝1，樊世勇1,汪文琦1，劉鎮(zhèn)林1，蔡興2

(1.甘肅省分析測試中心，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省科技廳培訓中心，甘肅蘭州 730030)

采用了GC/MS聯(lián)用分析技術(shù)研究油松針葉揮發(fā)油含量及組分，考察不同季節(jié)、不同林齡、不同郁閉度等6因素對油松針葉組分及含量的影響，結(jié)果顯示：松針揮發(fā)油主要成分為左旋乙酸龍腦酯、石竹烯及其氧化物、à-依蘭油烯、匙葉桉油烯醇、蓽茄醇、à-杜松醇、桑伯格醇等。樹齡、季節(jié)、冠層、郁閉度、枝位等因素對揮發(fā)油含量有影響。本文綜合分析揮發(fā)油化學成分及含量的動態(tài)變化，為松針工業(yè)開發(fā)應(yīng)用提供科學依據(jù)。

油松；揮發(fā)油；GC/MS；季節(jié)；樹齡；郁閉度；冠層

松屬(PinusLinn.)植物為全球森林樹種和用材樹種，本屬有90多種，為常綠喬木，其中，油松(PinustabulaeformisCarr.)耐寒、耐貧瘠能力高,優(yōu)于本屬其他樹種，成為甘肅省的主要造林樹種，其分布于隴南、隴東、天水等地，在每年的修林期及新陳代謝會產(chǎn)生大量廢棄松針，是廉價的再生資源。松針開發(fā)國內(nèi)外有報道，可形成松針精油、松針軟膏、松針粉、抗癌扶正沖劑、松針飲料等產(chǎn)品[1～2]，松針是植物進行光合作用、合成有機營養(yǎng)物質(zhì)的器官，產(chǎn)生包括免疫調(diào)節(jié)等生物活性的次生代謝物，其中揮發(fā)油含量約占2%左右。中國有56科136屬植物含有揮發(fā)油，松科(Pinaceae Lindl.)柏科(Cupressaceae L.)位居首位，揮發(fā)油具有止咳、平喘、抗腫瘤等多方面的生物活性和功效藥所含有的一類重要成分，尤其是揮發(fā)油中萜烯類化合物，在抑菌、抗真菌、抗腫瘤等方面發(fā)揮作用[3～7]。目前，松針揮發(fā)油的功效依賴于動物實驗數(shù)據(jù)，有關(guān)松針揮發(fā)油成分及含量動態(tài)變化研究，尚沒有相關(guān)報道。本文主要研究油松松針揮發(fā)油含量隨樹齡、季節(jié)等因素的動態(tài)變化規(guī)律，探討不同季節(jié)針葉揮發(fā)油化學成分及含量變化差異，以期為油松松針的綜合利用提供參考。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

FINNIGANTRACE DSQ GC/MS(氣相色譜-四級桿質(zhì)譜連用儀，美國熱電公司)(Thero Electron Corportion)、揮發(fā)油提取器、無水乙醚(沸程30～60℃)、無水硫酸鈉。

1.2樣品采集與處理

選擇隴南地區(qū)武都市柏林鄉(xiāng)萬畝油松人工林，以谷雨(2009年4月20日)、大暑(2009年7月25日)、霜降(2009年10月27日)、大寒(2010年1月25日)時節(jié)為采樣時間；選擇 4年、10年、25年樹齡段；每一樹齡分別選取郁閉度1、0.7和0.4，上、中、下3個冠層，東、南、北等3方位枝向，枝尖和枝中兩枝位為采樣點，按松林分布面積采用四分法隨機抽取5個點采集松枝，剝離松針混勻，隨機取樣粉碎成0.5～1.0cm左右，備用。

1.3氣相色譜-質(zhì)譜分析條件

氣相色譜條件TRACE GC Ultra(氣相色譜儀)；DB-5ms色譜柱為30m×0.25mm×0.25μm；載氣流速為1.2mL/min；進樣口溫度為220℃；程序升溫為50℃恒溫3min后，以20℃/min升溫數(shù)率由50℃程序升溫至120℃，再以5℃/min數(shù)率由120℃程序升溫至250℃。

質(zhì)譜條件TRACE DSQTM四級桿質(zhì)譜儀；EI離子源，離子源溫度為220℃；EI源能量為70eV，傳輸線溫度為250℃；質(zhì)量掃描范圍為30～650amu；譜庫為美國NIST-2002。

1.4松針揮發(fā)油提取

采用水蒸氣蒸餾法[8]，多套揮發(fā)油提取裝置同時提取。新鮮松針粉粹100g，裝入圓底燒瓶中加500mL蒸餾水，接揮發(fā)油蒸餾萃取裝置，1 000V可調(diào)電熱帽加熱燒瓶，沸騰后轉(zhuǎn)小火蒸餾約12h，讀取油狀液體體積，用無水乙醚多次萃取，無水硫酸鈉干燥過濾，除去溶劑，稱重并低溫保存,備用。

毛細管氣相色譜分離揮發(fā)油成分，通過化學工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，色譜峰面積歸一化法[9～10]，測得各化學組分在揮發(fā)油中的百分含量，再經(jīng)GC/MS測定，運用NIST-2002質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行自動檢索、解析，確認其化學成分，并在計算機檢索的基礎(chǔ)上進行人工識別和判讀。

1.5數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件及Excel 2007處理不同條件下的松針揮發(fā)油含量及平行測定進行數(shù)據(jù)并統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果與分析

2.1季節(jié)對油松針葉揮發(fā)油含量的影響

分別選擇1月、4月、7月、10月的大寒、谷雨、大暑、霜降時節(jié)為采樣時間，代表冬、春、夏、秋4季。圖1顯示,夏、冬兩季松針揮發(fā)油含量高于春、秋兩季，且夏季揮發(fā)油含量相對穩(wěn)定、較高，春季揮發(fā)油含量相對不穩(wěn)定、較低，冬、秋兩季介于前兩者之間，究其原因,夏季油松新陳代謝活動旺盛，食葉害蟲取食量大、病源菌繁殖快，林木需要較強的抵抗力來免受病蟲侵害，其植株的松針揮發(fā)油較高而且比較穩(wěn)定，與其抵御害蟲和防御疾病的功能相適應(yīng)，是抵御病蟲害的反應(yīng)；春季揮發(fā)油含量低而且不穩(wěn)定，可能原因是害蟲下樹越冬、病源菌處于潛伏期，植株處于抽梢展葉期，樹體內(nèi)儲備的養(yǎng)分主要用于新枝嫩葉的形態(tài)建成，較少用于主動合成揮發(fā)油以抵御病蟲害，同樣也說明了這一時期油松未發(fā)生病蟲害的特點。

圖1　不同季節(jié)油松針葉揮發(fā)油總含量變化Fig.1　The change of total content of volatile oil from the pine needle in different seasons

2.2不同生長狀態(tài)下油松針葉揮發(fā)油含量的變化

在不同季節(jié)下，分別測定不同樹齡、郁閉度、冠層、枝向油松針葉揮發(fā)油，采用SPSS17.0軟件分析，結(jié)果見表1。

表1　不同因素及狀態(tài)下松針揮發(fā)油含量Tab.1　The content of volatile oils in different factors and stages　mL/100g

注：不同字母表示油松在同一指標不同月份揮發(fā)油含量差異顯著性，顯著水平為0.05。

表1顯示不同樹齡、郁閉度、冠層、生長方向及枝位因素下?lián)]發(fā)油的含量有差異。通過數(shù)量化理論及逐步回歸分析和多重組間分析，結(jié)果顯示：(1)樹齡對揮發(fā)油含量有顯著影響(p<0.05)，且隨樹齡增加呈先緩后快的增加趨勢，樹齡越大揮發(fā)油含量越高，其對病蟲害抵御能力越強，油松幼樹針葉受病蟲害刺激時會主動提高揮發(fā)油含量以增強抗病能力。(2)冠層對油松針葉揮發(fā)油含量有顯著影響(p<0.05)，高冠層相對于中冠層揮發(fā)油含量低且不穩(wěn)定,可能受強光照射因素影響,中冠層揮發(fā)油含量高相對穩(wěn)定，低冠層揮發(fā)油含量低與光照受限有關(guān),高中冠層揮發(fā)油含量顯著高于低冠層。(3)郁閉度對揮發(fā)油含量有顯著影響(p<0.05)，隨郁閉度增加揮發(fā)油含量呈降低趨勢，郁閉度0.4時，針葉揮發(fā)油含量較高且比較穩(wěn)定；郁閉度0.7時，針葉揮發(fā)油含量不太穩(wěn)定，變化較大，郁閉度1.0時，揮發(fā)油含量低且穩(wěn)定[12]。根據(jù)生態(tài)位構(gòu)建理論，在可變資源環(huán)境中有機體通過自身的活動、選擇及新陳代謝過程，可以部分地創(chuàng)建改造其生境。一般說來，郁閉度越大，林分內(nèi)的小環(huán)境越穩(wěn)定。作為抵御環(huán)境脅迫的代謝物質(zhì)，針葉揮發(fā)油含量一般隨著生境的穩(wěn)定呈降低之勢，這可能是揮發(fā)油含量隨郁閉度增加而降低的原因所在。郁閉度0.4的樣品全部采自樹齡10年的林分，采樣枝條或者是位于樹冠頂部的冠層10，或者是位于樹冠下部的冠層3，均處于樹冠外圍，要求針葉具備較高的抵御環(huán)境脅迫的能力，這可能是其針葉揮發(fā)油含量較高且比較穩(wěn)定的原因所在。郁閉度0.7的樣品采自樹齡25年和4年的林分，采樣枝條分別是冠層5、冠層3，均位于樹冠下部，其針葉揮發(fā)油含量變化大實際反映的是樹齡差異所帶來的影響。(4)枝中含量高于枝尖，枝中針葉其葉齡高于枝尖針葉，前者抵御病蟲害和環(huán)境脅迫的能力高于后者，而枝尖針葉處于生長旺盛期，這可能是枝中針葉揮發(fā)含量高于枝尖的原因，枝中和枝尖針葉揮發(fā)油含量不穩(wěn)定，是季節(jié)、樹齡、冠層和郁閉度等因子所帶來的影響。(5)枝向?qū)]發(fā)油含量無顯著影響。

2.3揮發(fā)油含量與各因素的相關(guān)性分析

采用逐步回歸分析法，數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)量化處理，利用Excel軟件計算獲得揮發(fā)油含量逐步回歸分析結(jié)果(表2)。

從表2可以看出，各回歸方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)最高為0.816 3，最低為0.534 3，相差達0.282 0，說明剔除枝位、枝向、樹齡、冠層、郁閉度5個因子對回歸方程的預(yù)測精度影響顯著，也即揮發(fā)油含量與這5個因子緊密相關(guān)。在全部27個回歸方程中，有一個明顯的特點，凡是同時剔除冠層與樹齡2個因子的回歸方程，其復(fù)相關(guān)系數(shù)均明顯低于同類回歸方程，說明冠層與樹齡在影響油松針葉揮發(fā)油含量方面具有很強的相關(guān)性。按回歸方程復(fù)相關(guān)系數(shù)降低最小原則和各個因子的方差比最小的原則，逐步回歸方程剔除的因子依次為枝向、枝位、冠層、郁閉度。表2反映了這一趨勢，在全部6個因子中，對針葉揮發(fā)油含量影響依次為季節(jié)、林齡、郁閉度、冠層、枝位、枝向。為了深入分析各因子與揮發(fā)油含量測定值的相關(guān)程度，分別將剔除郁閉度或樹齡因子的回歸方程各類目的得分值作為其所屬因子的替代性定量分析數(shù)據(jù)，利用SPSS軟件進行相關(guān)分析(表3)。

表2　揮發(fā)油含量逐步回歸結(jié)果Tab.2　The stepwise regression analysis for volatile oil content

注：**在0.01水平上顯著相關(guān);(1)由剔除林齡的回歸方程計算得出，其他因子由剔除郁閉度的回歸方程計算得出；(2)由剔除1個因子的回歸方程中計算得出，為消除其他4個因子影響后某個因子與測定值的相關(guān)程度。

由表3可以看出，油松針葉揮發(fā)油含量與季節(jié)、冠層、樹齡和郁閉度4個因子的單相關(guān)系數(shù)和偏相關(guān)系數(shù)均達到極顯著水平，與枝位的偏相關(guān)系數(shù)也達到極顯著水平。由此說明，油松針葉揮發(fā)油含量極顯著地受季節(jié)、枝位、冠層、樹齡和郁閉度5個因子的影響。其中，揮發(fā)油含量與郁閉度的單相關(guān)系數(shù)為負值，由于郁閉度的類目以數(shù)值大小為序，說明油松針葉揮發(fā)油含量隨郁閉度增大而呈降低之勢。綜合變化趨勢分析、逐步回歸分析和測定值穩(wěn)定性分析結(jié)果表明，影響油松針葉揮發(fā)油含量變化的因子其影響程度由高而低依次為季節(jié)、樹齡、冠層、郁閉度和枝位，尤以季節(jié)的影響最為顯著，其中，季節(jié)和枝位的影響各自獨立，樹齡、冠層和郁閉度的影響存在交互作用，尤以林齡和冠層之間的交互作用最大；枝向則無顯著影響。

2.4不同季節(jié)揮發(fā)油的化學成分分析

將松針揮發(fā)油平均含量較高的冬季和夏季樣本提取的揮發(fā)油分別合并，通過GC/MS分析分別鑒定出51個化合物，其中相似度在86%以上的化合物有22個，并為2個月份所共有的化合表物結(jié)構(gòu)(圖2及表3)。

圖2　冬季、夏季油松松針揮發(fā)油總離子流圖[11]Fig.2　Total ion chromatograms of volatile in oil pine needle in winter and summer

表4中顯示兩個代表季節(jié)的松針揮發(fā)油主要成分為蒎烯、莰烯、左旋乙酸龍腦酯、石竹烯、à-依蘭油烯及匙葉桉油烯醇、石竹烯氧化物、依蘭油醇、杜松醇、桑伯格醇等，兩季節(jié)松針揮發(fā)油化學成分含量有差異，蒎烯和石竹烯是兩個季節(jié)針葉揮發(fā)油的主成分。

2.5不同季節(jié)萜烯類化合物分析

季節(jié)不同揮發(fā)油萜烯化合物含量有差異(圖3)。夏季萜烯類化合物總含量80.55%，冬季總含量為85.74%，萜烯類化合物總體水平高于雪松(Cedrusatlantica)松針[13]，不同季節(jié)含量差異與植物體自體新陳代謝調(diào)節(jié)及揮發(fā)油生物學活性有關(guān)。單萜化合物冬季36.20%、夏季41.52%，顯示植物體在夏季以機體基礎(chǔ)物質(zhì)蓄積為主，并抵御昆蟲侵害；倍半萜類化合物冬季36.34%、夏季30.63%，顯示植物體在冬季化感作用強盛，以適應(yīng)外界惡劣環(huán)境，保護自體生長。

倍半萜含氧衍生物冬季顯著高于夏季，表明倍半萜及其含氧衍生物類化合物參與抵御外界環(huán)境影響作用，體現(xiàn)油松耐寒耐貧瘠能力。萜烯類化合物對昆蟲具有誘導(dǎo)、驅(qū)避和傳遞信息等效應(yīng)，還能殺菌和抑制周圍鄰近植物生長，油松針葉萜烯類化合物冬季高于夏季，再一次印證松針揮發(fā)油與植物體應(yīng)對季節(jié)等環(huán)境因素變化而發(fā)揮生物學活性作用有關(guān)[12～15]。

表4　冬季、夏季油松松針揮發(fā)油化學成分分析[11]Tab.4　Chemical analysis of volatile oil in pine needle at different season

圖3　兩季節(jié)萜烯類化合物含量Fig.3　Terpenes content in winter and summer

3　結(jié)語

次生代謝物發(fā)揮著重要的生理及生物學活性作用。油松針葉揮發(fā)油在植物生長發(fā)育抵御外界環(huán)境干擾、抗病能力等方面發(fā)揮著重要生物學作用，其化學成分組成及含量隨種屬、生長期、季節(jié)、光照強度等因素變化。研究表明季節(jié)對揮發(fā)油含量有顯著影響，且隨樹齡增大呈先緩后快的增加趨勢，提示植物機體揮發(fā)油在成熟期主要發(fā)揮殺菌、抗脂質(zhì)過氧化、抵抗環(huán)境影響作用，冠層、郁閉度、枝位對揮發(fā)油含量也有顯著影響。揮發(fā)油成分分析顯示單萜、倍半萜及其含氧衍生物是松針揮發(fā)油的主成分，其中蒎烯具有較強的解毒、抗炎、祛痰和抗菌作用，石竹烯對皮膚炎癥及消化系統(tǒng)潰瘍有較好的療效[15-17]，單萜化合物夏季高于冬季，可用于醫(yī)藥及植物源農(nóng)藥原料，倍半萜類化合物冬季高于夏季，它是醫(yī)藥行業(yè)重要原料，倍半萜含氧衍生物冬季高于夏季，它是香氣的主要成分，可用于藥品和香料行業(yè)及食品添加劑[6]。實驗表明揮發(fā)油含量隨樹齡增長呈增加趨勢，夏、冬兩季特別是夏季揮發(fā)油含量最高，春、秋兩季揮發(fā)油含量較低。萜烯類化合物在夏、冬兩季含量有差異，提示倍半萜及其含氧衍生物在冬季發(fā)揮生物學活性作用，尤其是化感作用。本研究還發(fā)現(xiàn)不同部位樣品提取的揮發(fā)油在色澤、比重和濁度上有很大差異，可能是樹齡和光照強度等因素導(dǎo)致化學成分差異所致，其影響因素及構(gòu)效關(guān)系尚待進一步研究。

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Chemical Constituent and Content of Volatiles from Pine Needles of Pinus tabulaeformis Carr.

DUAN Hui1，F(xiàn)AN Shi-yong1，WANG Wen-qi1，LIU Zhen-lin1，CAI Xing2

(1.The Analysis & Research Center of Gansu Province，Lanzhou Gansu 730000，P.R.China；2.Training Center of Gansu Provincial Science and Technology Department，Lanzhou Gansu 730000，P.R.China)

Chemical constituents and contents of volatiles from pine needles ofPinustabulaeformisCarr.were studied by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS),and the impacts of 6 factors were also analyzed.The results showed that the main contents of volatiles from pine needles were L-bornyl acetate,Caryophyllene,Caryophyllene oxide,à-Muurolene,(-)-Spathulenol,tau.-Cadinol,à-Cadinol ect..Several factors such as different seasons,forest ages,tree canopies,crown densities,branch locations have significant impact on the content of pine needle volatiles.

PinustaulaeformisCarr；volatiles；GC-MS；season；forest age；crown density；tree canopy

10.166473/j.cnki.xblykx1972.2016.05.005

2015-10-14

甘肅省重大科技攻關(guān)項目“甘肅油松針葉有效成分分析及綜合應(yīng)用研究(2GS504-A41-006)”。

段輝(1965-)，女,研究員,博士,主要從事天然產(chǎn)物分析研究。E-mail：775341390@qq.com

簡介：蔡興(1959-),男,高級工程師，主要從事分析化學研究。E-mail:cxing407@163.com

S 791.254

A

1672-8246(2016)05-0024-07