家蠶1-脫氧野尻霉素含量與體內(nèi)糖苷酶活性的相關(guān)性

陳紅霞，劉月琴，潘 剛，趙 明，歐陽臻，*

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212018）

家蠶1-脫氧野尻霉素含量與體內(nèi)糖苷酶活性的相關(guān)性

陳紅霞1，2，劉月琴2，潘 剛3，趙 明2，歐陽臻1，2，*

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212018）

為研究家蠶富集1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）的機制，本實驗分析了不同品種家蠶體內(nèi)DNJ含量并研究其與蠶體內(nèi)糖苷酶的關(guān)系。選擇了25 個不同的家蠶品種，用相同條件的桑葉飼喂不同品種的家蠶，采用柱前衍生高效液相色譜法分析不同品種蠶體DNJ含量并研究其與體內(nèi)蔗糖酶、乳糖酶及淀粉酶3 種糖苷酶活性之間的相關(guān)性。結(jié)果表明：不同品種家蠶體內(nèi)DNJ含量差異顯著，DNJ含量最高種是最低種的7 倍，蠶體DNJ含量與體內(nèi)的蔗糖酶、乳糖酶等二糖酶活力成顯著負相關(guān)，與淀粉酶的活力相關(guān)性相對較弱。

家蠶；1-脫氧野尻霉素；糖苷酶；相關(guān)性

陳紅霞， 劉月琴， 潘剛， 等. 家蠶1-脫氧野尻霉素含量與體內(nèi)糖苷酶活性的相關(guān)性［J］. 食品科學， 2016， 37（15）: 156-159.

CHEN Hongxia， LIU Yueqin， PAN Gang， et al. Correlation between 1-deoxynojirimycin content and glucosidase activities in silkworm （Bombyx mori L.）［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 156-159. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615026. http://www.spkx.net.cn

在中國，桑、蠶自古以來就是藥食兩用的材料，用以預(yù)防和治療糖尿病。1997年，韓國學者Ryu等［1］首次報道了用家蠶（Bombyx mori L.）5 齡幼蟲制成的全蠶粉治療糖尿病，引起了廣泛關(guān)注和研究［2-6］?，F(xiàn)代藥理學研究進一步證明，桑、蠶中以1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）為主的多羥基生物堿類成分［7-8］，可抑制餐后血糖升高，具有預(yù)防和治療糖尿病的作用［9-10］。目前用桑葉或蠶粉制作的降血糖產(chǎn)品，在韓國、日本、中國等東南亞國家深受糖尿病患者的歡迎。

天然DNJ由Yoshiaki等［11］于1976年首次從桑樹中分離獲得，且研究發(fā)現(xiàn)桑樹中的DNJ含量遠高于其他植物（如鴨跖草、風信子等）或微生物［12-14］。家蠶以桑葉為食，在食桑階段蠶體對DNJ有奇妙的富集作用［15］。本課題組前期研究的結(jié)果證明：家蠶在幼蟲期，除不吃桑葉的蟻蠶和熟蠶外，其他任一時期蠶體中DNJ含量均大大高于桑葉中的DNJ含量［16］，且用不含桑葉的人工飼料飼養(yǎng)家蠶，蠶體檢測不到DNJ，這些結(jié)果充分說明蠶體DNJ來源于桑葉，且蠶體具有高效富集DNJ的功能［17］。由此，利用家蠶這個天然的生物反應(yīng)器獲取天然來源的DNJ，將是非常便捷有效的新途徑。

DNJ是強效的α-葡萄糖苷酶抑制劑［18］，能夠競爭性抑制α-葡萄糖苷酶的活性，阻礙二糖同酶的結(jié)合，致使二糖無法降解吸收，從而降低血糖，因此DNJ在治療糖尿病方面具有獨特作用。然而家蠶富集DNJ的機理及其與體內(nèi)糖苷酶的關(guān)系尚無明確報道［19-21］。本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，選擇25 個不同的家蠶品種，在相同條件下飼喂至5 齡第3天，比較不同品種蠶體中DNJ含量和3 種主要的糖苷酶（蔗糖酶、乳糖酶和淀粉酶）的活性，分析其相關(guān)性，旨在揭示家蠶體內(nèi)DNJ與糖苷酶活性的關(guān)系，為進一步尋找家蠶高效富集DNJ的相關(guān)酶，闡明家蠶富集DNJ的分子機理奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

7021、2042、菁松、白玉、秋豐等25 個家蠶品種（表1）均由中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所（鎮(zhèn)江）提供。

乙腈（色譜純） 江蘇漢邦科技有限公司；芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl） 美國Sigma公司；甘氨酸 華美生物工程有限公司；DNJ對照品（純度＞98%） 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

HHS-1恒溫水浴鍋 上海浦東躍欣科學儀器廠；LC1500高效液相色譜系統(tǒng) 日本分光公司；N2000色譜工作站 浙江大學智能信息工程研究所；LC 2000液相色譜儀 美國安捷倫公司；UV-2102PCS型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）分析儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1家蠶飼養(yǎng)及蠶體酶液制備

所有品種的家蠶在相同蠶室條件下（（25±1） ℃，相對濕度（80±2）%，12 h白晝交替），以相同的新鮮桑葉喂食至5 齡第3天，收集蠶體，饑餓24 h后分為兩部分：一部分蠶體冷凍、干燥、粉碎，過80 目篩后，-70 ℃冷凍保存，備用；另一部分（每品種各取2 頭家蠶，稱質(zhì)量）于冰浴中迅速解剖，去表皮，加預(yù)冷的pH 6.0磷酸鹽緩沖液冰浴中勻漿蠶體剩余組織，勻漿液在4 ℃、16 099×g離心10 min，取上清液作為酶液，迅速測定酶的活性。

1.3.2蠶體DNJ含量測定［22-24］

1.3.2.1色譜條件

色譜柱：HiQSiL C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）及ODS3預(yù)柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%醋酸（55∶45，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長254 nm，發(fā)射波長322 nm；進樣量10 μL。

1.3.2.2樣品處理及蠶體DNJ含量計算

準確稱取1.3.1節(jié)制備的蠶體凍干粉末0.1 g于15 mL的離心管，加入10 mL 0.05 mol/L的鹽酸溶液超聲提取2 次，合并2 次提取液于50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至50 mL，取10 μL于1.5 mL的離心管中（另取10 μL 76 μg/mL的DNJ標準溶液同步衍生化處理），加10 μL pH 8.5硼酸鹽緩沖液，再加入5 mmol/L FMOC-Cl-乙腈溶液20 μL，混勻后于20 ℃水浴反應(yīng)20 min，加入0.1 mol/L的甘氨酸10 μL，讓剩余的衍生化試劑反應(yīng)，最后加入950 μL體積分數(shù)0.1%的醋酸水溶液，過濾后，取10 μL注入高效液相色譜柱進行分析。

1.3.3蠶體糖苷酶活性的測定

分別量取0.2 mL質(zhì)量分數(shù)2%底物（淀粉、蔗糖和乳糖）的水溶液，將0.8 mL的0.2 mol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液和80 μL蠶體酶液混勻，室溫下反應(yīng)10 min后，置于37 ℃水浴60 min，加1.0 mL 3，5-二硝基水楊酸終止反應(yīng)，然后沸水浴5 min，于540 nm波長處測光密度（OD）值。無酶反應(yīng)體系用80 μL 0.2 mol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液代替酶液，作為對照。OD值越高，表明酶活性越強。

2　結(jié)果與分析

2.1不同品種蠶體DNJ的含量及3 種糖苷酶的活性

25 個家蠶品種蠶體DNJ含量（從高到低排序）及3 種糖苷酶活性結(jié)果見表1和圖1。由表1可知，各品種蠶體DNJ含量（占蠶體干質(zhì)量，下同）在0.08%～0.56%之間，不同品種蠶體DNJ含量有 明顯差異，最高品種（2042）DNJ含量是最低品種（‘洞庭×碧波’）DNJ含量的7.0 倍；由圖1可知，隨家蠶品種所含DNJ含量的逐漸降低，各品種蠶體內(nèi)3 種糖苷酶（淀粉酶、蔗糖酶和乳糖酶）的活性均呈逐漸上升的趨勢，即蠶體DNJ含量與3 種糖苷酶的活性成負相關(guān)。

表1　25 個家蠶品種編號及蠶體DNJ含量Table 1 DNJ contents of 25 strains of silkworms

表1　25 個家蠶品種編號及蠶體DNJ含量Table 1 DNJ contents of 25 strains of silkworms

品種編號品種名稱DNJ含量/%品種編號品種名稱DNJ含量/% 120420.56±0.02 14P500.23±0.02 270210.38±0.0215菁松×皓月0.23±0.02 370200.37±0.0216秋豐0.21±0.01 4菁松0.37±0.0117秋豐×白玉0.20±0.02 520500.35±0.0218白玉×秋豐0.18±0.02 6皓月0.35±0.0119皓月A×B0.17±0.01 7碧×波0.33±0.0120 野三元日×中0.14±0.01 8豐l0.30±0.0221洞×庭0.12±0.02 9150.28±0.0122野三元中×日0.10±0.02 10白玉0.27±0.0223碧波×洞庭0.10±0.02 1170100.27±0.0124日系784×84 0.09±0.02 1254A0.26±0.0125洞庭×碧波0.08±0.01 13皓月×菁松0.24±0.02

圖1　25 個家蠶品種蠶體DNJ含量及3 種糖苷酶的酶活性Fig. 1 DNJ contents and the activities of 3 glucosidases in 25 strains of silkworms

2.2DNJ含量與糖苷酶活性的相關(guān)性分析

進一步分析蠶體DNJ含量與糖苷酶活性的相關(guān)性（表2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNJ含量與3 種糖苷酶的活性不僅成負相關(guān)，其中與二糖酶即蔗糖酶和乳糖酶的相關(guān)性極強，相關(guān)系數(shù)均大于0.9，與淀粉酶的相關(guān)性相對較弱。

表2　蠶體DNJ含量與糖苷酶活性的相關(guān)性Table 2 Correlation between DNJ content and the activities of glucosidases in silkworms

3　討 論

桑葉中含有以DNJ為主的多羥基生物堿，該類物質(zhì)是一種強效的α-葡萄糖苷酶抑制劑，也是桑樹的一種抗逆性物質(zhì)，用來防御植食性昆蟲的啃食［25］。有研究報道［20］，非食桑昆蟲（如蓖麻蠶、毛蟲等）在食用了含有DNJ的食物后，由于體內(nèi)二糖酶活性受到抑制，導致單糖的吸收減少，影響了蟲體的生長，而對于家蠶來說，蠶體的生長則不受影響。

家蠶一生食桑，且對DNJ具有奇妙的富集作用，本課題組前期研究及文獻報道［15-17］均發(fā)現(xiàn)，家蠶的任一成長發(fā)育階段（蟻蠶和熟蠶不吃桑葉除外），其蠶體DNJ含量均大大高于桑葉中的DNJ含量，且用不含桑葉粉的人工飼料飼養(yǎng)家蠶，則體內(nèi)不含DNJ，證實了家蠶體內(nèi)DNJ來源于桑葉，而家蠶自身不能產(chǎn)生DNJ，這一結(jié)果充分說明蠶體具有高效富集DNJ的功能。因此，利用家蠶生物反應(yīng)器獲取DNJ，很可能成為一種更加便捷有效的新途徑。

本實驗研究結(jié)果顯示，不同品種的家蠶體內(nèi)DNJ含量差異顯著，DNJ含量高的家蠶品種其體內(nèi)蔗糖酶和乳糖酶的活性較低，DNJ含量低的品種其體內(nèi)蔗糖酶和乳糖酶的活性則較高，蠶體DNJ含量與體內(nèi)這兩種主要的二糖酶的活性存在顯著的負相關(guān)（P＜0.01），但家蠶食桑后仍能正常生長，蠶體內(nèi)糖的吸收并未受到DNJ的影響，由此說明家蠶長期食用含有DNJ的桑葉，與桑樹共進化，逐漸演化形成了一種體內(nèi)二糖酶對DNJ抑制性不敏感的體質(zhì)，其原因可能是家蠶體內(nèi)含有一種未知的酶類物質(zhì)，這種酶類物質(zhì)抵抗DNJ的二糖酶抑制性，不使DNJ與二糖酶作用在體內(nèi)被轉(zhuǎn)化吸收，從而使DNJ逐漸在體內(nèi)富集，具體機制及相關(guān)酶類物質(zhì)本課題組正在進一步研究中。對家蠶富集DNJ機制的研究，對于選育出高效富集DNJ的優(yōu)良蠶種資源具有重要的指導性意義，可幫助找到一條更加有效地獲得DNJ活性物質(zhì)的新途徑，為開發(fā)新的降血糖藥物和功能食品提供基礎(chǔ)研究依據(jù)，同時為桑蠶資源的深度開發(fā)利用開拓新的方法和技術(shù)手段。

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Correlation between 1-Deoxynojirimycin Content and Glucosidase Activities in Silkworm （Bombyx mori L.）

CHEN Hongxia1，2， LIU Yueqin2， PAN Gang3， ZHAO Ming2， OUYANG Zhen1，2，*
（1. School of Food and Biological Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China； 2. School of Pharmacy，Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China； 3. The Sericultural Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhenjiang 212018， China）

In ord er to reveal the mechanism of 1-deoxynojirimycin （DNJ） enrichment in silkworm （Bombyx mori L.）， we studied and analyzed the correlation between DNJ content and glucosidase activities in silkworm. Towards this goal， 25 strai ns of silkworms were selected and raised with the same mulberry leaves. Pre-column derivatization high performance liquid chromatography （HPLC） was applied to determine the DNJ content of different strains of silkworms， and the activities of 3 major glucosidases （sucrase， lactase and amylase） were measured， respectively， for the analysis of correlation between DNJ content and glucosidase activities in silkworms. Our results indicated that different strains of silkworms had significant differences in DNJ content， and the highest DNJ content （which was found in the strain 2042， 0.56%） was 7 times higher than the lowest one （in ‘DongTing × BiBo’， 0.08%）. DNJ content had significantly negative correlations with the activity of either of two disaccharidases， sucrase and lactase， and had a relatively weaker correlation with amylase activity. Key word s: Bombyx mori L.； 1-deoxynojirimycin； glucosidase； correlation

10.7506/spkx1002-6630-201615026

R932

A

1002-6630（2016）15-0156-04

10.7506/spkx1002-6630-201615026. http://www.spkx.net.cn

2015-12-24

國家自然科學基金面上項目（81072985；81573529）；江蘇省博士創(chuàng)新計劃項目（CXLX13_684）

陳紅霞（1975—），女，副教授，博士研究生，研究方向為中藥資源開發(fā)。E-mail：chhx2011@ujs.edu.cn

歐陽臻（1964—），女，教授，博士，研究方向為中藥資源活性成分及新藥開發(fā)。E-mail：zhenouyang@ujs.edu.cn

引文格式：