直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測呋喃妥因代謝物

李亞楠，王 瑞，李 濤，王云貴，黃登宇，*

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，食品藥品快速檢測中心，山西 太原 030006；2.山西先鋒科技開發(fā)有限公司，山西 太原 030006；3.深圳易瑞生物技術(shù)有限公司，廣東 深圳 518101）

直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測呋喃妥因代謝物

李亞楠1，王 瑞1，李 濤2，王云貴3，黃登宇1，*

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，食品藥品快速檢測中心，山西 太原 030006；2.山西先鋒科技開發(fā)有限公司，山西 太原 030006；3.深圳易瑞生物技術(shù)有限公司，廣東 深圳 518101）

建立檢測動(dòng)物組織中呋喃妥因代謝物的直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法。采用棋盤法確定抗體和酶標(biāo)抗原的最佳稀釋度，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化包被條件、封閉液種類和競爭反應(yīng)時(shí)間，建立直接競爭抑制曲線，并對方法的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)。結(jié)果表明，經(jīng)優(yōu)化，最佳反應(yīng)條件為抗體稀釋度1∶4 000，酶標(biāo)抗原稀釋度1∶80，包被條件為37 ℃ 2 h后4 ℃過夜，封閉液為1%牛血清白蛋白，競爭反應(yīng)1 h。該方法的線性檢測范圍為0.030～10.595 ng/mL，IC50為0.559 ng/mL；加標(biāo)回收率為84.9%～103.4%，批內(nèi)變異系數(shù)為3.4%～7.8%，批間變異系數(shù)為4.7%～11.8%；除與呋喃妥因原藥交叉反應(yīng)率為36.2%，與其他結(jié)構(gòu)類似物及衍生化試劑交叉反應(yīng)率均小于0.1%。該方法靈敏、準(zhǔn)確，可用于動(dòng)物組織中呋喃妥因代謝物的快速篩查。

呋喃妥因；1-氨基-乙內(nèi)酰脲；直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫檢測；動(dòng)物組織

李亞楠， 王瑞， 李濤， 等. 直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測呋喃妥因代謝物［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（8）: 231-235.

LI Yanan， WANG Rui， LI Tao， et al. Detection of furantoin metabolite by direct competitive chemiluminescene enzyme immunoassay［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 231-235. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608042. http://www.spkx.net.cn

硝基呋喃類獸藥是一類人工合成的廣譜抗菌藥，用于預(yù)防和治療由大腸桿菌和沙門氏菌引起的胃腸道感染，主要包括呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮和呋喃西林［1-2］。這類藥物進(jìn)入動(dòng)物體后，很快代謝為相應(yīng)的代謝物1-氨基-乙內(nèi)酰脲（1-amino-hydantoin，AHD）、3-氨基-2-惡唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮（3-amino-5-morpolinomethyl-2-oxazolidone，AMOZ）和氨基脲（semicarbazide，SEM）［3］，并在動(dòng)物體內(nèi)長期穩(wěn)定存在［4］。由于硝基呋喃類藥物及其代謝物對人體有潛在致癌、致突變作用，很多國家禁止用于食品生產(chǎn)的動(dòng)物使用此類藥物［5］。但是此類抗生素成本低、預(yù)防和治療細(xì)菌感染效果明顯，因此仍然被非法使用［6-7］。

目前，檢測動(dòng)物源食品中AHD的方法有高效液相色譜法［8］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［9-11］、膠體金免疫層析法［12-13］和酶聯(lián)免疫吸附法［2，14-15］。儀器分析法雖然準(zhǔn)確度和精確度高、重復(fù)性好，且可同時(shí)檢測多種物質(zhì)，但是檢測時(shí)間長、成本高、操作技術(shù)要求高［16］；膠體金免疫層析法操作簡便、快速，但是只可對待測物進(jìn)行半定量檢測，且準(zhǔn)確度低；酶聯(lián)免疫吸附法具有較高的準(zhǔn)確度和精確度、較強(qiáng)的特異性，技術(shù)要求不高，可實(shí)現(xiàn)大批量檢測?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫（chemiluminescene enzyme immunoassay，CLEIA）法將化學(xué)發(fā)光反應(yīng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，通過過氧化物酶與化學(xué)發(fā)光底物作用，檢測化學(xué)發(fā)光信號，進(jìn)而對待測物進(jìn)行定量檢測；具有酶聯(lián)免疫吸附法操作簡便、快速等特點(diǎn)，但是靈敏度更高［17］，現(xiàn)已廣泛用于食品分析檢測中［18-20］。

本實(shí)驗(yàn)制備得到了AHD酶標(biāo)抗原，優(yōu)化主要反應(yīng)條件，建立了檢測AHD的dc-CLEIA方法，可用于食品中AHD殘留的快速篩查，為研制AHD快速檢測試劑盒提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豬里脊肉、雞胸肉、鯉魚肉 市購。

AHD單克隆抗體 北京艾旗斯德科技有限公司；AHD、1-（2-硝基苯亞甲基）-氨基乙內(nèi)酰脲（1-［（2-nitrobenzylidene）-amino］-imidazolidin-2，4-dione，NPAHD）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、魯米諾 美國Sigma公司；半抗原1-（4-羧基苯亞甲基）-氨基乙內(nèi)酰脲（1-［（4-carbo-benzylidene）-amino］-imidazolidin-2，4-dione，CPAHD） 本實(shí)驗(yàn)室自制；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

將魯米諾、過氧化氫脲和對碘苯酚按照物質(zhì)的量比為5∶3∶7配制化學(xué)發(fā)光液［21］。

1.2儀器與設(shè)備

96 孔化學(xué)發(fā)光板 美國Thermo公司；INFINITE 200PRO酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；UV-1600PC紫外-可見分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器公司。

1.3方法

1.3.1制備酶標(biāo)抗原（CPAHD-HRP）

采用活性酯法制備酶標(biāo)抗原［22］，具體操作如下：稱取2.5 mg CPAHD溶于100 μL 2，2-二甲氧基丙烷中，加入1.8 mg N-羥基丁二酰亞胺和3.4 mg N，N'-二環(huán)己基碳二亞胺，混勻，室溫條件下避光攪拌反應(yīng)15 h，得A液；稱取2.6 mg HRP溶于1.0 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS，pH 7.4，0.01 mol/L）中，得B液；將A液逐滴加入B液中，室溫條件下攪拌反應(yīng)3 h。將反應(yīng)后混合液移至透析袋中，PBS透析3 d后，4 500 r/min離心5 min，取上清液，即為偶聯(lián)物CPAHD-HRP，用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行掃描。

1.3.2AHD直接競爭CLEIA法操作步驟

用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6，0.05 mol/L）將AHD單克隆抗體稀釋后，每孔100 μL加入到96 孔化學(xué)發(fā)光板中進(jìn)行包被；甩干孔內(nèi)液體，用PBST溶液（含0.05% Tween-20，pH 7.4，0.01 mol/L的PBS）洗板3 次，在吸水紙上拍干，每孔加入200 μL封閉液，37 ℃封閉2 h，洗板拍干；每孔加入50 μL NPAHD溶液或量品溶液和50 μL酶標(biāo)抗原，37 ℃反應(yīng)，洗板拍干；每孔加入100 μL化學(xué)發(fā)光液，室溫避光反應(yīng)4 min，用酶標(biāo)儀測各孔化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度（relative light unit，RLU）。

1.3.3直接競爭CLEIA法條件優(yōu)化

采用棋盤法確定抗體和酶標(biāo)抗原的最佳工作濃度，設(shè)置抗體稀釋度為1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000，1∶8 000、1∶16 000，酶標(biāo)抗原稀釋度為1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320，按照1.3.2節(jié)的步驟測定RLU值，同時(shí)做陰性對照（不加NPAHD溶液），每個(gè)實(shí)驗(yàn)3 次重復(fù)，計(jì)算平均值。根據(jù)B/B0（B為加NPAHD時(shí)RLU值，B0為不加NPAHD時(shí)RLU值）值確定最佳組合。

通過單因素試驗(yàn)確定最佳包被條件、封閉液種類和競爭時(shí)間。分別設(shè)置3 組包被條件：4 ℃包被過夜（1組）、37 ℃包被2 h后4 ℃包被過夜（2組）和37 ℃包被2 h（3 組）；3 種不同封閉液：1%脫脂乳粉（1組）、1%明膠（2組）和1% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（3組）；4 個(gè)競爭時(shí)間：40、60、120、150 min，按照1.3.2節(jié)的步驟測定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度RLU值，每個(gè)條件3 次重復(fù)。繪制各條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IC50（IC50為B/B0為0.5時(shí)相應(yīng)的NPAHD質(zhì)量濃度）和RLUmax/IC50（RLUmax為最大化學(xué)發(fā)光值）。以IC50和RLUmax/IC50作為確定最佳條件的依據(jù)，IC50越小，RLUmax/ IC50越大，靈敏度越高［19］。

1.3.4量品前處理

取1.0 g量品，加入4 mL超純水均質(zhì)；加入0.5 mL HCl溶液（1.00 mol/L）和100 μL鄰硝基苯甲醛（0.01 mol/L），混勻，37 ℃振蕩反應(yīng)16 h；加入5 mL K2HPO4溶液（0.1 mol/L）、0.4 mL NaOH溶液（1mol/L）和5 mL乙酸乙酯，室溫振蕩1 min；4 500 r/min離心10 min，取上清液至潔凈容器中，氮?dú)獯蹈?；加?.5 mL正己烷重新溶解，再加入0.5 mL PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）混勻；4 500 r/min離心10 min，取下層水相用于CLEIA測定［23］。

1.3.5方法學(xué)評價(jià)

1.3.5.1建立直接競爭CLEIA法標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制質(zhì)量濃度為100、20、4、0.8、0.16、0.032 ng/mL的NPAHD溶液，按照1.3.2節(jié)的步驟及上述優(yōu)化后最佳反應(yīng)條件進(jìn)行操作，測定RLU值，每個(gè)質(zhì)量濃度3 次重復(fù)。以NPAHD溶液質(zhì)量濃度常用對數(shù)值為橫坐標(biāo)，B/B0值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程，計(jì)算靈敏度IC50和線性范圍（IC20～I(xiàn)C80）。

1.3.5.2直接競爭CLEIA法特異性測定

直接競爭CLEIA法的特異性用交叉反應(yīng)率（cross reactivity，CR）衡量，NPAHD結(jié)構(gòu)類似物的CR越小，該方法的特異性越好。

將NPAHD結(jié)構(gòu)類似物呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、AHD、AOZ、AMOZ、SEM及其相應(yīng)代謝物衍生物3-（2-硝基苯亞甲基）-氨基-2-惡唑烷酮（3-［（2-nitro-benzylidene）-amino］-2-oxazolidone，NPAOZ）、5-（4-嗎啉基）-3-（2-硝基苯亞甲基）-氨基-2-惡唑烷酮（5-（4-morpholinymethyl）-3-｛［（2-nitrophenyl）methylene］amino｝-2-oxazolidinone，NPAMOZ）、2-硝基苯亞甲基-氨基脲（2-nitrobenzaldehyde-semicarbazone，NPSEM）和衍生化試劑對醛基苯甲酸（carboxybenzaldehyde，4-CBA）、鄰硝基苯甲醛分別配制成100、20、4、0.8、0.16、0.032 ng/mL系列質(zhì)量濃度，按照1.3.2節(jié)的步驟進(jìn)行測定，按下式計(jì)算CR。

1.3.5.3直接競爭CLEIA法準(zhǔn)確性和精密度測定

準(zhǔn)確性表示檢測值與真實(shí)值的符合程度，可用加標(biāo)回收率衡量；精密度表示該檢測方法的重復(fù)性，可用批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)衡量。通過對準(zhǔn)確性和精密度的測定，可以驗(yàn)證該方法的可靠性。

對空白豬肉、雞肉和魚肉進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別添加1、5 ng/g和10 ng/g三個(gè)水平的AHD標(biāo)準(zhǔn)品。每個(gè)水平做5 次重復(fù)，并分批進(jìn)行5 次實(shí)驗(yàn)。按照1.3.4節(jié)的步驟對量品進(jìn)行前處理后用所建立的CLEIA法測定，計(jì)算回收率、批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)。

1.3.5.42 種CLEIA法量品檢測限的比較

取空白豬肉20 份，按照1.3.4節(jié)的步驟進(jìn)行處理后分別采用建立的直接競爭CLEIA法與間接競爭CLEIA法進(jìn)行測定（在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室已建立了AHD檢測的間接競爭CLEIA法，見文獻(xiàn)［21］），依據(jù)各自線性方程計(jì)算對應(yīng)量品的NPAHD質(zhì)量濃度。量品最低檢測限為對應(yīng)量品NPAHD質(zhì)量濃度平均值加3 倍標(biāo)準(zhǔn)差。

2　結(jié)果與分析

2.1酶標(biāo)抗原CPAHD-HRP的紫外鑒定

圖1　CPAHD、HRP和CPAHD-HRP紫外掃描圖譜Fig.1 UV spectra of CPAHD， HRP and CPAHD-HRP

由圖1可見，CPAHD的特征吸收峰在298 nm波長處，HRP的特征吸收峰在403 nm波長處；CPAHD-HRP分別在297 nm和401 nm波長處有兩處吸收峰，同時(shí)具有CPAHD和HRP的特征，且與CPAHD和HRP相比，吸收峰發(fā)生了偏移，說明CPAHD-HRP偶聯(lián)成功。

2.2最佳反應(yīng)條件的確定

2.2.1抗體與酶標(biāo)抗原稀釋度的確定

表1　不同抗體和酶標(biāo)抗原稀釋度條件下的B/B0值Table 1 B/B0values of different dilutions of antibody and enzyme-labeled antigen

由表1可見，抗體稀釋度為1∶2 000，酶標(biāo)抗原稀釋度為1∶160時(shí)，B/B0值最小，為0.162 4；抗體稀釋度為1∶4 000，酶標(biāo)抗原稀釋度為1∶80時(shí)，B/B0值為0.163 9。競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫反應(yīng)中，B/B0越小，靈敏度越高；適當(dāng)加大抗體或酶標(biāo)抗原稀釋度，可提高靈敏度。結(jié)合考慮抗體與酶標(biāo)抗原的成本，選擇抗體稀釋度為1∶4 000，酶標(biāo)抗原稀釋度為1∶80。

2.2.2包被條件的確定

由圖2可見，3 種包被條件下，IC50逐步增大，RLUmax/IC50先增大后減小。第2組（37 ℃包被2 h后4 ℃包被過夜）的RLUmax/IC50最大，表明先37 ℃包被，有助于抗體在化學(xué)發(fā)光板上快速吸附，再4 ℃孵育過夜，可使抗體包被均勻，靈敏度提高。因此選擇37 ℃包被2 h后4 ℃包被過夜為最佳包被條件。

圖2　AHD CLEIA法包被條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of coating conditions for dc-CLEIA of AHD

2.2.3封閉液的確定

圖3　AHD dc-CLEIA法封閉液優(yōu)化Fig.3 Optimization of blocking liquid for dc-CLEIA of AHD

由圖3可見，明膠封閉時(shí)的IC50最高，1%脫脂乳粉和1% BSA封閉時(shí)的IC50接近；1% BSA封閉時(shí)的RLUmax/IC50最大，1%明膠和1%脫脂乳粉封閉時(shí)的RLUmax/IC50相差不大。因此綜合考慮IC50和RLUmax/IC50，選擇BSA為最佳封閉液。

2.2.4競爭時(shí)間的確定

圖4　AHD dc-CLEIA法競爭時(shí)間優(yōu)化Fig.4 Optimization of competitive reaction time for dc-CLEIA of AHD

如圖4所示，隨著競爭反應(yīng)時(shí)間的延長，IC50先減小后增大，1 h時(shí)最??；RLUmax/IC50先增大后趨于穩(wěn)定，1 h時(shí)最大。因此選擇1 h為最佳競爭時(shí)間。

2.3方法學(xué)評價(jià)

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

最佳反應(yīng)條件下建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.234 9x+ 0.440 8，IC50為0.559 ng/mL，在0.030～10.595 ng/mL范圍內(nèi)，呈線性關(guān)系，可進(jìn)行精確檢測。

2.3.2特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2　AHD-CLEIA法特異性測定結(jié)果Table 2 Specificity of AHD-CLEIA

由表2可知，AHD直接競爭CLEIA法對呋喃妥因原藥的CR為36.2%，與其他結(jié)構(gòu)類似物及衍生化試劑的CR均小于0.1%。但是呋喃妥因原藥在動(dòng)物體內(nèi)分解代謝快，在實(shí)際量品檢測中不存在呋喃妥因原藥與抗體競爭性結(jié)合。表明該方法所用AHD單克隆抗體特異性好。

2.3.3準(zhǔn)確性和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　AHD-CLEIA法的準(zhǔn)確性和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Accuracy and precision of AHD-CLEIA

對空白豬肉、雞肉和魚肉量品進(jìn)行3 個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，測定結(jié)果見表3，加標(biāo)回收率在84.9%～103.4%之間，相應(yīng)的批內(nèi)變異系數(shù)在3.4%～7.8%之間，批間變異系數(shù)在4.7%～11.8%之間。表明該方法的準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。

2.3.42 種CLEIA法量品檢測限的比較

2 種CLEIA法對豬肉量品的最低檢測限測定結(jié)果見表4。本研究建立的直接競爭CLEIA法在豬肉量品中的檢測限低于間接競爭CLEIA法，且操作更為簡便、檢測時(shí)間更短。

表4　2 種CLEIA法樣品檢測限的比較Table 4 Comparison of limit of detection between the two CLEIA methods μg/kg

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了檢測動(dòng)物組織中AHD殘留的直接競爭化學(xué)發(fā)光法，IC50為0.559 ng/mL，低于Jiang Wenxiao等［2］建立的酶聯(lián)免疫法的0.68 ng/mL，表明其靈敏度較高；在0.030～10.595 ng/mL范圍內(nèi)可進(jìn)行精確檢測。對豬肉、雞肉、魚肉在1、5、10 ng/g三個(gè)添加水平的回收率在84.9%～103.4%之間，批內(nèi)變異系數(shù)低于10%，批間變異系數(shù)低于12%。豬肉量品檢測限為0.015 μg/kg，低于國家標(biāo)準(zhǔn)中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的0.5 μg/kg［24］。本實(shí)驗(yàn)建立的AHD直接競爭CLEIA法與王瑞等［21］建立的AHD間接競爭CLEIA法相比，靈敏度較高，量品檢測限較低，且省去了加入酶標(biāo)二抗反應(yīng)這一步，檢測時(shí)間更短。因此，本研究建立的直接競爭CLEIA法靈敏度、準(zhǔn)確度和精確度高，且操作簡便、快速，可用于食品中AHD殘留的大量篩查。但是由于該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線中B/B0值偏低，在實(shí)際檢測中可能導(dǎo)致測定結(jié)果偏低。

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Detection of Furantoin Metabolite by Direct Competitive Chemiluminescene Enzyme Immunoassay

LI Yanan1， WANG Rui1， LI Tao2， WANG Yungui3， HUANG Dengyu1，*
（1. Food and Drug Rapid Inspection Center， College of Life Science， Shanxi University， Taiyuan 030006， China；2. Shanxi Vanguard Technology Co. Ltd.， Taiyuan 030006， China；3. Shenzhen Bioeasy Biotechnologies Co. Ltd.， Shenzhen 518101， China）

A direct competitive chemiluminescene enzyme immunoassay （dc-CLEIA） was developed to detect furantoin metabolite in animal tissues. The optimal dilutions of monoclonal antibody and enzyme labeled antigen were determined by chequerboard titration. The effects of coating conditions， blocking solution and competitive reaction time were investigated by single-factor experiments. The optimized reaction conditions were determined as follows: 4 000-fold dilution of monoclonal antibody 80-fold dilution of enzyme labeled antigen， 2 h incubation at 37 ℃ for coating followed by overnight storage at 4 ℃， blocking with 1% BSA， and 1 h competitive reaction. The linear detection range of the developed CLEIA was 0.030-10.595 ng/mL， and the 50% inhibitory concentration （IC50） value was 0.559 ng/mL. The recoveries in negative samples ranged from 84.9% to 103.4%. The intra-assay and inter-assay coefficients of variation were 3.4%-7.8% and 4.7%-11.8%， respectively. The cross-reactivity values were lower than 0.1% with other structural analogues and derivatives expect for furantoin original drug （36.2%）. The CLEIA method was sensitive and accurate， and thus suitable for the fast screening of furantoin metabolite in food samples.

furantoin； 1-amino-hydantoin （AHD）； direct competitive chemiluminescent enzyme immunoassay； animal tissues

10.7506/spkx1002-6630-201608042

TS207.3

A

1002-6630（2016）08-0231-05

10.7506/spkx1002-6630-201608042. http://www.spkx.net.cn

2015-07-20

李亞楠（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称沸鹿に嚺c食品安全。E-mail：nan4050@163.com

黃登宇（1968—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。E-mail：Huangdy1110@126.com

引文格式：