PET瓶裝無氣天然礦泉水中污染菌及其系統(tǒng)進(jìn)化分析

高 雯，胡曉敏，周幗萍，*

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.中國科學(xué)院武漢病毒研究所，湖北 武漢 430071）

PET瓶裝無氣天然礦泉水中污染菌及其系統(tǒng)進(jìn)化分析

高 雯1，胡曉敏2，周幗萍1，*

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.中國科學(xué)院武漢病毒研究所，湖北 武漢 430071）

目的：了解某一批次聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）瓶裝無氣天然礦泉水產(chǎn)生異味的緣由。方法：首先采用膜過濾結(jié)合平板菌落計(jì)數(shù)法分離和計(jì)數(shù)污染菌，16S rRNA序列分析鑒定其為假單胞菌屬（Pseudomonas spp.），再采用假單胞菌屬特異性rpoB引物進(jìn)行梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)優(yōu)化擴(kuò)增條件，產(chǎn)物進(jìn)行測序和序列分析將污染菌鑒定到種。結(jié)果：這批產(chǎn)品的主要污染菌是一種2009年從南極分離鑒定的假單胞菌屬新種P. extremaustralis。反接實(shí)驗(yàn)證實(shí)該菌能在天然礦泉水中生長繁殖，并產(chǎn)生刺激性異味。結(jié)論：P. extremaustralis部分細(xì)菌能夠透過兩級(jí)串聯(lián)0.2 μm過濾器，耐受中、低壓紫外殺菌工藝，耐低溫和低氧壓，能在無任何添加的PET瓶裝無氣天然礦泉水中生長并產(chǎn)生異味。

PET瓶裝無氣天然礦泉水；Pseudomonas extremaustralis；異味；紫外殺菌；兩級(jí)串聯(lián)0.2 μm過濾器

高雯， 胡曉敏， 周幗萍. PET瓶裝無氣天然礦泉水中污染菌及其系統(tǒng)進(jìn)化分析［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（8）: 196-200.

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2009年10月1日實(shí)施的GB 8537—2008《飲用天然礦泉水》中關(guān)于微生物指標(biāo)增加了3 項(xiàng)，糞鏈球菌、銅綠假單胞菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌，刪除了1 項(xiàng)菌落總數(shù)［1-2］。之前的《飲用天然礦泉水》國家標(biāo)準(zhǔn)要求灌裝產(chǎn)品菌落總數(shù)低于50 CFU/mL［2］。為達(dá)到這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，礦泉水企業(yè)普遍采用了臭氧殺菌工藝，但該工藝極易產(chǎn)生溴酸鹽，而國際癌癥研究中心認(rèn)為溴酸鉀對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有致癌作用，但溴酸鹽對(duì)人的致癌作用還不能肯定，為此將其列為可能對(duì)人致癌的物質(zhì)。因此，新國標(biāo)和國際接軌，限定溴酸鹽含量不得超過0.01 mg/L，而不再限定菌落總數(shù)［3］。為響應(yīng)新國標(biāo)要求，一些新建生產(chǎn)線普遍采用紫外殺菌或無菌過濾工藝替代臭氧殺菌工藝，但是新工藝新設(shè)備的推廣過程中會(huì)遭遇新問題。天然礦泉水中存在著極微細(xì)胞ultramicrocells能透過0.2 μm或0.45 μm無菌細(xì)菌濾器。曾報(bào)道在水源地存在并具有極微細(xì)胞形態(tài)的有假單胞菌屬、黃桿菌屬（Flavobacterium）、弧菌屬（Vibrio）、螺菌屬（Spirillium）、沙雷氏菌屬（Serratia）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）。其中某些細(xì)菌，如假單胞菌、黃桿菌和鞘氨醇單胞菌，還是某些天然礦泉水源中地方性獨(dú)特種群之一。在低營養(yǎng)物環(huán)境或饑餓狀態(tài)，饑餓的細(xì)胞會(huì)形成球形或細(xì)長桿菌的極微細(xì)胞，它們不僅能透過無菌細(xì)菌過濾器還能在極低營養(yǎng)環(huán)境中繁殖。礦泉水企業(yè)必須認(rèn)識(shí)到“無菌”細(xì)菌過濾器不能100%截留礦泉水中的細(xì)胞，更值得注意的是極微細(xì)胞生長緩慢，檢驗(yàn)時(shí)容易被忽視或低估。目前沒有一種濾器能夠截留所有細(xì)胞，所以單純過濾除菌是不足以保證產(chǎn)品的長期穩(wěn)定性［4］。

2015年1月，某企業(yè)生產(chǎn)的水源地為吉林長白山地區(qū)的某一批次聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）無氣天然礦泉水遭消費(fèi)者投訴產(chǎn)品有異味。企業(yè)召回產(chǎn)品后檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該批次有近1/3產(chǎn)品有刺激性異味，有人將其描述為類似臭雞蛋味，且細(xì)菌總數(shù)很高（不低于103CFU/250 mL）。為分析污染原因，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)變質(zhì)產(chǎn)品和正常產(chǎn)品進(jìn)行了比對(duì)分析。以期通過本次實(shí)驗(yàn)確定污染菌種及其特性，為企業(yè)及時(shí)采取相應(yīng)的控制和防治措施，也為行業(yè)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

送檢的量品為2015年1月異常批次的5 瓶量品編號(hào)1～5和膜過濾后培養(yǎng)編號(hào)為24、27、28和34的平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）平板，以及12 瓶正常批次量品和膜過濾后培養(yǎng)的編號(hào)22的PCA平板。

某礦泉水生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的PET瓶裝天然礦泉水的主要工藝流程為：水源→50 μm過濾→50 μm過濾→超濾膜超濾→活性炭過濾→1 μm過濾→紫外殺菌→0.45 μm過濾→0.2 μm過濾→紫外殺菌→0.2 μm過濾→成品。

Premix Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）預(yù)混試劑、DL2000 DNA Marker、Goldview核酸染料 日本TaKaRa公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；PCA、伊紅美藍(lán)瓊脂（eosin-methylene blue medium，EMB）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA） 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Salmonella-Shigella（SS）瓊脂 英國Oxoid公司；Lysogeny broth （LB）培養(yǎng)基自制。PCR引物合成和產(chǎn)物測序均由蘇州金唯智科技有限公司完成。

1.2儀器與設(shè)備

無菌過濾器（配套0.2 μm濾膜） 德國密理博公司；T100 Thermal Cycler PCR儀 美國Bio-Rad公司；電子舌TS-5000Z（配有DBMS數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)和APACHE2網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器） 日本Insent公司；GeneGenius凝膠圖像分析系統(tǒng) 英國Syngene公司。

1.3方法

1.3.1量品中微生物的檢測、計(jì)數(shù)、染色觀察

采用0.2 μm膜過濾250 mL水量，然后取下濾膜分別貼在PCA/EMB/PDA 3 種平板上進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)/大腸桿菌/霉菌酵母總數(shù)計(jì)數(shù)；分離株在LB培養(yǎng)基上劃線分離單菌落用于提取DNA模板；純化后菌株在EMB和SS平板上劃線觀察菌落形態(tài)。莢膜染色參見文獻(xiàn)［5］的方法。

1.3.2菌裂解液的制備

LB平板劃線分離待測菌株，30 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落，加入裝有50 μL無菌去離子水的PCR管中，混勻，94 ℃ 10 min裂解，12 000 r/min離心5 min，收集上清液即菌裂解液，4 ℃保存。

1.3.3分離株的16S rRNA和rpoB序列分析

表1　PCR所用引物Table 1 Primers used for PCR

表2　PCR反應(yīng)體系和條件Table 2 PCR systems and conditions

PCR引物、體系和條件參見表1、2，產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，Goldenview染色，凝膠成像分析儀觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果，產(chǎn)物送蘇州金維智公司測序。序列比對(duì)：在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST進(jìn)行比對(duì)。

1.3.4反接種驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將污染菌反接種到正常無菌水量中，30 ℃培養(yǎng)30 d，做嗅覺和電子舌測試。

1.3.5電子舌測試

水量未做任何處理，直接倒入電子舌專用杯子后，靜止3 min，常溫檢測，采用了酸味、鮮味、咸味、澀味和苦味5 種傳感器，每個(gè)量品重復(fù)測定3 次。

1.3.6亞硝酸鹽含量測定

依據(jù)GB/T 8538—2008《飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》［8］。

1.3.7易揮發(fā)性成分分析

量品外送采取頂空氣相色譜法分析。

2　結(jié)果與分析

2.1量品檢測

正常量品平均亞硝酸含量為2 μg/L，而細(xì)菌總數(shù)異常的量品亞硝酸含量大幅上升，平均達(dá)90 μg/L，但尚未超過GB 8537—2008《飲用天然礦泉水》要求，亞硝酸鹽含量要低于0.1 mg/L［1］。頂空氣相色譜法分析結(jié)果顯示硫醚類化合物含量大幅升高。

肉眼觀察5 瓶異常批次量品與正常水量外觀無差異，未出現(xiàn)混濁、沉淀、變色等異常，其中4 瓶有難以描述的刺激性氣味。EMB培養(yǎng)基上有菌落出現(xiàn)，但并非典型的大腸菌群形態(tài)，所以大腸桿菌群值和霉菌酵母數(shù)未檢出，細(xì)菌總數(shù)和風(fēng)味見表3。

表3　送檢樣品的細(xì)菌總數(shù)和風(fēng)味Table 3 Total bacterial counts and flavor of samples

22號(hào)量品是異常批次之前的正常批次中偶然發(fā)現(xiàn)個(gè)別細(xì)菌總數(shù)偏高的計(jì)數(shù)平板，其分離株NMW22與異常批次的分離株明顯不同，在PCA平板上菌落形態(tài)為白色不透明小菌落，圓而邊緣整齊，老熟后微泛黃。顯微形態(tài)為革蘭氏陰性短桿菌，寬約0.2 μm，長0.2～1 μm。初始菌體均一，老熟后細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)著色不均一的特點(diǎn)（圖1A）。雖然不具備產(chǎn)莢膜細(xì)菌的光滑型菌落典型特征，但是莢膜染色結(jié)果類似NMW27，也是產(chǎn)莢膜菌。

從1、2、3、5號(hào)成品水量中分離的菌株和24、27、28、34號(hào)PCA平板中的分離株菌落形態(tài)和顯微形態(tài)很相似初步判斷為同類菌株。以NMW27為例，革蘭氏陰性短桿菌，寬約0.2～0.5 μm，長1.5～2 μm。PCA上菌落圓整、細(xì)小、扁平而半透明；SS培養(yǎng)基上近乎無色，邊緣圓整而透明，中心有乳頭量凸起，直徑僅為1 mm的細(xì)小菌落；EMB上為紫色直徑為2～3 mm小菌落，不濕潤不透明，邊緣不規(guī)整，表面發(fā)干，輕微發(fā)皺。菌落在PCA平板上有光滑型菌落的特征（表面光滑發(fā)黏），經(jīng)莢膜染色證實(shí)為產(chǎn)莢膜菌（圖1B）。

圖1　2 個(gè)分離株的顯微照片F(xiàn)ig.1 Micrographs of two isolates

2.216S rRNA序列分析

圖2　MEGA 6.0用鄰近法基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree inferred by neighbor-joining method based on 16S rRNA gene sequences

如圖2所示，這次的污染菌是假單胞菌屬細(xì)菌（Pseudomonas spp.），與其相似度最高的主要有4 個(gè)種：P. veroni、P. extemaustralis、P. putida和P. flurescens。但是因?yàn)?6S rRNA序列的高度保守性，一般認(rèn)為16S rRNA序列分析只能準(zhǔn)確鑒定到屬，不適合鑒定到種。而假單胞菌屬是一個(gè)龐大的類群，廣泛分布于環(huán)境中，包括土壤、水、植物和動(dòng)物組織中。其中大部分是普通環(huán)境微生物，但也有條件致病菌如飲用天然礦泉水國標(biāo)中嚴(yán)禁檢出的銅綠假單胞菌，還有食品中常見的腐敗菌熒光假單胞菌，為評(píng)估其安全性，需要對(duì)該污染菌準(zhǔn)確鑒定到種。

2.3rpoB梯度PCR條件優(yōu)化

圖3　假單胞菌屬rpoB引物的梯度PCR結(jié)果Fig.3 Gradient PCR analysis with rpoB primes for Pseudomonas

為準(zhǔn)確鑒定到種，選用了rpoB序列作為靶序列，首先進(jìn)行了梯度PCR以優(yōu)化PCR條件。由圖3可知，假單胞菌屬的rpoB引物特異性很高，只有NMW27和NMW28兩株假單胞菌分離株出現(xiàn)了大小正確的產(chǎn)物，而Curbibacter屬的NMW22就沒有對(duì)應(yīng)大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，為獲得高質(zhì)量的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，退火溫度應(yīng)該取64 ℃。

2.4rpoB序列分析

圖4　MEGA 6.0用鄰近法基于rpoB基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree inferred by neighbor-joining method based on rpoB gene sequences

研究表明目前假單胞菌屬中至少有202 個(gè)種［9］，它們大體可以分為P. fluorescens、P. yringae、P. anguilliseptica、P. putida、P. straminea、P. oleovorans、P. aeruginosa和P. stutzeri 8 大群［10］。由圖4可知，分離株NMW3、 NMW27是P. extremaustralis種的細(xì)菌，在進(jìn)化樹上與條件致病菌銅綠假單胞群（P. aeruginosa）距離比較遠(yuǎn)，而與常見的耐低溫食品腐敗菌-熒光假單胞菌屬于同一個(gè)群P. fluorescens group。

2.5反接驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5　接種驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的味覺雷達(dá)圖Fig.5 Radar chart of taste analysis for inoculation test

將污染菌分離株NMW27反接到3 瓶正常水量中，空白實(shí)驗(yàn)證實(shí)該批次水量的細(xì)菌總數(shù)未檢出，30 ℃放置30 d，選5 個(gè)人做嗅覺評(píng)價(jià)，有4 人覺得反接的3 個(gè)量有難描述的刺激性異味，1 人未覺得有任何異常，做平板菌落計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌總數(shù)不小于103CFU/mL。取這3 瓶反接量品做電子舌檢測，觀察污染菌對(duì)水量味覺的影響。從圖5可知，污染菌給水量帶來的很細(xì)微的味覺變化，總體來說水中澀味、苦回味和澀回味都有所上升。

3　討 論

正常批次檢出污染菌NMW22為Curbibacter屬，該屬為革蘭氏陰性類弧菌或微彎曲的桿菌，（0.3～0.9） μm×（1.1～1.8） μm，是2004年新建的屬［11］。目前有4 個(gè)種C. gracilis、C. lanceolatu、C. delicatus和C. fontanus。C. lanceolatu是從Pseudomonas lanceolatu Leifson 1962變更而來，其模式株最初就分離自日本和溫哥華的蒸餾水。C. gracilis和C. delicatus的模式株都從井水中分離［11］。而C. fontana模式株也是從井水中分離的微需氧菌［12］。Silbaq［13］采用免培養(yǎng)的FISH技術(shù)證實(shí)β變形菌亞綱目伯克霍爾德目細(xì)菌是無氣天然礦泉水中能活躍繁殖的優(yōu)勢細(xì)菌種群。而Curbibacter屬正是隸屬于伯克霍爾德目。由此可推測該屬細(xì)菌是水（水源地）中細(xì)菌種群之一。NMW22可以推測污染源是水源地，而且該菌也能在天然礦泉水中生長，但未造成嗅覺或味覺的異常。

P. extremaustralis是2009年第1次報(bào)道的從南極短暫形成的湖泊中64°09’S、60°57’W分離出的一種非致病性新菌種，能產(chǎn)熒光色素，4～37 ℃生長，42 ℃不生長。菌落光滑、圓整、無色。以辛酸鈉為碳源時(shí)細(xì)胞內(nèi)會(huì)積累聚三羥基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，PHB）［14-15］。其抗逆能力和環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，目前研究已發(fā)現(xiàn)其能降解多種復(fù)雜化合物，厭氧生長、耐氧化和滲透壓壓力，耐低溫、耐熱等獨(dú)特能力，而且這些抗逆性推測與PHB的積累和生物膜形成能力有關(guān)聯(lián)［16-19］。我國蘭州大學(xué)團(tuán)隊(duì)也曾從烏魯木齊河源區(qū)高寒冰緣植物中分離到一株內(nèi)生適冷菌假單胞菌P. extremaustralis PF［20］。

從本次污染案例來看，該批次產(chǎn)品1月出廠檢測時(shí)細(xì)菌總數(shù)幾乎未檢出，可是1～2個(gè)月召回后發(fā)現(xiàn)近1/3產(chǎn)品細(xì)菌總數(shù)超標(biāo)，甚至達(dá)到103～105CFU/mL；另外2/3產(chǎn)品細(xì)菌總數(shù)正?；疚礄z出，可以推測該批次產(chǎn)品出廠時(shí)只偶然有微量污染菌存在，但是該污染菌能在1～2 個(gè)月內(nèi)快速增殖104以上，推測：經(jīng)檢測礦泉水瓶子密封性完好，僅有少量頂空空氣存在，可推測污染菌能厭氧或在極低氧壓的環(huán)境中生長繁殖；兩級(jí)串聯(lián)0.2 μm無菌過濾器的濾膜完整性測試結(jié)果正常，推測有少數(shù)極微細(xì)胞可以透過兩級(jí)串聯(lián)0.2 μm無菌過濾器；生產(chǎn)線紫外殺菌設(shè)備各項(xiàng)參數(shù)和運(yùn)行記錄正常，推測該菌可能具有耐紫外能力；產(chǎn)品無任何添加，且經(jīng)過8道過濾，其有機(jī)營養(yǎng)物含量極其低微，推測污染菌營養(yǎng)要求非常簡單；企業(yè)位于長白山地區(qū)，1月批次中出現(xiàn)該菌株污染，而且能在我國北方地區(qū)1～2 個(gè)月內(nèi)就能大幅增殖并導(dǎo)致產(chǎn)品變質(zhì)，推測污染菌能耐低溫。

該批次與之前和之后批次的不同是啟用了活性炭過濾器，啟用之前用RO水反復(fù)沖洗活性炭濾器長達(dá)36 h以達(dá)到活性炭濾器運(yùn)行的pH值的要求，而事后活性炭濾器出口水量確實(shí)出現(xiàn)大量類似P. extremaustralis的菌落，說明該細(xì)菌可能在活性炭濾器中富集增殖，給后續(xù)濾器和紫外殺菌機(jī)增加工作負(fù)荷。之前的研究［21-25］也多次證實(shí)活性炭多孔材料容易吸附多種微生物，有的甚至能在活性炭中繁殖。之所以該批次出現(xiàn)嚴(yán)重污染即可能是活性炭過濾器使用不當(dāng)，導(dǎo)致該細(xì)菌有機(jī)會(huì)在活性炭過濾器中吸附、大量富集和繁殖所致。

該企業(yè)污染的P. extremaustralis具有很強(qiáng)的抗逆性，有莢膜，具備生物膜形成能力，耐低溫、耐紫外殺菌，耐低氧壓，具有極微細(xì)胞能透過“無菌”過濾器，營養(yǎng)要求簡單，在瓶裝天然礦泉水中能生長，代謝產(chǎn)生亞硝酸鹽和硫醚類異味物質(zhì)，產(chǎn)生輕微澀味、苦回味和澀回味，對(duì)礦泉水企業(yè)危害很大。隨著我國礦泉水工業(yè)的發(fā)展，新技術(shù)和新工藝采用和改良，食品安全性得到重視和提高，但是也必須注意某些特殊微生物可能突破多種除菌屏障導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量問題，甚至是安全問題。

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Case Analysis of Contaminated Bottled Natural Mineral Water: Isolation and Phylogenetic Analysis of Contaminant Bacteria

GAO Wen1， HU Xiaomin2， ZHOU Guoping1，*
（1. School of Biology and Pharmaceutical Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China；2. Wuhan Institute of Virology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430071， China）

Objective: To figure out the cause of the occurrence of unpleasant odor in one batch of polyethylene terephthalate（PET） bottled natural mineral water. Methods: Firstly， we counted and isolated strains from the samples by membrane filtration and culture on plate count agar （PCA）. Secondly， the main spoilage bacteria were identified as Pseudomonas spp. by 16S rRNA analysis. Then gradient PCR was used to optimize the PCR conditions for amplification of rpoB gene. The PCR amplified rpoB sequence was analyzed. Results: The main pollutant bacteria in this batch of bottled drinking water was found to belong to a new species of P. extremaustralis， which was firstly isolated from a temporary pond in Antarctica in 2009. The rpoB sequence analysis showed that P. extremaustralis spp. was responsible for the occurrence of off-flavor in natural mineral water. When being inoculated back into normal products， it grew well and stink. Conclusion: Some strains of P. extremaustralis spp. have the capability of passing through double 0.2 μm-pore-size filters， tolerating ultraviolet sterilization， growing in PET bottled natural mineral water at low temperature and low oxygen content， and giving out an unpleasant odor.

PET bottled natural mineral water； Pseudomonas extremaustralis； odor； ultraviolet sterilization； two-step tandem filtration through 0.2 μm-pore-size filters

10.7506/spkx1002-6630-201608035

Q939.97

A

1002-6630（2016）08-0196-05

10.7506/spkx1002-6630-201608035. http://www.spkx.net.cn

10.7506/spkx1002-6630-201608035. http://www.spkx.net.cn

2015-07-17

中國科學(xué)院農(nóng)業(yè)與環(huán)境微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放研究項(xiàng)目（2015AEM001）

高雯（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸铩-mail：954215297@qq.com

周幗萍（1971—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锇踩-mail：wjczgp@163.com

引文格式：