超聲輔助萃取-高效液相色譜同時(shí)測(cè)定益母草中8 種有效成分

陳軍華，周光明，*，鄧永利，秦紅英，彭貴龍，高 意，陳定軍

（1.西南大學(xué) 發(fā)光與實(shí)時(shí)分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2.成都金建人民醫(yī)院藥劑科，四川 成都 610000）

超聲輔助萃取-高效液相色譜同時(shí)測(cè)定益母草中8 種有效成分

陳軍華1，周光明1，*，鄧永利1，秦紅英1，彭貴龍1，高 意1，陳定軍2

（1.西南大學(xué) 發(fā)光與實(shí)時(shí)分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2.成都金建人民醫(yī)院藥劑科，四川 成都 610000）

目的：建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定益母草中丁香酸、阿魏酸、蘆丁、大豆素、槲皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素8 種有效成分的方法。方法：采用InertSustain C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%乙酸溶液（B）；線性梯度洗脫；流速1.0 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)量量20 μL。結(jié)果：該條件下8 種成分的分離度良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 1（n=7）。加量回收率（n=3）平均值為89.93%～102.01%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.17%～3.11%。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，為藥用植物益母草的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

高效液相色譜；益母草；黃酮；有機(jī)酸；定量

陳軍華， 周光明， 鄧永利， 等. 超聲輔助萃取-高效液相色譜同時(shí)測(cè)定益母草中8 種有效成分［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（8）: 86-90. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608015. http://www.spkx.net.cn

CHEN Junhua， ZHOU Guangming， DENG Yongli， et al. Simultaneous determination of 8 active ingredients in Herba Leonuri by ultrasonic-assisted extraction coupled with high performance liquid chromatography［J］. Food Science， 2016，37（8）: 86-90. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608015. http://www.spkx.net.cn

益母草（Herba Leonuri）為唇形科植物（Leonurus japonicus Houtt）的新鮮或干燥地上部分，鮮品春季幼苗期至初夏花前期采摘；干品夏季莖葉茂盛、花未開(kāi)或初開(kāi)時(shí)采割，切斷曬干。其味辛、苦，性微寒，歸肝、心包、膀胱經(jīng)，具有利尿消腫、活血調(diào)經(jīng)的功效，用于治療瘡瘍腫毒、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)閉經(jīng)、惡露不盡、水腫尿少等疾病［1］。目前已從益母草中分離得到黃酮類、多肽類、二萜類、生物堿類、芳香族化合物等成分［2-7］。目前國(guó)內(nèi)外已有很多關(guān)于益母草的藥理和臨床應(yīng)用的報(bào)道，如相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)益母草在防治彌散性血管內(nèi)凝血、治療急性腦梗死、痛經(jīng)心肌缺血以及在婦產(chǎn)科中的應(yīng)用進(jìn)行了深入研究［8-12］；亦有報(bào)道［13］對(duì)益母草的種族藥理學(xué)、植物化學(xué)和藥物學(xué)進(jìn)行了歸納總結(jié)，并且指出益母草中含有丁香酸、阿魏酸、蘆丁、大豆素、槲皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素等達(dá)140多種化學(xué)物質(zhì)，其中的主要活性成分為生物堿、二萜類和黃酮類物質(zhì)。亦有很多研究表明益母草具有抗氧化、緩解細(xì)胞凋亡和心肌衰弱的功效［14-17］。但是，目前關(guān)于益母草中有效成分定量分析的報(bào)道并不多，少量文獻(xiàn)報(bào)道了益母草中水蘇堿和益母草堿的分離和測(cè)定［18-24］，而鮮見(jiàn)對(duì)其中有機(jī)酸和黃酮的定量分析，如翁愛(ài)彬等［25］用高效液相色譜法僅測(cè)定了益母草中的蘆丁和槲皮素，叢悅等［26］高效液相色譜法也僅測(cè)定了其中的丁香酸和蘆丁。本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助萃取前處理量品，具有操作簡(jiǎn)單、萃取效率高和適用性廣的優(yōu)點(diǎn)，另外超聲波萃取的工藝成本和能源消耗也較低。結(jié)合高效液相色譜法快速分離和測(cè)定了益母草中丁香酸、阿魏酸、蘆丁、大豆素、槲皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素8 種有效成分，為益母草藥材的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

益母草 市購(gòu)。丁香酸、阿魏酸、蘆丁、大豆素、槲皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素對(duì)照品（純度均不小于98.5%） 上海晶純實(shí)業(yè)有限公司；乙酸（分析純）、甲醇（色譜純） 重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠；二次蒸餾水 實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀（包括SPD-20A紫外檢測(cè)器、CTO-10AS柱溫箱、LC-20AT泵） 日本島津公司；KH-3200B型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；SZ-2自動(dòng)雙重純化水蒸餾器 上海瀘西分析儀器廠有限公司；XY型電熱恒溫干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FA2004A型分析天平 上海精天電子儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1供試品溶液的制備

精密稱取益母草干燥粉末（過(guò)60 目篩）0.1 g，置于具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入80%甲醇溶液8 mL，稱定質(zhì)量，超聲20 min（100 W，40 kHz），放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜止，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

1.3.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱定各對(duì)照品適量于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，分別配制成質(zhì)量濃度為500.0 μg/mL丁香酸、530.0 μg/mL阿魏酸、1 000.0 μg/mL蘆丁、500.0 μg/mL大豆素、500.0 μg/mL槲皮素、500.0 μg/mL橙皮素、490.0 μg/mL山柰酚和320.0 μg/mL芹菜素的對(duì)照品溶液。分別精密吸取丁香酸和蘆丁對(duì)照品溶液各2.0 mL，阿魏酸、大豆素、槲皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素對(duì)照品溶液各1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成混合對(duì)照品溶液，置于冰箱（4 ℃）內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3色譜條件

色譜柱：InertSustain C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇為流動(dòng)相A，0.1%乙酸溶液（pH 3.0）為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～5 min，45%～60% A；5～10 min，60%～60% A；10～15 min，60%～70% A；15～20 min，70%～45% A）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)量量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：285 nm；柱溫：35 ℃?；旌蠈?duì)照品和量品的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1　混合對(duì)照品（A）和樣品（B）色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard mixture （A） and sample （B）

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取1.3.2節(jié)的混合對(duì)照品溶液，以甲醇逐步稀釋為7 個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液按質(zhì)量濃度由低到高的順序，在1.3.3節(jié)的條件下依次進(jìn)量?jī)纱芜M(jìn)行分析。以對(duì)照品平均峰面積（mAU）為縱坐標(biāo)Y，質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)X作圖，并進(jìn)行線性回歸。8 種化合物的線性關(guān)系考察結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　8 種化合物的線性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 Calibration curve equations with linear ranges for 8 compounds

2　結(jié)果與分析

2.1提取條件的優(yōu)化

2.1.1流動(dòng)相的選擇

分別考察甲醇-水、乙腈-水、乙醇-水作為流動(dòng)相的分離效果，發(fā)現(xiàn)甲醇和水作為流動(dòng)相時(shí)能夠有效分離。當(dāng)甲醇-水（50∶50，V/V）等度洗脫時(shí)對(duì)照品能夠彼此分開(kāi)，但是山柰酚和芹菜素的保留時(shí)間太長(zhǎng)且峰形展寬，為了有效改善色譜峰展寬的現(xiàn)象同時(shí)是各成分達(dá)到完全分離，最終確定了1.3.3節(jié)中的梯度洗脫條件。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較了不同pH值的流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響，當(dāng)用pH 3的乙酸溶液代替純水時(shí)能有效改善色譜峰的前延和拖尾，故最終選擇甲醇和0.1%乙酸溶液（pH 3）作為流動(dòng)相。

2.1.2提取溶劑的選擇

在考察了乙醇、環(huán)己烷和甲醇作為提取溶劑后，發(fā)現(xiàn)甲醇作為萃取溶劑的提取量明顯高于另外兩種溶劑。用乙醇和環(huán)己烷作為提取溶劑，在進(jìn)量分析中可能與流動(dòng)相甲醇存在溶劑效應(yīng)導(dǎo)致了低的提取量，所以選擇甲醇作為提取溶劑。同時(shí)進(jìn)一步考察了不同比例的甲醇-水溶液對(duì)有效成分提取量的影響，依次考察20%、40%、60%、80%和100%的甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)有效成分提取的影響。20%和40%甲醇體積分?jǐn)?shù)提取溶劑可能與提取目標(biāo)物的極性相差太大使得提取率不高，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取量的影響Fig.2 Effect of methanol concentration on extraction efficiency

2.1.3超聲時(shí)間的影響

比較超聲提取10、20、30、40 min和50 min的提取量，超聲提取大于30 min時(shí)，部分有效成分的提取量逐漸減小，可能是過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間破壞了浸出的有效成分，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　超聲時(shí)間對(duì)提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasound radiation time on extraction efficiency

2.1.4超聲功率的影響

圖4　超聲功率對(duì)提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasound power on extraction efficiency

考察不同超聲提取功率對(duì)8 種有效成分提取量的影響，由圖4可知，功率由80 W增至120 W時(shí)，各成分的提取量逐漸增大；提取功率大于120 W時(shí)，各成分的提取量稍有降低，故選擇120 W超聲功率進(jìn)行后續(xù)的單因素試驗(yàn)。

2.1.5固液比和波長(zhǎng)的選擇

圖5　固液比對(duì)提取量的影響Fig.5 Effect of solid to liquid ratio on extraction efficiency

考察固液比為1∶20、1∶30、1∶50、1∶80和1∶100（g/mL）的提取效果，不同固液比對(duì)有效成分的提取量影響較大，或許是不同質(zhì)量濃度的量品提取液導(dǎo)致了有效成分的浸出率，結(jié)果見(jiàn)圖5。根據(jù)8 種有效成分的最大吸收波長(zhǎng)，綜合考慮含量較低成分的最大吸收強(qiáng)度，最終選擇285 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.6正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，選定甲醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、超聲時(shí)間和超聲功率4 個(gè)影響因素，各取3 個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)中根據(jù)8 種活性成分的提取總量來(lái)評(píng)價(jià)萃取性能。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果及直觀分析見(jiàn)表2。由極差R可知，各因素對(duì)8 種活性成分提取總量的影響程度依次為B＞A＞D＞C，即固液比是影響提取總量的主要因素，甲醇體積分?jǐn)?shù)和超聲功率次之，超聲時(shí)間的影響最小。比較k1、k2、k3的值可得提取8 種活性成分的最佳條件為A2B3C2D1，即甲醇體積分?jǐn)?shù)80%、固液比1∶80、超聲時(shí)間30 min、超聲功率100 W。

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with direct analysis of experimental results

2.2精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

混合對(duì)照品溶液在1.3.3節(jié)的條件下重復(fù)進(jìn)量6 次，測(cè)定各個(gè)對(duì)照品的峰面積，結(jié)果丁香酸、阿魏酸、蘆丁、大豆素、槲皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素對(duì)照品的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在0.63%～1.59%之間，表明儀器精密度良好。

2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用同一供試品溶液48 h內(nèi)每間隔6 h連續(xù)測(cè)定，結(jié)果8 種有效成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在1.01%～2.52%之間，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取同一批次益母草量品粉末5 份，按1.3.1節(jié)的步驟制備供試品溶液，進(jìn)量分析，計(jì)算得到8 種有效成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）在1.19%～1.66%之間，表明儀器重復(fù)性良好。

2.5量品的含量測(cè)定及回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按1.3.1節(jié)的步驟制備供試品溶液3 份，每份供試品溶液進(jìn)量分析3 次，根據(jù)線性方程測(cè)定量品含量，結(jié)果見(jiàn)表3。精密稱取9 份0.1 g同一批益母草量品，分為3 組，每組按低、中、高分別加入一定量的對(duì)照品溶液，然后按照供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理，每組重復(fù)進(jìn)量3 次，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。各成分加標(biāo)回收率平均值為89.93%～102.01%，結(jié)果令人滿意；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.17%～3.11%，表明該分離測(cè)定方法相當(dāng)穩(wěn)定。

表3　樣品含量測(cè)定及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)（n=3）Table 3 Results of determination of real samples and spiked recoveries （n= 3）

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜法結(jié)合紫外檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了益母草中丁香酸、阿魏酸、蘆丁、大豆素、槲皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素的分離及測(cè)定，取得了滿意的效果。采用超聲萃取前處理量品，方法簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)。分別考察了不同流動(dòng)相、甲醇體積分?jǐn)?shù)、萃取劑體積、超聲功率及時(shí)間對(duì)提取8 種有效成分的影響，為益母草藥材的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Simultaneous Determination of 8 Active Ingredients in Herba Leonuri by Ultrasonic-Assisted Extraction Coupled with High Performance Liquid Chromatography

CHEN Junhua1， ZHOU Guangming1，*， DENG Yongli1， QIN Hongying1， PENG Guilong1， GAO Yi1， CHEN Dingjun2
（1. Key Laboratory on Luminescence and Real-Time Analysis， Ministry of Education， Southwest University，Chongqing 400715， China； 2. Chengdu People's Hospital of Jinjian， Pharmacy Department， Chengdu 610000， China）

Objective: To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for the simultaneous determination of syringic acid， ferulic acid， rutin， daidzein， quercetin， quercetin， quercetin and quercetin in Herba Leonuri. Methods: The analytes were separated on an InertSustain C18（150 mm × 4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase consisted of methanol and 0.1% acetic acid （pH 3.0） with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min. The UV detection wavelength was set at 285 nm. The column temperature was maintained at 35 ℃. The injection volume was 20 μL. Results: The eight compounds were well separated， showing good linear correlations with correlation coefficient （r） ≥ 0.999 1 （n = 7）. The average recoveries were 89.93%-102.01%， with relative standard deviations （RSDs） between 1.17% and 3.11%. Conclusion: The method is simple， rapid and accurate， which can provide an experimental basis for quality control of Herba Leonuri.

high performance liquid chromatography （HPLC）； Herba Leonuri； flavonoids； organic acid； quantification

10.7506/spkx1002-6630-201608015

O657.72

A

1002-6630（2016）08-0086-05

2015-05-28

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（21277110）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（100030-2120130993）

陳軍華（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯V分析。E-mail：chenjunh999@163.com

周光明（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯V及其聯(lián)用技術(shù)。E-mail：gmzhou@swu.edu.cn

引文格式：