• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化脆江蘺多糖提取工藝及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用

    2016-11-14 11:19:50鞠瑤瑤曹純潔陳美珍葉天文
    食品科學(xué) 2016年8期
    關(guān)鍵詞:多糖誘導(dǎo)腫瘤

    鞠瑤瑤,曹純潔,陳美珍*,葉天文

    (汕頭大學(xué)理學(xué)院,廣東 汕頭 515063)

    響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化脆江蘺多糖提取工藝及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用

    鞠瑤瑤,曹純潔,陳美珍*,葉天文

    (汕頭大學(xué)理學(xué)院,廣東 汕頭 515063)

    目的:研究脆江蘺多糖(Gracilaria chouae polysaccharides,GLP)的提取方法及其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的影響。方法:響應(yīng)面法優(yōu)化GLP提取工藝條件;四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法檢測GLP對(duì)體外培養(yǎng)的人宮頸癌(HeLa)、食道癌(EC-109)、肝癌(HepG-2)以及乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞生長的影響。結(jié)果:GLP最佳提取條件為預(yù)熱溫度93.1 ℃、料液比1∶61.5(g/mL)、超聲時(shí)間35 min,在此條件下GLP提取率為16.75%。GLP在質(zhì)量濃度200~1 000 μg/mL范圍內(nèi)對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均有抑制作用,且呈劑量依賴關(guān)系。當(dāng)GLP質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí),其對(duì)HeLa、HepG-2、MCF-7和EC-109細(xì)胞的抑制率分別為49.11%、41.18%、34.98%和31.33%。對(duì)HeLa細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察以及Annexin V-FITC/PI熒光染色檢測發(fā)現(xiàn),隨著GLP給藥劑量的增加,凋亡和壞死細(xì)胞不斷增多。結(jié)論:GLP對(duì)體外培養(yǎng)的人HeLa、EC-109、HepG-2以及MCF-7等癌細(xì)胞增殖有抑制作用,并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

    脆江蘺多糖;提??;HeLa細(xì)胞;凋亡

    鞠瑤瑤, 曹純潔, 陳美珍, 等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化脆江蘺多糖提取工藝及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用[J]. 食品科學(xué), 2016,37(8): 57-62. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608010. http://www.spkx.net.cn

    JU Yaoyao, CAO Chunjie, CHEN Meizhen, et al. Optimization of extraction of polysaccharides from Gracilaria chouae and their inhibitory effects on tumor cells[J]. Food Science, 2016, 37(8): 57-62. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201608010. http://www.spkx.net.cn

    脆江蘺(Gracilaria chouae)屬于紅藻門(Rhodophyta)、真紅藻綱(Florideae)、杉藻目(Gigartinales)、江蘺科(Gracilariaceae)、江蘺屬(Gracilaria)[1],是一種新型的養(yǎng)殖海藻。目前,該海藻已在廣東省南澳沿海養(yǎng)殖成功并可大面積種植,多糖是其主要活性成分之一。關(guān)于海藻多糖提取的研究很多,傳統(tǒng)工藝有熱水浸提法和稀酸、稀堿浸提法等。新工藝包括酶法、超聲波輔助法、微波輔助浸提法、超濾法[2]等。其中熱水浸提法因其操作簡便、成本低廉等特點(diǎn)而被廣泛使用。研究發(fā)現(xiàn)江蘺屬的龍須菜多糖具有多種生物活性,如Fan Yanli等[3]研究發(fā)現(xiàn)龍須菜酸性多糖可以有效抑制H22肝癌細(xì)胞的生長,陳美珍等[4]對(duì)龍須菜多糖研究表明龍須菜多糖具有抗腫瘤、抗氧化等生理活性。然而,國內(nèi)外對(duì)江蘺屬脆江蘺的研究報(bào)道主要集中在品種的改良、栽培等方面,對(duì)其多糖的提取及生理活性的研究報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)脆江蘺多糖(Gracilaria chouae polysaccharides,GLP)的提取及體外抗腫瘤活性展開研究,以期為GLP的加工以及利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1材料與試劑

    脆江蘺 廣東省汕頭大學(xué)南澳實(shí)驗(yàn)站。

    人宮頸癌HeLa細(xì)胞株 汕頭大學(xué)多學(xué)科中心;食道癌細(xì)胞(EC-109)、肝癌細(xì)胞(HepG-2)、乳腺癌細(xì)胞(MCF-7) 溫州醫(yī)學(xué)院。

    半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品藥品檢定研究院;牛血清白蛋白(分析純) 美國Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基 美國Hyclone公司;胎牛血清 杭州四季青科技有限公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO) 美國Amresco公司;陽性藥物5-氟尿嘧啶(5-FU) 上海源葉生物科技有限公司;胰酶細(xì)胞消化液、青霉素-鏈霉素溶液、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡與壞死檢測試劑盒碧云天生物技術(shù)研究所。

    1.2儀器與設(shè)備

    高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;NJL07-5超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 南京杰全微波設(shè)備有限公司;HH-2型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;Universal 320R臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國Hettich公司;低溫冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器有限公司;3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱美國Thermo公司;CK30倒置顯微鏡 日本Olympus公司;倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司;-65 ℃超低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司;全波段掃描酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

    1.3方法

    1.3.1GLP的提取工藝流程

    脆江蘺洗凈、烘干→粉碎過40 目篩→脆江蘺干粉→加水溶解→預(yù)熱→超聲提取→提取液離心→減壓濃縮→無水乙醇沉淀2次→冷凍干燥→粗多糖

    取適量粗多糖溶液,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶液至終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到4%以除蛋白,4 ℃放置過夜,離心,NaOH中和上清多糖溶液。單蒸水、雙蒸水各透析36 h,濃縮透析液,冷凍干燥后得精多糖(GLP)。

    1.3.2GLP含量的測定

    采用改良的苯酚-硫酸比色法[5-6]。以半乳糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,試劑的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制等參照文獻(xiàn)[5-6]進(jìn)行。經(jīng)測定得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.005 1X-0.013 8(Y為吸光度,X為多糖含量),相關(guān)系數(shù)R2=0.995。將多糖溶液適當(dāng)稀釋后,測其吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算其多糖含量。

    1.3.3GLP提取工藝單因素試驗(yàn)

    分別以預(yù)熱溫度、料液比、超聲時(shí)間為單因素進(jìn)行試驗(yàn),考察各因素對(duì)GLP提取率的影響,計(jì)算如式(1)所示:

    1.3.4響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取預(yù)熱溫度、料液比、超聲時(shí)間3 個(gè)因素作為Box-Behnken設(shè)計(jì)的自變量,GLP提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化組合,因素與水平設(shè)計(jì)見表1。試驗(yàn)結(jié)果用Minitab軟件進(jìn)行分析。

    表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Coded levels for dependent variables used in Box-Behnken design

    1.3.5GLP對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生長的影響

    MTT法檢測多糖對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用[7-8]。取對(duì)數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞,調(diào)成細(xì)胞數(shù)量濃度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,100 μL/孔接種于96 孔板,18 h后換液,按終質(zhì)量濃度200、400、600、800、1 000 μg/mL分別加入GLP作用液,陰性對(duì)照組用等量的完全培養(yǎng)基代替,48 h后,移除上清液加入MTT孵育4 h,吸出MTT,加入DMSO,振蕩混勻。酶標(biāo)儀作雙波長檢測,檢測波長490 nm,參考波長570 nm,計(jì)算GLP對(duì)HeLa細(xì)胞的生長抑制率。抑制率計(jì)算如式(2)所示:

    式中:A0為陰性對(duì)照組吸光度;A1為給藥組吸光度。

    1.3.6HeLa細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

    不同質(zhì)量濃度的GLP作用液(200、400、600、800、1 000 μg/mL)處理HeLa細(xì)胞48 h,陰性對(duì)照組用等量的完全培養(yǎng)基代替,于倒置顯微鏡下觀察HeLa細(xì)胞的形態(tài)變化。

    1.3.7Annexin V-FITC/PI熒光染色檢測細(xì)胞凋亡

    采用上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的細(xì)胞凋亡Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒。檢測方法按照試劑盒說明書進(jìn)行,并于倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

    1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。用單因素方差分析組間差異的顯著性,結(jié)果采用±s表示,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1GLP提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1料液比對(duì)GLP提取率的影響

    圖1 料液比對(duì)GLP提取率的影響Fig.1 Effect of water to material ratio on the yield of polysaccharides

    將脆江蘺粉按1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80(g/mL)比例加水,預(yù)熱至80 ℃,在超聲波功率200 W條件下提取30 min,測定GLP提取率,結(jié)果如圖1所示。隨著溶劑體積的不斷增大,GLP提取率明顯提高,原因可能是超聲波將堅(jiān)硬的細(xì)胞壁破碎,而增加溶劑的比例,可有效降低溶液的黏度,提高質(zhì)量濃度差,有利于多糖分子的傳質(zhì)擴(kuò)散。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,確定GLP超聲提取的料液比1∶60為宜。

    2.1.2超聲時(shí)間對(duì)GLP提取率的影響

    將脆江蘺粉加水(料液比1∶60),預(yù)熱至80 ℃,在超聲波功率200 W條件下分別提取25、30、35、40、45 min,計(jì)算GLP提取率,結(jié)果如圖2所示。隨著超聲時(shí)間的延長,GLP提取率提高,當(dāng)超聲時(shí)間超過35 min后GLP提取率反而下降。原因可能是超聲波強(qiáng)有力的機(jī)械剪切長時(shí)間的作用使植物組織中大量的細(xì)胞破裂,細(xì)胞內(nèi)大量不溶物及黏性物質(zhì)等混入到提取液中,導(dǎo)致溶液中雜質(zhì)增多,黏度增大,影響了多糖成分的溶出;另一方面隨著超聲時(shí)間的延長,超聲波較強(qiáng)的空化作用使部分多糖分子鏈斷裂,小分子的糖在醇沉處理過程中損失掉,從而降低了GLP提取率[9]。由此可確定超聲時(shí)間以35 min為佳。

    2.1.3預(yù)熱溫度對(duì)GLP提取率的影響

    圖3 預(yù)熱溫度對(duì)GLP提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides

    分別準(zhǔn)確稱取脆江蘺干粉10 g,在料液比1∶60、超聲時(shí)間30 min條件下,考察將料液預(yù)熱至不同溫度對(duì)GLP提取率的影響,結(jié)果見圖3。當(dāng)料液預(yù)熱溫度為90 ℃時(shí),GLP提取率達(dá)最大值,繼續(xù)升高預(yù)熱溫度,GLP提取率反而呈下降趨勢,可能是由于溫度過高溶出大量的雜質(zhì),導(dǎo)致溶液的黏度變大,GLP難以溶出,提取率下降。所以選擇90 ℃作為最佳預(yù)熱溫度。

    2.2GLP提取工藝條件優(yōu)化結(jié)果

    應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),以預(yù)熱溫度、料液比、超聲時(shí)間作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素,GLP提取率為響應(yīng)值,應(yīng)用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法優(yōu)化GLP的提取工藝條件,試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

    對(duì)所得數(shù)據(jù)采用Minitab進(jìn)行回歸分析。如表3、4所示,該模型回歸極顯著(P<0.01),失量項(xiàng)(P=0.103>0.05)不顯著,表明二次多項(xiàng)式回歸模型可靠;R2=94.63%,表明方程對(duì)試驗(yàn)量合度較好,因此該模型可用于預(yù)測響應(yīng)值的實(shí)際情況。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果建立的數(shù)學(xué)模型為:Y=16.576 7+1.395 0A+0.117 5B+ 0.527 5C-2.390 8A2-3.145 8B2-2.330 8C2+0.015 0AB+ 0.510 0AC-0.200 0BC。試驗(yàn)號(hào)A預(yù)熱溫度B料液比C超聲時(shí)間Y GLP提取率/%

    表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

    表3 方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression equation

    表4 回歸方程系數(shù)檢驗(yàn)Table 4 Significance test of all coefficients in the regression model

    圖4 各因素交互作用對(duì)GLP提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.4 Three-dimensional response surface and contour plots for the interactive effects of operating parameterson the extraction yield of GLP

    根據(jù)回歸分析結(jié)果作響應(yīng)面圖,如圖4所示,由等高線圖可知,AC交互作用顯著(等高線圖呈橢圓形),結(jié)合表4可知AB及BC交互作用不顯著(等高線圖呈圓形)[10-12];由曲面圖可知,3 種因素對(duì)GLP提取率的影響均呈拋物線型,表明3 種因素均存在最優(yōu)值,且都在中心點(diǎn)附近,即預(yù)熱溫度90 ℃左右、料液比1∶60附近、超聲時(shí)間35 min左右。

    綜合響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果,得GLP最佳提取工藝條件為預(yù)熱溫度93.1 ℃、料液比1∶61.5、超聲時(shí)間35 min。在此最佳工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),所得GLP提取率平均值為16.75%,與模型所得理論值16.78%相近,偏差較小,表明回歸模型可靠,可用于GLP的提取。

    2.3GLP對(duì)腫瘤細(xì)胞體外生長的影響

    表5 GLP對(duì)HeLa、HepG-2、MCF-7和EC-109細(xì)胞生長的抑制作用Table 5 Inhibitory effects of GLP on HeLa, HepG-2, MCF-7 and EC-109 cells

    由表5可見,GLP對(duì)體外培養(yǎng)的4 種腫瘤細(xì)胞均具有顯著的抑制作用,并在200~1 000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。當(dāng)劑量為1 000 μg/mL作用48 h時(shí),其抑制率分別達(dá)到49.11%、41.18%、34.98%、31.33%。結(jié)果表明,GLP對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用具有差異性,其中對(duì)HeLa細(xì)胞的生長抑制作用最強(qiáng)。因此,選取HeLa細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

    圖5 GLP處理48 h后HeLa細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察(10×20)Fig.5 Morphological observation of HeLa cells treated with GLP for 48 h (10 × 20)

    2.4GLP對(duì)HeLa細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響由圖5可見,陰性對(duì)照組細(xì)胞排列較緊密,體積較大,呈多邊形,細(xì)胞邊緣光滑,有少量漂浮細(xì)胞;而給藥各組隨著GLP質(zhì)量濃度的增大,細(xì)胞由貼壁逐漸脫落懸浮,貼壁細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞排列疏松,體積小,呈長梭形或死亡呈圓形,折光率增強(qiáng),細(xì)胞膜完整但有發(fā)泡現(xiàn)象,且有不規(guī)則突起。部分細(xì)胞脫離周圍細(xì)胞,變圓,形態(tài)學(xué)上呈細(xì)胞凋亡狀態(tài)[13-14],實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GLP可能通過誘導(dǎo)HeLa凋亡,從而抑制HeLa細(xì)胞增殖。

    2.5Annexin V-FITC/PI熒光染色檢測細(xì)胞凋亡

    圖6 GLP處理HeLa細(xì)胞48 h后的Annexin V-FITC/PI雙熒光檢測照片(10×20)Fig.6 Annexin V-FITC/PI fluorescence pictures of HeLa cells treated with GLP for 48 h (10 × 20)

    不同質(zhì)量濃度的GLP對(duì)HeLa細(xì)胞處理48 h,用Annexin V-FITC/PI雙熒光染色法檢測GLP誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的能力,結(jié)果如圖6所示。GLP作用48 h后,隨著給藥劑量的增加,呈紅色熒光的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,說明GLP作用后HeLa細(xì)胞凋亡率隨藥物質(zhì)量濃度增加而升高[15-16],且具有劑量依賴性,進(jìn)一步證實(shí)GLP通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

    3 討 論

    傳統(tǒng)多糖提取方法存在提取時(shí)間長、提取率偏低的缺陷。孟慶勇等[17]采用熱水浸提法提取GLP,結(jié)果在料液比1∶30、浸提溫度70 ℃的條件下水提10 h,其多糖提取率達(dá)到14.98%。本研究在優(yōu)化的GLP提取工藝條件下,即預(yù)熱溫度93.1 ℃、料液比1∶61.5、超聲時(shí)間35 min,GLP提取率可達(dá)16.75%,說明超聲波處理可有效提高GLP溶出。

    隨著人們對(duì)分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)認(rèn)識(shí)的不斷深入,細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生中所起的作用日益受到矚目,已成為當(dāng)前腫瘤研究中的熱點(diǎn)。國內(nèi)外眾多研究表明,多糖類化合物具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。如謝好貴等[18]發(fā)現(xiàn),將紫菜多糖、龍須菜多糖和雞腿菇多糖按一定比例復(fù)合后,該復(fù)合多糖具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,能顯著誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。景艷等[19]研究發(fā)現(xiàn),在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(2、4、6 mg/mL)花蛇舌草多糖(PEHD)能夠明顯抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞的增殖,其抑制作用與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究表明,體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞HeLa經(jīng)不同劑量的GLP處理48 h后,倒置光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞凋亡的特征性改變,經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙熒光染色后,發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞數(shù)量減少,凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)量明顯增多,證明了GLP可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。

    然而細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象,是由多基因嚴(yán)格控制的過程,具有極其復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制。研究表明,許多活性多糖可通過重建腫瘤細(xì)胞的凋亡信號(hào)傳遞系統(tǒng),幫助機(jī)體及時(shí)地清除過多受損的細(xì)胞,進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤的作用。Kwon等[20]研究發(fā)現(xiàn)一種水溶性海藻多糖可以通過胰島素量受體信號(hào)和PI3K/Akt通路作用,激活胃癌細(xì)胞中caspase-3,降低Bcl-2基因的表達(dá),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而抑制細(xì)胞增殖,達(dá)到抗腫瘤的目的。此外,還有眾多研究發(fā)現(xiàn)多糖可將腫瘤細(xì)胞周期阻滯于不同時(shí)期,從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[21-25]。GLP作為一種天然提取物,其成分復(fù)雜,本研究只是發(fā)現(xiàn)GLP具備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,對(duì)于其是否通過上述途徑或其他途徑或通道誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,尚待進(jìn)一步深入研究。

    [1] 夏邦美. 中國海藻志[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1999: 41-42.

    [2] 朱曉霞, 羅學(xué)剛. 多糖提取與純化技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展[J]. 食品研究與開發(fā), 2007, 28(3): 186-189. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2007.03.056.

    [3] FAN Yanli, WANG Wenhang, SONG Wei, et al. Partial characterization and anti-tumor activity of an acidic polysaccharide from Gracilaria lemaneiformis[J]. Carbohydrate Polymers, 2012, 88(4): 1313-1318. DOI:10.1016/j.carbpol.2012.02.014.

    [4] 陳美珍, 余杰, 廖灶輝, 等. 龍須菜多糖抑瘤活性及對(duì)荷瘤小鼠抗氧化作用的研究[J]. 中國海洋藥物, 2008, 27(2): 46-49. DOI:10.3969/ j.issn.1002-3461.2008.02.011.

    [5] 王文平, 郭祀遠(yuǎn), 李琳, 等. 苯酚-硫酸法測定野木瓜中多糖含量的研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(4): 276-279. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2007.04.065.

    [6] 周小偉, 鐘瑞敏. 紫菜多糖提取工藝技術(shù)及抗氧化活性研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2014, 35(19): 43-47. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2014.19.012.

    [7] GRELA E, ZABEK A, GRABOWIECKA A. Interferences in the optimization of the MTT assay for viability estimation of Proteus mirabilis[J]. Avicenna Journal of Med Biotechnol, 2015, 7(4): 159-167.

    [8] BANK U, REINHOLA D, ANSORGE S. Measurement of cellular activity with the MTT test. Optimization of the method[J]. Allergie und Immunologie, 1991, 37(3/4): 119-123.

    [9] 王永良, 范賢, 李玉蘭, 等. 超聲輔助提取異枝麒麟菜硫酸酯多糖的工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(6): 6-10.

    [10] 劉玉芬, 夏海濤, 徐芹喜. 海英菜多糖提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化及其體外抗氧化作用[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(20): 138-143.

    [11] CAPEK P, MACHOBA E, TURIAN J. Scavenging and antioxidant actibities of immunomodulating polysaccharids isolated form Salvia officinalis L.[J]. International of Biological Macromolecules, 2009,44(1): 75-80. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2008.10.007.

    [12] 楊斌, 楊英, 王雪飛, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)刺頭多糖除蛋白工藝的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(10): 287-291. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2014.10.055.

    [13] KUNG A L, ZETTERBERG A, SHERWOOD S W, et al. Cytotoxiceffects of cell cycle phase specific agent: result of cell cycleperturbation[J]. Cancer Research, 1990, 50(22): 7307-7317.

    [14] ZHAO T, ZHANG J, GUO X L. Microwave-assisted extraction,chemical characterization of polysaccharides from Lilium davidii var. unicolor Salisb and its antioxidant activities evaluation[J]. Food Hydrocolloids, 2013, 31: 346-356. DOI:10.1016/ j.foodhyd.2012.11.021.

    [15] 張偉, 梁智輝. Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記與Hoechst33342/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的比較[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2014,30(11): 1209-1212.

    [16] CHEN S, CHENG A C, WANG M S. Detection of apoptosis induced by new type gosling viral enteritis virus in vitro through fluorescein annexin V-FITC/PI double labeling[J]. World Journal of Gastroenterol,2008, 14(14): 2174-2178. DOI:10.3748/wjg.14.2174.

    [17] 孟慶勇, 王亞飛, 揭新明, 等. 粗江蘺多糖的提取及光譜分析[J].光譜學(xué)與光譜分析, 2006, 26(10): 1903-1906. DOI:10.3321/j.is sn:1000-0593.2006.10.032.

    [18] 謝好貴, 韋明釬, 陳美珍, 等. 3 種多糖復(fù)合體外抗腫瘤協(xié)同增效作用[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(15): 289-294. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201315060.

    [19] 景艷, 康敏, 劉津, 等. 白花蛇舌草多糖誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究[J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科, 2015, 29(7): 641-644. DOI:10.13201/j.issn.1001-1781.2015.07.017.

    [20] KWON M J, NAM T J. A polysaccharide of the marine alga Capsosiphon fulvescens induces apoptosis in AGS gastric cancer cells via an IGF-IR-mediated PI3K/Akt pathway[J]. Cell Biology International,2007, 31(8): 768-775. DOI:10.1016/j.cellbi.2007.01.010.

    [21] 謝好貴, 陳美珍, 張玉強(qiáng). 多糖抗腫瘤構(gòu)效關(guān)系及其機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(11): 329-333. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201315060.

    [22] SARANGI I, GHOSH D, BHUTIA S K, et al. Anti-tumor and immunomodulating effects of Pleurotus ostreatus mycelia-derived proteoglycans[J]. International Immunopharmacology, 2006, 6(8): 1287-1297. DOI:10.1016/j.intimp.2006.04.002.

    [23] LEE C L, YANG X T, WAN J M F. The culture duration affects the immunomodulatory and anticancer effect of polysaccharopeptide derived from Coriolus versicolor[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 38(1/2): 14-21. DOI:10.1016/ j.enzmictec.2004.10.009.

    [24] ZHANG M, CHEUNG P C K, CHIU L C M, et al. Cell-cycle arrest and apoptosis induction in human breast carcinoma MCF-7 cells by carboxymethylated β-glucan from the mushroom sclerotia of Pleurotus tuber-regium[J]. Carbohydrate Polymers, 2006, 66(4): 455-462. DOI:10.1016/j.carbpol.2006.03.031.

    [25] 游如旭, 張玉, 汪柳, 等. 香菇多糖誘導(dǎo)鼠肝癌H22細(xì)胞凋亡機(jī)制的初步探討[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2015, 35(9): 776-781. DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2015.09.04.

    Optimization of Extraction of Polysaccharides from Gracilaria chouae and Their Inhibitory Effects on Tumor Cells

    JU Yaoyao, CAO Chunjie, CHEN Meizhen*, YE Tianwen
    (College of Science, Shantou University, Shantou 515063, China)

    Objective: To optimize the extraction of polysaccharides from Gracilaria chouae (GLP) and to investigate their inhibitory effects on tumor cells. Methods: Response surface methodology was used to optimize the extraction process for GLP. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was used to determine the effects of GLP on the proliferation of HeLa, EC-109,HepG-2 and MCF-7 cells. Results: The optimal extraction conditions were determined as follows: temperature, 93.1 ℃;material-to-liquid ratio, 1:61.5 (g/mL); and ultrasonification time, 35 min. Under these conditions, the maximum yield of polysaccharides of 16.75% was obtained. GLP revealed anti-proliferation effect on HeLa, EC-109, HepG-2 and MCF-7 cells in a dose-dependent manner in the range of 200-1 000 μg/mL. When the concentration was up to 1 000 μg/mL, the percentage growth inhibition of the above four cells were 49.11%, 41.18%, 34.98% and 31.33% respectively. With increasing GLP dose over a certain range, the numbers of apoptotic and necrotic cells increased, as revealed by cell morphology observation and Annexin V-FITC/PI fluorescence double staining detection. Conclusions: GLP could induce apoptosis of cancer cells.

    Gracilaria chouae polysaccharides (GLP); extraction; HeLa cell; apoptosis

    10.7506/spkx1002-6630-201608010

    R931

    A

    1002-6630(2016)08-0057-06

    2015-07-05

    廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B0203012005);2013年汕頭大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心項(xiàng)目(生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心);2013年廣東省高等學(xué)校教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程本科類立項(xiàng)建設(shè)項(xiàng)目(汕頭大學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心)

    鞠瑤瑤(1989—),女,碩士研究生,主要從事生物活性物質(zhì)研究與開發(fā)。E-mail:12yyju@stu.edu.cn

    陳美珍(1956—),女,教授,本科,主要從事生物活性物質(zhì)研究與開發(fā)。E-mail:chenmz@stu.edu.cn

    引文格式:

    猜你喜歡
    多糖誘導(dǎo)腫瘤
    齊次核誘導(dǎo)的p進(jìn)制積分算子及其應(yīng)用
    與腫瘤“和平相處”——帶瘤生存
    中老年保健(2021年4期)2021-08-22 07:08:06
    同角三角函數(shù)關(guān)系及誘導(dǎo)公式
    米胚多糖的組成及抗氧化性研究
    熟三七多糖提取工藝的優(yōu)化
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:45
    續(xù)斷水提液誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的凋亡
    中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:52
    大型誘導(dǎo)標(biāo)在隧道夜間照明中的應(yīng)用
    ceRNA與腫瘤
    床旁無導(dǎo)航穿刺確診巨大上縱隔腫瘤1例
    《腫瘤預(yù)防與治療》2015年征訂啟事
    欧美不卡视频在线免费观看| 我要看日韩黄色一级片| 日韩av不卡免费在线播放| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品野战在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲无线在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 日韩亚洲欧美综合| 老司机福利观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品一区二区在线观看99 | 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲精品日韩av片在线观看| 精品国产三级普通话版| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产三级在线视频| www日本黄色视频网| 亚洲av男天堂| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久久九九精品影院| 哪里可以看免费的av片| 色吧在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲真实伦在线观看| 欧美精品一区二区大全| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 美女被艹到高潮喷水动态| 九九爱精品视频在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 成人无遮挡网站| 一区二区三区免费毛片| 日韩欧美精品免费久久| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲18禁久久av| 最新中文字幕久久久久| 亚洲中文字幕日韩| 婷婷亚洲欧美| 午夜久久久久精精品| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美极品一区二区三区四区| 极品教师在线视频| 亚洲国产精品国产精品| 国产探花在线观看一区二区| 免费av观看视频| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 久久国产乱子免费精品| 一区福利在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| АⅤ资源中文在线天堂| 一级毛片电影观看 | 国产精品.久久久| 久久久久久久久久成人| 女同久久另类99精品国产91| 一区二区三区高清视频在线| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美日韩在线观看h| 少妇的逼好多水| 好男人视频免费观看在线| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲第一电影网av| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲五月天丁香| 一边摸一边抽搐一进一小说| 天天躁日日操中文字幕| 久久久久久大精品| 26uuu在线亚洲综合色| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久精品人妻少妇| 91精品国产九色| 欧美另类亚洲清纯唯美| av在线播放精品| 观看美女的网站| 亚洲七黄色美女视频| av视频在线观看入口| 亚洲欧洲日产国产| 五月伊人婷婷丁香| 91久久精品电影网| 国产一级毛片七仙女欲春2| 99热6这里只有精品| 99riav亚洲国产免费| 美女cb高潮喷水在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲不卡免费看| 极品教师在线视频| 亚洲av成人精品一区久久| 日韩在线高清观看一区二区三区| 91狼人影院| 亚洲av二区三区四区| 午夜福利高清视频| 国产真实伦视频高清在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| АⅤ资源中文在线天堂| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美日本视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 亚洲人成网站在线播| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 在现免费观看毛片| 国产精品不卡视频一区二区| 日韩中字成人| 日本欧美国产在线视频| 亚洲成av人片在线播放无| 91aial.com中文字幕在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 精品日产1卡2卡| 婷婷精品国产亚洲av| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 国产中年淑女户外野战色| 91精品一卡2卡3卡4卡| 少妇人妻一区二区三区视频| 免费搜索国产男女视频| 国产色婷婷99| 国产精品福利在线免费观看| 能在线免费看毛片的网站| 精品久久久久久久久久免费视频| 22中文网久久字幕| 一区二区三区四区激情视频 | 久久精品综合一区二区三区| 成年免费大片在线观看| 日本成人三级电影网站| 国产黄a三级三级三级人| 美女 人体艺术 gogo| 国产成人一区二区在线| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 丝袜喷水一区| 2022亚洲国产成人精品| 好男人视频免费观看在线| 精品久久久噜噜| 亚洲精品亚洲一区二区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产综合懂色| 只有这里有精品99| 性色avwww在线观看| 欧美潮喷喷水| 最新中文字幕久久久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲,欧美,日韩| 久久亚洲精品不卡| 三级毛片av免费| 亚洲在久久综合| 婷婷六月久久综合丁香| av女优亚洲男人天堂| 中国美白少妇内射xxxbb| 成人国产麻豆网| 一本一本综合久久| 日本熟妇午夜| 亚洲av成人av| 99热这里只有精品一区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 一边亲一边摸免费视频| 嘟嘟电影网在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 波多野结衣高清作品| 日韩一区二区三区影片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 欧美人与善性xxx| 我要看日韩黄色一级片| 欧美激情在线99| 中国美女看黄片| 熟女人妻精品中文字幕| 99久国产av精品| 乱码一卡2卡4卡精品| 天堂中文最新版在线下载 | 亚洲美女视频黄频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 级片在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 好男人在线观看高清免费视频| 一本精品99久久精品77| 国产一级毛片七仙女欲春2| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产成人91sexporn| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲欧美清纯卡通| 国产69精品久久久久777片| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 99热这里只有是精品在线观看| 伦理电影大哥的女人| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲一区高清亚洲精品| av在线蜜桃| 一个人免费在线观看电影| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 国产激情偷乱视频一区二区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美不卡视频在线免费观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 别揉我奶头 嗯啊视频| 欧美精品一区二区大全| 在线观看午夜福利视频| 搞女人的毛片| 久久久久久久午夜电影| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美最新免费一区二区三区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 久久久午夜欧美精品| 欧美成人一区二区免费高清观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产精品永久免费网站| av免费观看日本| 国产精品嫩草影院av在线观看| 日韩国内少妇激情av| 久久精品影院6| 嘟嘟电影网在线观看| 不卡一级毛片| 一区二区三区免费毛片| 国产在线免费精品| 丰满迷人的少妇在线观看| 日本91视频免费播放| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 一本大道久久a久久精品| 国产成人一区二区在线| 精品久久久久久久久av| 97在线人人人人妻| 美女主播在线视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 免费观看在线日韩| 99九九在线精品视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久久久久久久大av| 久久久精品区二区三区| 两个人的视频大全免费| 婷婷色综合www| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产成人精品婷婷| 久久精品国产a三级三级三级| 免费高清在线观看视频在线观看| 99九九在线精品视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产高清不卡午夜福利| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产成人a∨麻豆精品| 久久久a久久爽久久v久久| 中文欧美无线码| 我要看黄色一级片免费的| 一个人看视频在线观看www免费| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产69精品久久久久777片| 全区人妻精品视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久久欧美国产精品| 日本vs欧美在线观看视频| 韩国av在线不卡| 国产av码专区亚洲av| 国产精品女同一区二区软件| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产av码专区亚洲av| 草草在线视频免费看| 日日摸夜夜添夜夜爱| av黄色大香蕉| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产成人精品婷婷| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产成人a∨麻豆精品| 韩国av在线不卡| 亚洲国产精品国产精品| .国产精品久久| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久 成人 亚洲| 国产乱人偷精品视频| 欧美日韩在线观看h| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲,欧美,日韩| 色哟哟·www| av在线老鸭窝| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲人成网站在线播| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲五月色婷婷综合| 久久99一区二区三区| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲人成网站在线观看播放| 中文欧美无线码| 久久97久久精品| 老熟女久久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 各种免费的搞黄视频| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产av精品麻豆| 有码 亚洲区| 国产精品蜜桃在线观看| 永久网站在线| 丰满迷人的少妇在线观看| 高清毛片免费看| 亚洲第一区二区三区不卡| 一级毛片电影观看| 欧美成人午夜免费资源| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲国产av影院在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 91精品国产九色| 少妇高潮的动态图| 国产一区二区在线观看av| 一区二区三区乱码不卡18| kizo精华| 日韩制服骚丝袜av| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久久久久久久久人人人人人人| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 99久久精品国产国产毛片| 国产色婷婷99| freevideosex欧美| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 午夜av观看不卡| 国内精品宾馆在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲在久久综合| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 男男h啪啪无遮挡| 国产日韩欧美在线精品| 2022亚洲国产成人精品| 色视频在线一区二区三区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 各种免费的搞黄视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久久久久人妻| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲国产色片| 久久女婷五月综合色啪小说| √禁漫天堂资源中文www| 欧美97在线视频| 亚洲精品乱久久久久久| 成人综合一区亚洲| 亚洲内射少妇av| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 日日啪夜夜爽| 成人国产av品久久久| 亚洲怡红院男人天堂| 99热这里只有精品一区| 日本vs欧美在线观看视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲欧洲国产日韩| av线在线观看网站| 亚洲av.av天堂| 乱码一卡2卡4卡精品| 成人国产av品久久久| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 日韩亚洲欧美综合| 久久免费观看电影| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久99精品国语久久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 丰满乱子伦码专区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 视频中文字幕在线观看| 国产欧美亚洲国产| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国内精品宾馆在线| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产69精品久久久久777片| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲精品456在线播放app| 欧美日韩视频精品一区| 三上悠亚av全集在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 国产日韩欧美亚洲二区| 日韩三级伦理在线观看| 久久这里有精品视频免费| 男女国产视频网站| 亚洲在久久综合| 一区二区三区四区激情视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 婷婷色综合www| 三级国产精品欧美在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美精品一区二区免费开放| 自线自在国产av| 99热网站在线观看| 午夜影院在线不卡| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 精品久久久久久电影网| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产精品免费大片| 国产不卡av网站在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 国产在线视频一区二区| av国产久精品久网站免费入址| 日本免费在线观看一区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲性久久影院| 搡老乐熟女国产| 99国产精品免费福利视频| 午夜免费鲁丝| 免费av不卡在线播放| 一级毛片我不卡| 亚洲久久久国产精品| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美97在线视频| 国产精品久久久久久久久免| 熟女电影av网| 国产成人av激情在线播放 | 亚洲精品美女久久av网站| 精品久久国产蜜桃| 国产乱人偷精品视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久人人爽人人片av| 22中文网久久字幕| 亚洲四区av| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| kizo精华| 91精品国产国语对白视频| 人体艺术视频欧美日本| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲天堂av无毛| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲av成人精品一二三区| 国产色爽女视频免费观看| 色哟哟·www| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 九九在线视频观看精品| 亚洲人与动物交配视频| 国产熟女午夜一区二区三区 | 99久久中文字幕三级久久日本| 美女中出高潮动态图| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久免费观看电影| 午夜激情福利司机影院| 日本色播在线视频| 97在线人人人人妻| 多毛熟女@视频| 99国产精品免费福利视频| 大片免费播放器 马上看| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产精品无大码| 亚洲精品一区蜜桃| 国产男女内射视频| 国产成人一区二区在线| 丰满少妇做爰视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 啦啦啦啦在线视频资源| 日日撸夜夜添| 热99久久久久精品小说推荐| 91久久精品国产一区二区成人| 免费观看在线日韩| 99热这里只有是精品在线观看| 最新中文字幕久久久久| 青春草视频在线免费观看| 国产精品一区二区在线不卡| 久久女婷五月综合色啪小说| 熟女人妻精品中文字幕| 久久精品国产自在天天线| 久久久a久久爽久久v久久| 精品一区在线观看国产| 女人久久www免费人成看片| 一本大道久久a久久精品| 视频在线观看一区二区三区| 中文字幕制服av| 中国三级夫妇交换| 国产精品国产av在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 99九九在线精品视频| 亚洲国产色片| av.在线天堂| 一区二区三区免费毛片| 高清视频免费观看一区二区| 丝袜美足系列| 日韩人妻高清精品专区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲精品乱久久久久久| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 晚上一个人看的免费电影| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产精品不卡视频一区二区| 99九九在线精品视频| 久久免费观看电影| 熟妇人妻不卡中文字幕| √禁漫天堂资源中文www| 黄色配什么色好看| a级毛片黄视频| 国产精品国产三级专区第一集| 中文字幕制服av| xxx大片免费视频| 亚洲,欧美,日韩| 最近手机中文字幕大全| 超色免费av| 老熟女久久久| a级毛片免费高清观看在线播放| av有码第一页| 黄色视频在线播放观看不卡| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久婷婷青草| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 两个人的视频大全免费| 中文字幕亚洲精品专区| 国产男女内射视频| 国产精品.久久久| 欧美日韩av久久| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 国产毛片在线视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产精品偷伦视频观看了| 新久久久久国产一级毛片| 久久ye,这里只有精品| 夫妻性生交免费视频一级片| 秋霞在线观看毛片| 女人精品久久久久毛片| 亚洲性久久影院| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久久国产欧美日韩av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 免费观看av网站的网址| 丝袜在线中文字幕| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲精品美女久久av网站| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 一区在线观看完整版| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久97久久精品| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲美女搞黄在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 免费av不卡在线播放| 久久精品国产亚洲网站| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产成人一区二区在线| 老司机亚洲免费影院| 最黄视频免费看| 日韩电影二区| 亚洲成人手机| av在线观看视频网站免费| 午夜福利视频在线观看免费| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲精品第二区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 18+在线观看网站| 亚洲欧美清纯卡通| 69精品国产乱码久久久| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 国产探花极品一区二区| 国产成人a∨麻豆精品| freevideosex欧美| av在线老鸭窝| 高清不卡的av网站| 亚洲精品自拍成人| 欧美丝袜亚洲另类| 国产成人精品婷婷| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品一二三区在线看| 五月玫瑰六月丁香| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 中国三级夫妇交换| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 七月丁香在线播放| 国产在线视频一区二区| 最近2019中文字幕mv第一页| 女人精品久久久久毛片| 国产在线视频一区二区| 亚洲人与动物交配视频| 日韩大片免费观看网站| 免费大片黄手机在线观看| 下体分泌物呈黄色| 日本vs欧美在线观看视频| 熟女av电影| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲国产av新网站| 欧美激情国产日韩精品一区| 简卡轻食公司| av免费观看日本| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲美女视频黄频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 黄片播放在线免费| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲在久久综合| 精品少妇内射三级| 永久网站在线| 麻豆乱淫一区二区| 免费观看a级毛片全部|