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    生物傳感器檢測(cè)食品中重金屬砷的研究進(jìn)展

    2016-11-14 08:39:04隋佳辰于寒松代佳宇宋戰(zhàn)昀王向輝
    食品科學(xué) 2016年7期
    關(guān)鍵詞:核酸重金屬食品

    隋佳辰,于寒松,,代佳宇,宋戰(zhàn)昀,王向輝,張 健

    (1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118;2.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局,吉林 長(zhǎng)春 130062)

    生物傳感器檢測(cè)食品中重金屬砷的研究進(jìn)展

    隋佳辰1,于寒松1,*,代佳宇1,宋戰(zhàn)昀2,*,王向輝1,張 健1

    (1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118;2.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局,吉林 長(zhǎng)春 130062)

    近年來(lái),我國(guó)食品中砷(As)超標(biāo)事件頻發(fā),嚴(yán)重威脅著我國(guó)人民的身體健康與生命安全,從而引起人們對(duì)砷危害性的高度重視。雖然傳統(tǒng)的重金屬檢測(cè)技術(shù)能對(duì)食品中的As進(jìn)行低濃度的測(cè)定,但是同時(shí)存在儀器昂貴、樣品前處理復(fù)雜、檢測(cè)成本較高、需專業(yè)人員進(jìn)行操作等缺點(diǎn),不利于食品中應(yīng)急事件的快速檢測(cè),因此仍需要發(fā)展一種成本低廉、簡(jiǎn)單快捷、準(zhǔn)確高效的檢測(cè)方法,用于食品中重金屬As的快速檢測(cè)。生物傳感器技術(shù)由于具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、選擇性好、靈敏度高、分析速度快且能在復(fù)雜的體系中進(jìn)行在線連續(xù)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn),使生物傳感器技術(shù)在食品安全領(lǐng)域中是一項(xiàng)具有長(zhǎng)遠(yuǎn)意義的新技術(shù),同時(shí)非常適用于食品中應(yīng)急事件的快速檢測(cè)。本文主要以大腸桿菌、蛋白質(zhì)、DNA和核酸適配體為基礎(chǔ)的生物傳感器為例,對(duì)生物傳感器技術(shù)的作用機(jī)理及在食品中重金屬As檢測(cè)中的最新應(yīng)用進(jìn)展作重點(diǎn)綜述,并對(duì)生物傳感器技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

    砷;食品安全;生物傳感器;檢測(cè)

    砷(As)是一種具有蓄積性毒性的重金屬元素,普遍存在于自然界中。單質(zhì)As本身無(wú)毒性,但砷化合物均有毒性,其中存在的四種價(jià)態(tài)中以As3+毒性最大,約為其他價(jià)態(tài)As的60 倍。近年來(lái),我國(guó)食品中砷污染事件頻發(fā),嚴(yán)重威脅著我國(guó)人民的身體健康與生命安全,其中包括癌癥[1]、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等相關(guān)疾病,已逐漸成為食品安全的重要問(wèn)題。人體內(nèi)的As主要是通過(guò)食物、空氣和飲用水進(jìn)入人體,經(jīng)肺和胃腸吸收后,隨血液分布并蓄積于全身各個(gè)組織中。當(dāng)攝入微量As時(shí)一般不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生健康危害,但是如果因食品污染使As攝入量超標(biāo)就會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。其中食物是人體攝入As的主要來(lái)源。食品中主要以魚(yú)、蝦、肉、奶等的重金屬As含量較高。As進(jìn)入人體后由于排泄較慢之故,長(zhǎng)時(shí)間積聚在人體內(nèi)引起急性和慢性As中毒,進(jìn)而危害人體健康。其中急性As中毒是指一次性攝入過(guò)多含As量較高的食物而引起的病癥,主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、呼吸困難、抽搐、咳嗽或胸痛等;慢性As中毒是指每次攝入含As量較少的食物,進(jìn)入人體內(nèi)經(jīng)長(zhǎng)期超量積累引起的中毒,主要表現(xiàn)為衰弱、食欲不振、便秘或腹瀉等,從而嚴(yán)重威脅人體健康。因此,發(fā)展一種快速、準(zhǔn)確的重金屬As檢測(cè)方法,對(duì)于食品安全及人體健康具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。傳統(tǒng)的重金屬As檢測(cè)方法有銀鹽法、砷斑法和硼氫化物還原比色法、氫化物原子熒光光譜法、原子吸收光譜法[2](atomic absorption spectroscopy,AAS)、高效液相色譜與氫化物發(fā)生原子熒光光度聯(lián)用[3](high performance liquid chromatography and hydride generation atomic fluorescence spectrometry,HPLC-HGAFS)、高效液相色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用[4](high performance liquid chromatography and inductively coupled plasma mass spectrometry,HPLC-ICP-MS)和氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用[5](gas chromatography and mass spectrometry,GC-MS)等和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法GB/T 5009.11ü2003《食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》[6],雖然以上方法都具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確性,但同時(shí)存在儀器復(fù)雜、操作過(guò)程較繁瑣、需專業(yè)人員進(jìn)行培訓(xùn)、檢測(cè)成本較高、前處理準(zhǔn)備時(shí)間較長(zhǎng)等缺點(diǎn),從而不適用于食品應(yīng)急事件中現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)快速檢測(cè)。因此,發(fā)展一種簡(jiǎn)便、快速、成本低廉、檢測(cè)限低、靈敏度高、適合現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)的方法,仍然是食品中重金屬As檢測(cè)領(lǐng)域一個(gè)重要的發(fā)展方向。

    生物傳感器是利用分子識(shí)別元件和待測(cè)物特異性結(jié)合產(chǎn)生的生物學(xué)信息,通過(guò)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)化為電、光等物理信號(hào)輸出,從而達(dá)到對(duì)各種分析物進(jìn)行定性和定量監(jiān)測(cè)目的的一種分析裝置[7]。生物傳感器因具有檢測(cè)專一、快速、靈敏、簡(jiǎn)易等特點(diǎn),被食品檢測(cè)部門(mén)廣泛應(yīng)用于大規(guī)模的快速檢測(cè)中。生物傳感器的特點(diǎn):1)操作方便,一般不需要進(jìn)行樣品的預(yù)處理,測(cè)定時(shí)一般不需另加其他試劑;2)體積小,可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)在線檢測(cè);3)樣品用量少、響應(yīng)快,可反復(fù)使用;4)成本低廉,便于推廣普及;5)更好的檢測(cè)限;6)特異性強(qiáng)、靈敏度高;7)高度自動(dòng)化、微型化與集成化等。生物傳感器技術(shù)由于具有以上優(yōu)勢(shì),使其在近幾十年獲得蓬勃而迅速的發(fā)展,而被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域[8]。但就國(guó)際期刊發(fā)表的數(shù)量來(lái)看,有關(guān)生物傳感器技術(shù)對(duì)食品中重金屬As檢測(cè)的文獻(xiàn)是少量的,使用PubMed引擎搜索關(guān)鍵詞“生物傳感器”數(shù)據(jù)庫(kù)顯示75 篇出版物,其中只有20 篇是As生物傳感器。迄今為止,已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一些涉及生物工程和電化學(xué)技術(shù)相耦合的As生物傳感器。目前,生物傳感器技術(shù)中常見(jiàn)的分子識(shí)別元件為抗體,抗體由于具有高親和性、高特異性,因而被廣泛應(yīng)用于生物傳感器的研發(fā)。但是,抗體存在一些自身的局限性,如針對(duì)某種目標(biāo)物,抗體需要一系列繁瑣復(fù)雜的體內(nèi)篩選過(guò)程、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、成本高、易變性、對(duì)檢測(cè)環(huán)境要求較高等[9],從而限制了抗體生物傳感器的發(fā)展。因此,需要研發(fā)一種新的分子識(shí)別元件,使其不僅具有抗體優(yōu)點(diǎn),同時(shí)又能克服抗體存在的缺點(diǎn),進(jìn)而應(yīng)用于食品中重金屬As的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)快速檢測(cè)。近年來(lái),隨著新理論、新技術(shù)的不斷發(fā)展,生物傳感器技術(shù)也在不斷地發(fā)展與自我完善,其中以大腸桿菌、DNA、蛋白質(zhì)和核酸適配體為基礎(chǔ)的As生物傳感器的研究工作取得了巨大的進(jìn)步,與傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比展現(xiàn)了優(yōu)越性的檢測(cè)性能,具有廣闊的發(fā)展前景[10]。本文主要以大腸桿菌生物傳感器、蛋白質(zhì)生物傳感器、DNA生物傳感器和新發(fā)展起來(lái)的核酸適配體生物傳感器為例,對(duì)生物傳感器技術(shù)在食品重金屬As檢測(cè)中的最新應(yīng)用進(jìn)展作重點(diǎn)綜述,并對(duì)生物傳感器技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域中的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

    1 生物傳感器檢測(cè)技術(shù)

    生物傳感器是利用高敏感性材料作為選擇性識(shí)別元件與物理化學(xué)換能器有機(jī)結(jié)合的一種新進(jìn)的檢測(cè)設(shè)備,對(duì)被檢樣品可實(shí)現(xiàn)快速、靈敏、精確的檢測(cè)。隨著環(huán)境及食品樣品中復(fù)雜成分的增多,傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)已無(wú)法滿足這種需求,因此出現(xiàn)了食品污染物的快速檢測(cè)技術(shù)。生物傳感器由于具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),且在現(xiàn)場(chǎng)、原位以及遠(yuǎn)程應(yīng)用中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)而引起研究者們的廣泛關(guān)注,研發(fā)出具有高敏感性,方便快捷的生物傳感器檢測(cè)系統(tǒng)用于檢測(cè)食品中的重金屬已成為近幾年的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)最新生物傳感器技術(shù)在傳統(tǒng)生物傳感器技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步降低檢測(cè)限、縮短響應(yīng)時(shí)間,同時(shí)還具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、制造成本低廉、便于攜帶,并能夠提供連續(xù)實(shí)時(shí)檢測(cè)信號(hào)等優(yōu)勢(shì)[11],備受研究者們的關(guān)注,并被廣泛研究與推廣中,為食品中重金屬As的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)快速檢測(cè)提供了發(fā)展方向。下面列舉了近年來(lái)生物傳感器技術(shù)在重金屬As檢測(cè)中的應(yīng)用,主要以大腸桿菌生物傳感器、蛋白質(zhì)生物傳感器、DNA生物傳感器和核酸適配體生物傳感器為例,詳解見(jiàn)表1。

    表1 生物傳感器技術(shù)對(duì)重金屬As的檢測(cè)Table 1 Characteristics of arsenic biosensor with detection limits and induction period/response time

    2 生物傳感器技術(shù)在食品重金屬As檢測(cè)中的應(yīng)用

    目前,隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,生物傳感器技術(shù)也在不斷地自我完善與發(fā)展,并成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)重金屬As的快速檢測(cè)。生物傳感器作為先進(jìn)技術(shù)的代表,以其具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),在食品安全領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。下面主要以大腸桿菌生物傳感器、蛋白質(zhì)生物傳感器、DNA生物傳感器和核酸適配子生物傳感器為例,針對(duì)它們?cè)谑称分兄亟饘貯s檢測(cè)的最新應(yīng)用研究進(jìn)展做如下綜述(表1)。

    2.1 大腸桿菌生物傳感器技術(shù)

    大腸桿菌是原核生物,由于其構(gòu)造相對(duì)簡(jiǎn)單、遺傳背景清楚、易培養(yǎng)等,常作為外源基因表達(dá)的宿主,備受研究者們的關(guān)注。目前,已經(jīng)針對(duì)重金屬As研發(fā)出了一些新的大腸桿菌生物傳感器,并在食品安全領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。大腸桿菌作為一種選擇生物活性高、適應(yīng)性強(qiáng)、生活條件要求較低的敏感元件可以提高生物傳感器的工作壽命。大腸桿菌生物傳感器的作用機(jī)理是將外源基因?qū)胭|(zhì)粒中,再將質(zhì)粒整合到大腸桿菌基因,這樣,大腸桿菌就能夠表達(dá)基因重組后的蛋白等。選擇大腸桿菌作為傳感器的生物敏感元件的一個(gè)重要因素是大腸桿菌生存能力極強(qiáng),能夠在較為惡劣的環(huán)境下生存,這對(duì)于提高傳感器的使用壽命及穩(wěn)定性極為重要。從而為解決生物傳感器的壽命問(wèn)題提供了新思路。Hou Qihui等[12]以熒光素酶基因?yàn)榛A(chǔ)的大腸桿菌重組表達(dá)載體pUC18-luc為材料,人工合成arsRp基因全部序列,替換掉熒光素酶重組表達(dá)載體pUC18中的T7啟動(dòng)子和lac操縱子片段,構(gòu)建含As3+特異性誘導(dǎo)啟動(dòng)子表達(dá)載體pUC18-luc,再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中,研究其在砷離子誘導(dǎo)時(shí)熒光素酶基因的表達(dá)情況,進(jìn)而研究不同的長(zhǎng)期施肥制度對(duì)土壤中的As生物利用度的影響,得出的結(jié)論是研發(fā)的生物傳感器在評(píng)估As在土壤中的生物利用度方面,比化學(xué)提取方法更有效。此大腸桿菌生物傳感器展現(xiàn)了良好的檢測(cè)性能,響應(yīng)時(shí)間為120 min,檢測(cè)限為3.75 μg/L。Cortés等[13]基于生物工程和電化學(xué)方法相耦合,輸入生物芯片從而構(gòu)建出重組細(xì)菌生物傳感器,最終實(shí)現(xiàn)對(duì)As的檢測(cè)。該技術(shù)是利用大腸桿菌針對(duì)有毒As物質(zhì)的耐藥機(jī)制,耦合細(xì)胞內(nèi)的As識(shí)別產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。重金屬As對(duì)電化學(xué)生物芯片顯示出高靈敏度和選擇性,響應(yīng)時(shí)間為253.8 min,檢測(cè)限為0.8 μg/L。Buffi等[14]利用大腸桿菌的一個(gè)非致病性實(shí)驗(yàn)室菌株作為生物傳感器的信號(hào)元件,其中As和砷酸鹽接觸后產(chǎn)生變體的綠色熒光蛋白。大腸桿菌生物識(shí)別細(xì)胞封裝在瓊脂糖株里,并納入微流體裝置。它們被500 μmh500 μm網(wǎng)箱捕獲并暴露于含As水樣中。細(xì)胞-珠在-20 ℃條件下冷凍于微流體芯片中,仍保留長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月的誘導(dǎo)能力,進(jìn)而構(gòu)建成一個(gè)完整的小型化細(xì)菌微流體生物傳感器裝置。此生物傳感器展現(xiàn)了良好的檢測(cè)性能,響應(yīng)時(shí)間為199.8 min,檢測(cè)限為10 μg/L。Truffer等[15]提出了一個(gè)采用大腸桿菌生物識(shí)別細(xì)胞的小型便攜式生物傳感器來(lái)測(cè)量水溶液中的As3+。在一個(gè)線性依賴方式中,大腸桿菌表達(dá)綠色熒光蛋白作為測(cè)定As濃度的一個(gè)函數(shù)(0 μg/L和100 μg/L)。該器件可容納一個(gè)小的聚二甲基硅氧烷微流控芯片、瓊脂糖封裝的細(xì)菌及一個(gè)完整自動(dòng)定量熒光測(cè)量的光學(xué)照明/收集/檢測(cè)系統(tǒng)。該裝置能夠自主地進(jìn)行水采樣,控制整個(gè)測(cè)量,在全球移動(dòng)系統(tǒng)(global system for mobile,GSM)網(wǎng)絡(luò)上存儲(chǔ)和傳送數(shù)據(jù)。該方法具有良好的檢測(cè)性能,響應(yīng)時(shí)間為72 min,檢測(cè)限為10 μg/L。

    2.2 蛋白質(zhì)生物傳感器技術(shù)

    蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),是生命體的必要組成成分。近年來(lái),蛋白質(zhì)生物傳感器在食品安全領(lǐng)域中備受研究者們的關(guān)注,并被認(rèn)為是一種重要的重金屬檢測(cè)工具。目前,已經(jīng)針對(duì)重金屬As研發(fā)出了一些最新的蛋白質(zhì)生物傳感器并取得了一定的進(jìn)展。蛋白質(zhì)生物傳感器的作用機(jī)理是以發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)作為敏感元件,將蛋白質(zhì)分子直接固定在電極表面,使蛋白質(zhì)的氧化還原活性中心與電極直接交流,能夠更快地進(jìn)行電子傳遞,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)被檢樣品的快速檢測(cè)。Sarkar等[16]提出了通過(guò)L-半胱氨酸的氧化而建立的快速電化學(xué)傳感系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)對(duì)砷酸的檢測(cè)。該研究中包括絲網(wǎng)印刷電極和具有3 個(gè)不同感測(cè)系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)電極。L-半胱氨酸的檢測(cè)器元件被固定在丙烯酰胺原位聚合的傳感器的工作電極上,通過(guò)循環(huán)伏安法和安培法進(jìn)行L-半胱氨酸的電催化氧化。該傳感器顯示了良好的檢測(cè)性能,響應(yīng)時(shí)間為5 min,檢測(cè)限為1.2 μg/L。Sanllorente等[17]利用金屬可對(duì)乙酰膽堿酯酶的酶活性產(chǎn)生抑制作用的機(jī)理,開(kāi)發(fā)了酶促安培程序用于測(cè)量重金屬As。絲網(wǎng)印刷碳電極與乙酰膽堿酯酶直接共價(jià)并鍵合到其表面上。當(dāng)As離子存在時(shí),乙酰膽堿酯酶的安培響應(yīng)受到影響,導(dǎo)致電流強(qiáng)度降低。最終確定了實(shí)驗(yàn)中pH值、底物濃度及電勢(shì)的最佳工作條件。在最佳工作條件下,生物傳感器可重復(fù)性和重現(xiàn)性地對(duì)As進(jìn)行測(cè)定。此生物傳感器的響應(yīng)時(shí)間為70 min,檢測(cè)限為0.825 μg/L。Sanllorente等[18]基于酸性磷酸酶活性的抑制作用,研發(fā)出酶促安培過(guò)程用于直接測(cè)量As5+。絲網(wǎng)印刷碳電極被用作支持酸性磷酸酶的交聯(lián)固定化。在砷的測(cè)定中,2-磷酸-L-抗壞血酸被用作新穎襯底,當(dāng)As5+離子存在時(shí),安培響應(yīng)下降。通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法確定最佳工作條件,該方法被成功應(yīng)用于地下水樣品中As5+含量的測(cè)定,響應(yīng)時(shí)間為70 min,檢測(cè)限為0.825 μg/L。Fuku等[19]基于細(xì)胞色素c開(kāi)發(fā)了一個(gè)電化學(xué)生物傳感器進(jìn)行As的檢測(cè)。細(xì)胞色素c是線粒體中電子傳遞鏈的一個(gè)重要組成部分,對(duì)所有有毒化合物非常敏感,也被用作生物識(shí)別元件。細(xì)胞色素c被固定在摻硼金剛石電極上構(gòu)造電化學(xué)生物傳感器。用方波伏安法(square wave voltammetry,SWV)和電化學(xué)阻抗譜(electrochemical impedance spectroscopy,EIS)研究細(xì)胞色素c與As和氰化物的相互作用并計(jì)算出靈敏度。該生物傳感器制備方式簡(jiǎn)單且快速,但其檢測(cè)限卻很高,檢測(cè)限為692 μg/L,響應(yīng)時(shí)間為0.5 min。

    2.3 DNA生物傳感器技術(shù)

    DNA是遺傳信息的載體,是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。DNA生物傳感器是最近幾年新型生物傳感器的代表之一,以其優(yōu)異的檢測(cè)性能成功實(shí)現(xiàn)對(duì)重金屬砷的快速檢測(cè),并展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。DNA生物傳感器的作用機(jī)理是以DNA為敏感元件,采用電化學(xué)的方法將DNA特異性識(shí)別過(guò)程中產(chǎn)生的信號(hào)通過(guò)換能器轉(zhuǎn)化為可測(cè)的電信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)被檢樣品的定性或定量檢測(cè)。Ozsoz等[20]研究了小牛胸腺DNA和17-mer的寡核苷酸,作為鳥(niǎo)嘌呤氧化信號(hào)進(jìn)行As3+電化學(xué)檢測(cè)的生物組分。這項(xiàng)研究的特別之處是調(diào)查了As3+對(duì)dsDNA,ssDNA和17-mer的寡核苷酸的作用效果。碳糊或鉛筆石墨工作電極被用于差分脈沖伏安法(differential pulse voltammetry,DPV)和電位溶出分析。該傳感器檢測(cè)限為385 μg/L,響應(yīng)時(shí)間為2 min。Ferancová等[21]用DNA和DNA-碳納米管薄膜固定在絲網(wǎng)印刷碳電極表面上而構(gòu)建的生物傳感器,用于簡(jiǎn)單的重金屬As體外實(shí)驗(yàn)。該傳感器存在許多缺陷,檢出限非常高,電極再生能力低且作用效果不好,特異性差等,其檢測(cè)限為77 000 μg/L,響應(yīng)時(shí)間為10 min。Liu Yaxiong等[22]利用碳納米管高電導(dǎo)率的優(yōu)點(diǎn)構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器。基于層-層組裝的DNA官能化的單壁碳納米管的雜交,開(kāi)發(fā)出近生理pH值環(huán)境下的DNA生物傳感器用于As3+的檢測(cè)。此生物傳感器證明了As3+和As在DNA功能化單壁碳納米管修飾玻碳電極直接氧化的概念。此生物傳感器具有廣泛的pH值檢測(cè)范圍(3.0~8.0),檢測(cè)限為0.05 μg/L,響應(yīng)時(shí)間為3 min。Solanki等[23]在雙鏈小牛胸腺脫氧核糖核酸(double-stranded calf thymus DNA,DSCT-DNA)表面等離子體共振構(gòu)建的生物傳感器的基礎(chǔ)上,利用自組裝單層(self assembled monolayers,SAM)和表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)技術(shù),提高了檢測(cè)性能并實(shí)現(xiàn)了對(duì)As3+的檢測(cè)。SAM使用薄膜形成生物分子檢測(cè)平臺(tái),跟傳統(tǒng)研究中使用厚膜方法相比,提高了聚合物基質(zhì)中的電流流動(dòng)速度。這項(xiàng)研究首次提出DSCT-DNA與As2O3之間可能存在相互作用。盡管這項(xiàng)研究在最短的響應(yīng)時(shí)間,實(shí)現(xiàn)了非常低的檢出限(其檢測(cè)限為0.5 μg/L,響應(yīng)時(shí)間為10 min),但其存在兩個(gè)主要缺陷:首先,難以制作大批量如此復(fù)雜的dsCTDNA/小牛雙鏈胸腺脫氧核糖核酸(merceptoethanol,MCE)/Au生物電極;其次,此生物傳感器對(duì)As3+不敏感。

    2.4 核酸適配體生物傳感器技術(shù)

    近年來(lái),隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,核酸適配體作為一個(gè)新類別的生物識(shí)別元件已被研究者們廣泛關(guān)注。核酸適配體是新近發(fā)展起來(lái)的一類由指數(shù)富集配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)體外篩選產(chǎn)生的單鏈DNA或RNA片段[24-25],能特異性地結(jié)合小分子、蛋白質(zhì)、多肽、有機(jī)物、金屬離子等各種配體[26],已被廣泛應(yīng)用于多種生物傳感器檢測(cè)平臺(tái),在醫(yī)療診斷、環(huán)境檢測(cè)、生化分析,食品檢測(cè)中展示出了良好的應(yīng)用前景。其中核酸適配體作為新類別的分子識(shí)別元件在以下幾方面又優(yōu)于抗體:1)靶分子廣;2)穩(wěn)定性好,可重復(fù)使用;3)無(wú)免疫原性;4)體外化學(xué)合成;5)易修飾等。由于核酸適配體擁有抗體無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì),因此利用核酸適配體設(shè)計(jì)生物傳感器對(duì)食品中重金屬As進(jìn)行識(shí)別和檢測(cè),具有極其重要的意義[27-28]。目前,已經(jīng)針對(duì)重金屬As篩選出了相應(yīng)的核酸適配體,但以核酸適配體生物傳感器檢測(cè)砷的文獻(xiàn)是罕見(jiàn)的。Kim等[29]通過(guò)SELEX技術(shù)經(jīng)體外10 輪篩選,最終篩選出一種具有高親和力的三號(hào)砷(arsenic-3,ARS-3)核酸適配體,通過(guò)SPR定量分析揭示了ARS-3適體對(duì)砷酸鹽和亞砷酸鹽溶液中As3+和As5+具有最高的親和力,解離常數(shù)分別可達(dá)7 nmol/L和5 nmol/L。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明ARS-3核酸適配體具較高的親和力,可直接用于As離子的檢測(cè),檢出限為28.1~739.2 μg/L,檢測(cè)時(shí)間5 min。Wu Yuangen等[30]利用As3+與As核酸適配體相互作用,形成As3+-核酸適配體復(fù)合物,帶正電荷的陽(yáng)離子被釋放可以聚合金納米顆粒,并導(dǎo)致明顯的顏色變化,顏色由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色。從而利用比色法檢測(cè)As3+,此方法具有較高的特異性,檢測(cè)限為5.30 μg/L。Wu Yuangen[31]等通過(guò)砷核酸適配體與目標(biāo)靶和陽(yáng)離子表面活性劑CTAB之間的特殊相互作用,聚集金納米顆粒(gold nanoparticles,AuNPs)建立以比色和共振散射(resonance scattering,RS)為基礎(chǔ)的生物傳感器,超靈敏檢測(cè)水溶液中的As3+。此傳感器對(duì)肉眼的檢測(cè)限為40 μg/L,比色測(cè)定檢測(cè)限為0.60 μg/L和RS測(cè)定檢測(cè)限為0.77 μg/L。Wu Yuangen等[32]利用As3+能誘導(dǎo)砷核酸適配體與CV形成復(fù)合物金納米顆粒大小的不同,開(kāi)發(fā)了一種基于共振瑞利散射(resonance rayleigh scattering,RRS)光譜法測(cè)定As3+的具有高靈敏度和選擇性的核酸適配體生物傳感器。此生物傳感器的動(dòng)態(tài)范圍為0.10~200 μg/L之間,檢測(cè)限低至0.20 μg/L。Wu Yuangen等[33]利用砷核酸適配體在其基板上能暫時(shí)抑制較高濃度氯化血紅素的催化活性,3,5,3’,5’-四甲基聯(lián)苯胺(tetramethyl benzidine,TMB)能產(chǎn)生藍(lán)色的陽(yáng)離子自由基。當(dāng)As3+存在時(shí),由于砷核酸適配體與As3+形成配合物,TMB分子充分地被氧化成黃色二胺產(chǎn)物,并導(dǎo)致吸光度在442 nm波長(zhǎng)處顯著增加,從而實(shí)現(xiàn)利用比色法檢測(cè)As3+。此方法具有較高的選擇性,檢測(cè)限為6.00 μg/L。目前,相對(duì)較新的核酸適配體技術(shù)已經(jīng)成功用于生物傳感器檢測(cè)平臺(tái),實(shí)踐證明核酸適配體生物傳感器是一種可行的重金屬檢測(cè)的替代方案,具有廣闊的發(fā)展前景。特別是核酸適配體-靶向技術(shù)的出現(xiàn),加快了核酸適配體生物傳感器的飛速發(fā)展[34-35]。

    3 結(jié) 語(yǔ)

    食品安全問(wèn)題是重大的民生問(wèn)題。近年來(lái),我國(guó)食品中As超標(biāo)事件頻發(fā),嚴(yán)重威脅著我國(guó)人民的身體健康與生命安全,其中包括癌癥、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等相關(guān)疾病,引起人們對(duì)As危害性的高度重視。目前,在食品安全領(lǐng)域中,已經(jīng)針對(duì)重金屬As開(kāi)發(fā)了多種As生物傳感器,但因重金屬As離子小、免疫原性相對(duì)較低、獲得針對(duì)重金屬As離子的特異性抗體難度較大等原因,因此對(duì)重金屬As離子的免疫檢測(cè)技術(shù)發(fā)展相對(duì)緩慢,從而限制了免疫傳感器的發(fā)展。而大腸桿菌生物傳感器、蛋白質(zhì)生物傳感器、DNA生物傳感器和核酸適配體生物傳感器克服了這一缺陷,并成功地應(yīng)用于食品重金屬As的快速檢測(cè)。相比較而言,近幾年新發(fā)展起來(lái)的核酸適配體生物傳感器展現(xiàn)出了靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)時(shí)間快、檢測(cè)限較低,穩(wěn)定性好和適用范圍廣等一系列優(yōu)良檢測(cè)性能。

    近年來(lái),隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,生物傳感器技術(shù)也得到了飛速發(fā)展,并在實(shí)際樣品的檢測(cè)中展現(xiàn)了良好的檢測(cè)效果。大腸桿菌生物傳感器、蛋白質(zhì)生物傳感器、DNA生物傳感器和核酸適配體生物傳感器均在重金屬As快速檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。但是這些生物傳感器技術(shù)在食品重金屬As檢測(cè)中的應(yīng)用還存在一定的問(wèn)題,如大腸桿菌生物傳感器存在“保質(zhì)期”問(wèn)題,大腸桿菌生物傳感器是環(huán)境敏感型生物傳感器,易受溫度、pH值以及環(huán)境的影響,保存條件還需進(jìn)一步完善;蛋白質(zhì)生物傳感器和DNA生物傳感器在發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)之后均存在穩(wěn)定性差、響應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)、檢測(cè)限較高等缺點(diǎn);核酸適配體生物傳感器存在核酸適配體篩選過(guò)程比較繁瑣、沒(méi)有針對(duì)任何靶標(biāo)的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)SELEX篩選程序、核酸適配體的穩(wěn)定性還需進(jìn)一步加強(qiáng)等,這些問(wèn)題仍在某種程度上阻礙生物傳感器技術(shù)在食品重金屬As快速檢測(cè)中的應(yīng)用與發(fā)展。筆者認(rèn)為,未來(lái)的發(fā)展應(yīng)致力于優(yōu)化生物傳感器技術(shù)的檢測(cè)性能,即優(yōu)化它們的檢測(cè)限、響應(yīng)時(shí)間和特異性。因此,還應(yīng)在以下幾點(diǎn)做進(jìn)一步深入研究:1)深入研究識(shí)別分子與靶分子之間的作用機(jī)理,保證生物傳感器在復(fù)雜環(huán)境下的選擇性和靈敏度;2)提高生物傳感器的穩(wěn)定性與保質(zhì)期,使其能在長(zhǎng)時(shí)間保存后仍具有良好的檢測(cè)性能;3)致力于研發(fā)快速化、微型化、自動(dòng)化的新型生物傳感器;4)為實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)快速檢測(cè)的需求,努力研發(fā)出更加經(jīng)濟(jì)、快速、便捷的新型生物傳感器以滿足市場(chǎng)及廣大消費(fèi)者們的需要;5)不斷研究新方法與新技術(shù)擴(kuò)大生物傳感器技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。相信隨著分析方法及檢測(cè)手段的進(jìn)一步發(fā)展,在不久的將來(lái),生物傳感器技術(shù)必將會(huì)給人們的生活帶來(lái)巨大的變化,必將在市場(chǎng)上大放異彩,必將在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

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    Advances in the Application of Biosensor Technology for the Detection of Heavy Metal Arsenic in Foods

    SUI Jiachen1, YU Hansong1,*, DAI Jiayu1, SONG Zhanyun2,*, WANG Xianghui1, ZHANG Jian1
    (1. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Changchun 130062, China)

    In recent years, the events of arsenic contamination in foods arose frequently in China, which seriously threaten human health and life safety and have gained high attention due to the harmfulness of arsenic. Although the traditional analytical techniques enable detection of arsenic at low concentrations in foods, they have many shortcomings such as expensive instruments, sophisticated sample pretreatment, high cost and professional operation. Thus, there is still the necessity of developing a low-cost, simple and quick, accurate and efficient method for the detection of arsenic in foods. Due to its characteristics such as simple operation, low detection cost, good selectivity, high sensitivity, rapid analysis and continuous monitoring on-line in a complex system, biosensor technology is a new technology with long-term significance in the field of food safety, and it is very suitable for rapid detection of arsenic contamination in food safety incident emergency handling. In this article, the working mechanisms of biosensors based on E. coli, protein, DNA and aptamer as well as the latest progress in their application for the detection of arsenic in foods are reviewed. Moreover, future applications of biosensor technology in the field of food safety are also discussed.

    arsenic; food safety; biosensor; detection

    10.7506/spkx1002-6630-201607042

    TS207.3

    A

    1002-6630(2016)07-0233-06

    隋佳辰, 于寒松, 代佳宇, 等. 生物傳感器檢測(cè)食品中重金屬砷的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(7): 233-238. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607042. http://www.spkx.net.cn

    SUI Jiachen, YU Hansong, DAI Jiayu, et al. Advances in the application of biosensor technology for the detection of heavy metal arsenic in foods[J]. Food Science, 2016, 37(7): 233-238. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607042. http://www.spkx.net.cn

    2015-08-24

    國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31001065)

    隋佳辰(1987—),男,碩士研究生,主要從事核酸適配體研究。E-mail:190212449@qq.com

    *通信作者:于寒松(1979—),男,教授,博士,主要從事豆制品加工研究。E-mail:yuhansong@jluhp.edu.cn宋戰(zhàn)昀(1976—),男,獸醫(yī)師,博士,主要從事核酸適配體研究。E-mail:zhanyun-song@163.com

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