酶聯(lián)免疫法測(cè)定水中氯霉素的方法探討

劉 靜， 董煜杰， 嚴(yán)義勇

(1. 成都市自來(lái)水有限責(zé)任公司水質(zhì)中心 ，四川成都610071；2. 深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司，廣東深圳518000)

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分 析 監(jiān) 測(cè)

酶聯(lián)免疫法測(cè)定水中氯霉素的方法探討

劉 靜1， 董煜杰1， 嚴(yán)義勇2

(1. 成都市自來(lái)水有限責(zé)任公司水質(zhì)中心 ，四川成都610071；2. 深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司，廣東深圳518000)

氯霉素藥物在水產(chǎn)及畜牧業(yè)使用廣泛，相關(guān)的行業(yè)用水及抗生素生產(chǎn)廢水會(huì)在水域中殘留，若被人體長(zhǎng)期攝取，會(huì)造成被動(dòng)的抗生素濫用，嚴(yán)重影響民眾身體健康水平，因此水中氯霉素的檢測(cè)需要引起重視。開(kāi)發(fā)了一種針對(duì)水樣品中氯霉素的快速檢測(cè)方法。通過(guò)比較確定氮吹法為最優(yōu)的前處理方法，并得到了較高的檢測(cè)靈敏度(25 ng/L)。本研究為ELISA法在水質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用提供了一個(gè)范例，給水源污染應(yīng)急檢測(cè)提供一個(gè)快速檢測(cè)方案。

酶聯(lián)免疫法； 氯霉素； 凍干； 氮吹

酶聯(lián)免疫法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)自1971年建立以來(lái)，由于其極高的靈敏度、特異性及適用性，已成為生物及分析化學(xué)領(lǐng)域的前沿課題[1]。目前此法在醫(yī)學(xué)、檢測(cè)食品藥物殘留方面有廣泛成熟的應(yīng)用，而在水質(zhì)檢測(cè)中報(bào)導(dǎo)較少。形成這種情況的重要原因之一是ELISA研發(fā)過(guò)程中的樣品處理方式不適用于水質(zhì)樣本檢測(cè)。

氯霉素屬?gòu)V譜類抗生素藥物，能抑制尤其是革蘭氏陰性菌細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，對(duì)各種立克氏體、原蟲(chóng)及部分病毒也有一定的抑制作用[2]。目前氯霉素類藥物在水產(chǎn)和畜禽養(yǎng)殖中仍應(yīng)用廣泛，添加氯霉素的水產(chǎn)養(yǎng)殖水和抗生素制藥廠偷排的廢水是環(huán)境中氯霉素的來(lái)源。因此氯霉素的環(huán)境污染，尤其是水域中的污染是值得重視的問(wèn)題[3]。目前檢測(cè)氯霉素方法包括高效液相色譜法[4-5]、氣相色譜法[6]、質(zhì)譜法[7-9]等，其分析時(shí)間長(zhǎng)、樣品前處理復(fù)雜、需要昂貴的儀器且對(duì)操作人員技能有很高的要求。

本文將探索酶聯(lián)免疫法如何與適合的樣品前處理技術(shù)結(jié)合，以氯霉素(Chloramphenicol)為目標(biāo)物，測(cè)定水中的氯霉素含量。而ELISA方法不但有極高的特異性、準(zhǔn)確度和靈敏度，還具有檢測(cè)速度快、同時(shí)檢測(cè)大量樣本、方便易用的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

試劑：氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μg/mL(甲醇溶劑，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)、乙腈(色譜純)、乙酸乙酯(色譜純)、甲醇(色譜純)，Milli-P超純水，氯霉素檢測(cè)試劑盒(深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司)。

儀器：Thermo Multiskan FC 96孔酶標(biāo)儀(配備450和630 nm濾光片)；Eppendorf 5702離心機(jī)(轉(zhuǎn)速4 000 r/min)；Denver Instrument 天平(感量0.00 001 g)；IKA MS3 basic渦旋儀；氮?dú)獯蹈蓛x；Thermo finnpippete移液器：?jiǎn)蔚?0～100 μL、100～1 000 μL、多道30～300 μL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 準(zhǔn)備

使用試劑盒前將試劑和微孔板回溫至室溫，用后放回2～8 ℃。取出需要數(shù)量的微孔板，其余的放入自封袋中，保存于2～8 ℃。建議每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)液做2次平行試驗(yàn)。

1.2.2 加樣

加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50 μL 到相應(yīng)微孔，然后加入酶結(jié)合物50 μL 到每個(gè)微孔，最后加入抗體工作液50 μL 到每孔，輕輕震蕩混勻后，蓋上蓋板膜。

1.2.3 孵育

室溫25 ℃下避光反應(yīng)30 min。

1.2.4 洗板

小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加1×洗滌液250 μL/孔，重復(fù)洗滌5 次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干。

1.2.5 顯色

每孔依次加入底物液A 50 μL，底物液B 50 μL，輕輕震蕩混勻后，蓋上蓋板膜，25 ℃室溫下避光反應(yīng)15 min。

1.2.6 終止和讀值

加入終止液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處(用雙波長(zhǎng)450/630 nm檢測(cè)，在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測(cè)定每孔OD值。

1.2.7 樣品處理方法

取1 mL水樣于1.5 mL離心管中；采樣不同的富集方式進(jìn)行濃縮；加入樣本復(fù)溶液0.2 mL，渦旋震蕩5 min 后用于點(diǎn)樣(樣本稀釋倍數(shù)為0.2 倍)。

1.3 計(jì)算方法

標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的平均吸光度值(平均OD值)除以零標(biāo)準(zhǔn)的平均吸光度值(平均OD值)，再乘以100。零標(biāo)準(zhǔn)為100%(最大吸光度值)，其他OD值為最大吸光度的百分?jǐn)?shù)。

說(shuō)起“現(xiàn)成品藝術(shù)”，很容易讓人聯(lián)想到馬歇爾.杜尚的一系列作品，比如《自行車輪》、《泉》、《大玻璃》、《L.H.O.O.Q》等。但在理論家阿瑟.丹托(ArthurC Danto)的著作《藝術(shù)的終結(jié)》一書(shū)中，丹托并沒(méi)有將杜尚的《泉》作為一件標(biāo)志“藝術(shù)終結(jié)”的作品，而是選擇了安迪.沃霍爾(Andy Warhol)的《布里洛盒子》。這兩件作品看上去都跟現(xiàn)成品有關(guān)，為什么丹托不選擇更早出現(xiàn)的《泉》呢？

式中B——標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0——0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

校準(zhǔn)曲線以log(標(biāo)準(zhǔn)品濃度)為橫坐標(biāo)，以Logit(B/B0)為縱坐標(biāo)，構(gòu)建線性回歸方程。將樣品的Logit(B/B0)值代入上述回歸方程，求得的值乘以樣本稀釋倍數(shù)0.2，即為樣本中氯霉素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 水中氯霉素的富集

2.1.1 富集方式的選擇

水中痕量抗生素富集方法可以用凍干法或氮吹濃縮富集法。凍干法是取1mL水樣品，冷凍成冰干燥過(guò)夜后再測(cè)定。

選取了新鮮制備的雙蒸水作為陰性樣本。通過(guò)在1mL陰性樣本中添加不同量的氯霉素，對(duì)兩種方法進(jìn)行回收率對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同方法回收率測(cè)定

對(duì)比試驗(yàn)表明凍干法回收率略高于氮吹法。凍干法可很好地實(shí)現(xiàn)水溶液中氯霉素的富集，但操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(16 h以上)，且需要配備凍干機(jī)。氮吹濃縮時(shí)間較短，試驗(yàn)回收率也能滿足回收率>70%的檢測(cè)要求。本次選用氮吹濃縮進(jìn)行水中氯霉素的富集。

2.1.2 富集用有機(jī)溶劑的選擇

因水相對(duì)常用有機(jī)溶劑來(lái)說(shuō)沸點(diǎn)較高，不易吹干，需通過(guò)往水中摻和有機(jī)溶劑形成低沸混合物的方法來(lái)有效降低水的沸點(diǎn)，從而提高氮吹濃縮時(shí)效。

根據(jù)氯霉素的溶解性、有機(jī)溶劑與水的互溶性、共沸物形成情況等因素，選定乙腈作為水中氯霉素濃縮富集的有機(jī)溶劑。

2.1.3 富集用有機(jī)溶劑與水比例的選擇

1 mL水樣品中添加不同含量乙腈對(duì)濃縮干燥時(shí)間有一定影響。在78 ℃加熱， 1 mL水樣品中添加1，3，5，7，9和11 mL的乙腈，干燥時(shí)間如下表2所示。隨乙腈加量增加，干燥時(shí)間先降后升。當(dāng)乙腈：水比例為9 ∶1時(shí)，所需時(shí)間最短，此時(shí)最接近乙腈-水共沸物(乙腈含量85%，共沸點(diǎn)76 ℃)[10]。故選用乙腈∶水(9 ∶1)作為富集用低沸混合溶劑。不同乙腈摻和量的樣品干燥時(shí)間如表2所示。

表2 不同乙腈摻和量的樣品干燥時(shí)間

2.2 試劑盒有效性復(fù)核

2.2.1 線性檢測(cè)

配置0，25，100，400和1 600 ng/L的5點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值為0.993，線性較好，符合檢測(cè)要求。氯霉素ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 氯霉素ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 檢出限

以超純水為空白樣品，測(cè)定6個(gè)空白樣品的平均值，再加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差，即為檢測(cè)限。配置0，25，100，400，1 600 ng/L的5點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2=0.993)，計(jì)算由上表可知檢測(cè)限為24.81 ng/L，與試劑盒檢出限標(biāo)識(shí)相符。

表3 ELISA試劑盒空白樣品的測(cè)定及檢測(cè)限的核定

2.3 實(shí)際樣品測(cè)試

選取了具有代表性的5個(gè)出廠水和6個(gè)管網(wǎng)水點(diǎn)位的樣本進(jìn)行了實(shí)際樣品檢測(cè)。5個(gè)出廠水，分別編號(hào)為：CC1，CC2，CC3，CC4，CC5；6個(gè)管網(wǎng)水，分別編號(hào)為GW1，GW2，GW3，GW4，GW5，GW6。平行測(cè)試3次，取平均值，測(cè)定結(jié)果如表4所示。

表4 ELISA法測(cè)定實(shí)際水樣中氯霉素的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

① 通過(guò)優(yōu)化選擇，獲得了水質(zhì)樣本ELISA檢測(cè)前處理的合適方法。將進(jìn)一步提高ELISA檢測(cè)在水環(huán)境檢測(cè)中的應(yīng)用前景。

② 氮吹-ELISA法的建立應(yīng)用，大大提高了檢測(cè)時(shí)效，適合水質(zhì)樣品的快速篩查定量。該方法對(duì)控制水質(zhì)安全，應(yīng)對(duì)突發(fā)性安全事件等水質(zhì)監(jiān)控具有重要意義。

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廣東省科技發(fā)展專項(xiàng)資金(2016A040403022)

O657

C

1673-9353(2016)05-0052-03

10.3969/j.issn.1673-9353.2016.05.012

劉 靜(1983- )， 女， 工程師， 主要從事水質(zhì)微生物領(lǐng)域的檢測(cè)及研究工作。E-mail：joise028_912@163.com

2016-05-30