江蘇鹽城地區(qū)異育銀鯽大紅鰓疾病病原學(xué)研究及病理學(xué)觀察

劉　韜　汪開毓，　陳俊杰　劉天強　李　茂　康岳華　段　靖　賀　揚

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心，成都 611130； 2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130；3. 通威股份動物保健研究所，成都 610000）

江蘇鹽城地區(qū)異育銀鯽大紅鰓疾病病原學(xué)研究及病理學(xué)觀察

劉韜1汪開毓1，2陳俊杰1劉天強3李茂3康岳華3段靖1賀揚1

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心，成都 611130； 2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130；3. 通威股份動物保健研究所，成都 610000）

為鑒定近期江蘇鹽城地區(qū)養(yǎng)殖異育銀鯽“大紅鰓”疾病病原，研究從患病瀕死魚中分離到兩株致病菌并對其理化特性、分子生物學(xué)、感染病理學(xué)進行了研究，同時開展了鑒別診斷和回歸試驗以及藥敏檢測。結(jié)果顯示，兩分離株理化特性與溫和氣單胞菌（A. sobria）特征相符，與GenBank中A. sobria的gyrB基因同源性達99%以上，在系統(tǒng)發(fā)育樹上均與A. sobria聚為一族。同時與鯉科皰疹病毒2型（CyHV-2）鑒別診斷結(jié)果表明，患病魚組織中CyHV-2檢測為陰性。組織學(xué)上，鰓和腎組織具有典型病理變化。人工感染兩株A. sobria后，魚體出現(xiàn)與自然發(fā)病相似的“大紅鰓”癥狀，并能從發(fā)病魚組織中再分離到相同病原菌； 而人工感染CyHV-2組織勻漿后的鯽雖然出現(xiàn)死亡，但無“大紅鰓”癥狀出現(xiàn)。綜上，確認此次“大紅鰓”疾病的病原為A. sobria。藥敏實驗表明，分離菌株對諾氟沙星、氧氟沙星、氯霉素三種藥物敏感。研究為臨床上更好的預(yù)防異育銀鯽“大紅鰓”疾病奠定了基礎(chǔ)。

異育銀鯽；溫和氣單胞菌；大紅鰓；CyHV-2；病理組織學(xué)

異育銀鯽“大紅鰓”病是2011年開始出現(xiàn)在江蘇地區(qū)鯽養(yǎng)殖業(yè)中的高發(fā)?。?］?！按蠹t鰓”是江蘇鹽城地區(qū)俗稱，其名稱的由來主要是因為患病魚鰓絲顏色如“西瓜樣”鮮紅，同時多伴有淡黃色腹水癥狀［2］。為切實了解該病流行情況，本實驗室前期對其在鹽城地區(qū)的發(fā)病經(jīng)過進行了初步調(diào)研。該病在水溫為20℃左右時最易暴發(fā)，而隨養(yǎng)殖溫度的升高，該病發(fā)生逐漸減少，溫度升高到30℃則無“大紅鰓”的出現(xiàn)。一般地，每年“大紅鰓”暴發(fā)時間基本為5月中旬至6月中旬，而本次“大紅鰓”病暴發(fā)時間為5月中旬至7月中旬。該病發(fā)病對象主要為異育銀鯽，是中國科學(xué)院水生生物研究所利用天然雌核發(fā)育技術(shù)經(jīng)人工授精繁育的一種鯽養(yǎng)殖新對象（目前已形成規(guī)?；B(yǎng)殖）［3］。2014年（去年）江蘇鹽城地區(qū)養(yǎng)殖異育銀鯽幾乎全年都暴發(fā)有“大紅鰓”，同時伴發(fā)有鯉皰疹病毒2型（CyHV-2）感染，推測是由于當?shù)厝ツ耆晁疁剌^低所致（基本沒有超過30℃）。一般情況下患“大紅鰓”癥狀的魚死亡率并不高，約在20%以下，且可用抗生素較好控制該病，但如不加以治療或錯誤用藥則會造成其死亡率大幅升高（據(jù)了解，單個150畝的養(yǎng)殖池塘最高可達每日5000—8000尾損魚量）?！按蠹t鰓”疾病已成為當?shù)伥a養(yǎng)殖業(yè)中的常發(fā)病，近年來已造成嚴重經(jīng)濟損失?，F(xiàn)有文獻認為該病病原為細菌、病毒和寄生蟲等綜合因素引起，但其確切病原至今不明［4］。本研究通過對本次“大紅鰓”患病魚的分子生物學(xué)、病理學(xué)和動物實驗的研究闡明了其致病病原，并分析了其致病機制，為鹽城地區(qū)鯽養(yǎng)殖業(yè)中“大紅鰓”疾病的防治奠定了一定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1病料樣品、主要試劑及實驗動物

江蘇鹽城患病異育銀鯽，體質(zhì)量250—300 g。健康異育銀鯽，體質(zhì)量250—350 g，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心提供。CyHV-2病毒粗提液由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心提供。普通瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）； 細菌生化微量鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司（批號：20150322）； 細菌基因組DNA提取試劑盒、動物組織DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA分子Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司； 藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司（批號：20150401）。

1.2細菌分離和生化鑒定

取患病魚腎臟組織樣品，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24h，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌群進行純化培養(yǎng)； 將純培養(yǎng)的菌再次劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)； 挑取單個菌落做革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)； 參照微量生化反應(yīng)管說明書鑒定分離菌純培養(yǎng)物。

1.3分子生物學(xué)診斷

以分離菌DNA為模板，gyrB基因的上、下游引物為：5′- GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA（TC）GC（TCAG）GG（TCAG）GG（TCAG）AA（AG）TT（TC）GA-3′/5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC（AG）TC（TCAG）AC（AG）TC（TCAG）GC（AG）TC（TC AG）GTCAT-3′。PCR擴增gyrB基因條件為：94℃5min； 94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 2min，30個循環(huán)；72℃ 5min。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程股份有限公司測序。測得序列通過NCBI中的BLAST進行相似性分析，NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

提取患病魚和健康魚的腎臟組織DNA。參考文獻［5］設(shè)計和合成CyHV-2的DNA聚合酶413 bp片段的上、下游引物：5′- AGTCCATAGTGTCTAGG AGCGA -3′/5′-AGTGTGTTTTACAGCGTTCTCG-3′。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5min； 94℃ 1min，54℃1min，72℃ 2min，30個循環(huán)； 72℃ 5min。PCR產(chǎn)物直接進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4人工感染實驗

細菌攻毒實驗：將分離純化細菌接種于BHI平板28℃培養(yǎng)36h后，經(jīng)0.65%無菌生理鹽水洗滌并配制成細菌懸液，分別稀釋成1×108、1×107和1×106cfu/ mL 3個濃度，腹腔注射健康異育銀鯽。注射劑量0.2 mL/尾，10尾/組，對照組注射等量無菌生理鹽水。在試驗期間水溫（23±1）℃，每天觀察及記錄實驗魚的癥狀和死亡情況，并對死亡魚或瀕死魚及時剖檢和分離細病原菌，連續(xù)觀察7d。

病毒攻毒實驗：選取暫養(yǎng)14d，250—300 g的健康異育銀鯽20尾，平均分成兩組，回歸感染組每尾腹腔注射病毒粗提液0.2 mL，對照組每尾腹腔注射過0.22 μm濾器的磷酸鹽緩沖液0.2 mL，試驗期間水溫（23±1）℃，統(tǒng)計死亡結(jié)果，觀察死魚癥狀，并隨機抽取組織勻漿組死魚和對照組魚開展PCR檢測。

1.5病理標本采集

觀察病魚體表，鰓絲以及內(nèi)臟器官等病理變化，并取患病魚鰓、肝、腎、脾，固定，脫水，石蠟包埋，HE染色，中性樹脂膠封片，Nikon E800顯微鏡觀察，拍照。

1.6藥敏試驗

采用紙片擴散法，病原菌接種BHI肉湯，28℃震蕩培養(yǎng)18—24h，參照麥氏比濁管調(diào)整菌液濃度1.5×108cfu/mL將菌液均勻涂布BHI平板，貼上藥敏紙片，28℃培養(yǎng)18—24h，測量抑菌圈大小并判定結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1發(fā)病魚癥狀

患病異育銀鯽食欲大幅下降，離群獨游，魚體黑瘦，鱗片松動，鰓部黏液增多，呈“西瓜樣”鮮紅色（圖1A），但鰓鮮紅的癥狀僅在魚體脫離水體后5—10min內(nèi)能觀察到，而后鰓絲顏色轉(zhuǎn)為暗紅。此外，其他魚體癥狀包括鰓蓋出血，鰭條尖發(fā)白（圖1B），部分患病魚腹腔內(nèi)有淡黃色腹水（圖1C），腎臟輕微腫大，充血，質(zhì)地柔軟，容易剝離（圖1D），部分患病魚的鰓絲上寄生有鰓孢子蟲（圖1C），部分患病魚腹腔內(nèi)有腹孢子蟲寄生（圖1F）。

圖1　患病魚典型癥狀Fig. 1　Typical symptom in diseased fish

2.2病原檢測

從鹽城地區(qū)5個大紅鰓疫點采集典型癥狀的垂死魚，病變組織涂片的革蘭氏染色可見革蘭氏陰性短桿菌（→）（圖2Ⅰ）。取樣于普通瓊脂平板上劃線，經(jīng)28℃恒溫培養(yǎng)24h獲得2株革蘭陰性短桿菌，暫定名為JSYC-1和JSYC-2。分離菌在普通瓊脂平板上形成邊緣整齊隆起、光滑半透明的灰白色圓形菌落； BHI平板上比普通平板上生長更好，菌落更大，呈淡黃色、半透明、光滑、邊緣整齊。光學(xué)顯微鏡下觀察分離菌為革蘭陰性短桿菌，散在排列，成熟的為桿狀，未成熟的為短桿狀，無芽胞（圖2Ⅱ）。腎臟組織切片HE染色后，可在腎間質(zhì)觀察到短桿狀細菌（→）（圖2Ⅲ）。兩株菌PCR擴增出的gyrB基因引物PCR擴增均獲得長度為1200 bp左右的片段，片段測序后上傳在GenBank中的登陸序號分別為KT724350和KT724351。兩菌株的gyrB基因同源性為93.26%，與GenBank的溫和氣單胞菌（GQ232760和GQ205451）同源性最高。選取了GenBank其中部分溫和氣單胞菌屬的細菌和常見氣單胞菌菌屬以及腸桿菌科細菌的gyrB基因序列，用Neighbor-Joining方法進行了系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果顯示，KT724350和KT724351兩菌株均與溫和氣單胞菌聚為一簇（圖2Ⅳ）。此外，CyHV-2的特異性PCR檢測結(jié)果表明，大紅鰓患病魚組織中不存在CyHV-2病毒（圖3）。

圖2　分離株形態(tài)及系統(tǒng)進化分析Fig. 2　Morphology of isolates and phylogenetic analysis

圖3　CyHV-2特異性PCR檢測Fig. 3　PCR detection of CyHV-2

2.3分離株生化鑒定

兩菌株均具有運動性； 氧化/發(fā)酵、氧化酶、MR-VP、苯丙氨酸脫氨酶、賴氨酸脫梭酶、硝酸鹽還原、吲哚、明膠液化、七葉靈、D-葡萄糖產(chǎn)氣、D-葡萄糖產(chǎn)酸、半乳糖、纖維二糖、海藻糖、半乳糖苷陽性； 鼠李糖、枸櫞酸鹽、精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫按酶、丙二酸、KCN、蜜二糖、棉籽糖、山梨醇、赤鮮醇、衛(wèi)矛醇、木糖、阿東醇、阿拉伯糖、乳糖陰性。兩株細菌鑒定結(jié)果符合氣單胞菌的特征。

2.4人工感染實驗

分離菌株和CyHV-2組織勻漿經(jīng)人工感染異育銀鯽后，均表現(xiàn)出較強致病力（表1）。健康異育銀鯽感染后可見同自然病例相似“大紅鰓”癥狀和剖解病變，對照組魚未表現(xiàn)任何癥狀，剖解亦無病變，鰓為正常暗紅色。同時，CyHV-2的組織勻漿組鯽雖然也有較高死亡率，但發(fā)病魚無“大紅鰓”癥狀，鰓仍然為正常暗紅色。此外，從人工感染發(fā)病死亡的異育銀鯽體內(nèi)再次分離細菌，獲得與攻毒分離株形態(tài)特征一致的菌株，并再次感染成功，證明所分離的細菌為異育銀鯽的致病菌。

表1　人工感染試驗結(jié)果Tab. 1　Artificial infection results of the isolated strains

2.5組織病理學(xué)觀察

肝臟中央靜脈淤血（圖4A），肝血竇中有炎性細胞浸潤（圖4B）； 脾臟未見明顯病理變化（圖4C）； 鰓絲嚴重增生（圖4D），鰓絲間出血，有大量規(guī)整血細胞聚集（→）（圖4E，F(xiàn)），部分鰓小片充血（→）（圖4G），鰓絲充血（→）（圖4H），甚至在鰓小片尖端形成血腫（→）（圖4I）； 腎臟腎小管上皮細胞發(fā)生顆粒變性或脂肪變性，腎小管中形成大量細胞和蛋白成分的各種管型（→），同時腎間質(zhì)區(qū)域內(nèi)存在大量炎性細胞（圖4J，K，L），集合管中也形成大量管型（→）（圖4M，N），腎靜脈有炎性細胞浸潤（→）（圖4P），腎小管中大量漿液性滲出物（→）（圖4P，Q，R）。

圖4　患病異育銀鯽組織病理變化Fig. 4　Histopathological changes of diseased Carassius auratus gibelio

2.6藥敏試驗

分離菌對23種抗生素的敏感性試驗結(jié)果見表2。兩分離株均對氧氟沙星、諾氟沙星、氯霉素三種抗生素敏感，同時都對苯唑西林、萬古霉素、氨芐西林、青霉素、克林霉素等抗菌藥物有耐藥性。

表2　分離菌株對抗菌藥物的敏感性Tab. 2　Chemotherapeutants sensitivities of the isolated strains

3　討論

3.1“大紅鰓”疾病的原發(fā)性病原

近年來，由于對江蘇地區(qū)異育銀鯽“大紅鰓”疾病重視程度不夠，關(guān)于該病的研究較少，其病原學(xué)問題至今不明，這一直是困擾當?shù)貜臉I(yè)者和學(xué)界的難題。在過去的經(jīng)驗中，“大紅鰓”患病魚組織DNA中往往都能不同程度地檢測到鯉皰疹病毒2型（CyHV-2）的陽性條帶，但同時也能分離出各種不同類型的細菌［6—9］。因此，“大紅鰓”疾病的病原學(xué)研究中最困難的一點就是要區(qū)分其病原是細菌還是病毒，或者需要明確這二者中哪一個是原發(fā)性因素，從而導(dǎo)致了另一個的繼發(fā)感染。本研究通過分子生物學(xué)診斷并結(jié)合前期流行病學(xué)調(diào)查以及后期回歸實驗綜合確認異育銀鯽的“大紅鰓”疾病病原為溫和氣單胞菌（A. sobria）。首先，分子水平的檢測表明患“大紅鰓”魚體中并不存在CyHV-2的拷貝，同時又能從當?shù)馗饕唿c患病魚體中分離到A. sobria； 其次，人工感染實驗表明雖然分離的A. sobria和含有CyHV-2的組織勻漿都能感染異育銀鯽并產(chǎn)生較高致死率，但是僅A. sobria能引起患病魚產(chǎn)生“大紅鰓”的癥狀，而病毒勻漿卻不能復(fù)制出該癥狀； 最后，從流行情況分析，這兩種病原雖然都在鹽城地區(qū)流行，但是二者的流行經(jīng)過和發(fā)病條件卻相差較大。綜合以上結(jié)果，本研究判定“大紅鰓”患病魚的原發(fā)性病原為A. sobria。雖然張曉君等［10］報道了A. sobria能感染異育銀鯽并檢測了其相關(guān)致病因子。但是A. sobria仍然是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的一種重要的條件致病菌［11，12］，具體是何因素誘發(fā)了該菌感染異育銀鯽并引起“大紅鰓”的癥狀還需要進一步研究。

3.2細菌感染的病理學(xué)機制

本實驗病理學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)，A. sobria感染異育銀鯽后主要損傷魚體鰓和腎臟，從而嚴重破壞魚體呼吸系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，從而有利于該病原的進一步感染和增殖。其中，鰓部病理觀察發(fā)現(xiàn)，鰓嚴重增生，鰓小片和鰓絲內(nèi)部個別區(qū)域有血腫形成，鰓小片間未見出血現(xiàn)象，但在鰓絲之間可見大量規(guī)整的紅細胞聚集，這說明鰓絲之間有較大的出血區(qū)域，這也表明“大紅鰓”的表觀癥狀正是由鰓絲之間的大出血導(dǎo)致。同時鰓部病變也為其繼發(fā)感染鰓孢子蟲和腹孢子蟲等創(chuàng)造了條件。在病理條件下，腎臟濾出的蛋白質(zhì)以及細胞或碎片在腎小管（遠曲）、集合管中凝固后，可形成圓柱形蛋白聚體，稱為管型。本研究中的患病魚腎臟間質(zhì)區(qū)域內(nèi)大量炎性細胞浸潤，腎小管中形成大量炎性細胞管型和蛋白管型，表明A. sobria會嚴重損傷腎實質(zhì)和腎小管，從而破壞魚體特異性免疫系統(tǒng)，其與徐敬鈞等［13］報道的A. sobria感染似鲇高原鰍的病例癥狀相符。所以，A. sobria感染的的異育銀鯽鰓部非特異防御能力和特異性免疫能力均受重創(chuàng)，為其繼發(fā)感染其他類型的細菌或病毒創(chuàng)造了條件。這也同樣佐證了臨床分離病原中存在多種細菌和病毒的現(xiàn)象。

3.3藥物敏感試驗

藥敏實驗分析發(fā)現(xiàn)2株A. sobria均對沙星類藥物和氯霉素敏感?？紤]到，氯霉素毒性較大且為禁用抗生素，所以臨床用藥建議選擇沙星類藥物毒性較低的抗生素進行緊急治療。

本研究對江蘇鹽城地區(qū)異育銀鯽“大紅鰓”大面積流行的病因做出了準確診斷，為該地區(qū)魚病預(yù)防和合理用藥提供了新的思路。同時，本研究通過組織病理學(xué)指出了異育銀鯽自然感染A. sobria后的發(fā)病機理，為A. sobria致病機理的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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ETIOLOGY INVESTIGATION AND HISTOPATHOLOGICAL STUDY ON “REDGILL” OF SILVER PRUSSIAN CARP（CARASSIUS AURATUS GIBELIO） IN YANCHENG CITY

LIU Tao1，WANG Kai-Yu1，2，CHEN Jun-Jie1，LIU Tian-Qiang3，LI Mao3，KANG Yue-Hua3，DUAN Jing1and HE Yang1
（1. Fisheries Department of Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China； 2. Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China； 3. Tongwei Animal Health Research Institute，Chengdu 610000，China）

Two Aeromonas sobria isolates，isolated from cultured Carassius auratus gibelio during an outbreak of mass mortality in Yancheng city of China，were identified to the species level by phylogenetic analysis based on gyrB gene and biochemical tests. The isolates were identified to be the pathogeny of “Red-Gill” through investigating for the virulence of bacteria by recurrent tests and histopathology. We also described the macroscopic and microscopic lesions in Carassius auratus gibelio naturally infected with A. sobria. Our findings confirmed that the 2 isolates，rather than cyprinid herpesvirus 2，were the primary pathogen of “Red-Gill” disease and damaged the immune system in Carassius auratus gibelio. The results of drug sensitivity tests showed that the bacterial isolates was sensitive to ofloxacin，chloromycetin and norfloxacin； While，resistant to oxacillin，vancomycin，ampicillin，penicillin，clindamycin etc. Together，our findings demonstrate the pathogenesis of Aeromonas sobria in Carassius auratus gibelio and establish the foundation for “Red-Gill” in cultured Carassius auratus gibelio.

Carassius auratus gibelio； Aeromonas sobria； Red-Gill； CyHV-2； Histopathology

S941.41

A

1000-3207（2016）05-0928-07

10.7541/2016.120

2015-09-14；

2016-01-20

教育部《長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃》創(chuàng)新團隊項目（IRT0848）資助 ［Supported by the Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Teams in the Sichuan Agricultural University（No. IRT0848）］

劉韜（1989—），男，四川德陽人； 碩士研究生； 主要從事細菌分子生物學(xué)研究。E-mail：liutao1232123@163.com

汪開毓，E-mail：kywang1955@126.com