羅氏沼蝦幼體精氨酸激酶基因的cDNA克隆及其在雙順反子病毒感染后的表達特征

田　榮　許　婷　潘曉藝　沈錦玉，

（1. 溫州醫(yī)科大學(xué)，溫州 325000； 2. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所，湖州 313001）

羅氏沼蝦幼體精氨酸激酶基因的cDNA克隆及其在雙順反子病毒感染后的表達特征

田榮1許婷2潘曉藝2沈錦玉1，2

（1. 溫州醫(yī)科大學(xué)，溫州 325000； 2. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所，湖州 313001）

為探求羅氏沼蝦精氨酸激酶（Macrobrechium rosenbergii arginine kinase，MrAK）基因特征和與病毒感染的相關(guān)性，研究通過AK基因mRNA全長克隆，并采用QPCR檢測病毒感染前后不同時間點羅氏沼蝦幼體AK基因的轉(zhuǎn)錄差異。最終克隆得到的AK序列全長為1740 bp（GenBank：KT970484），其開放閱讀框包含1068個堿基，編碼356個氨基酸； 同源性分析顯示MrAK基因編碼區(qū)蛋白與多齒新米蝦、南極磷蝦、鮭魚海虱和安氏偽鏢水蚤的同源性分別為97%、82%、83%和79%； 系統(tǒng)進化樹分析表明，該基因與多齒新米蝦的AK聚在同一分支簇，而蟹、對蝦和螯蝦聚在另一分支； 氨基酸結(jié)構(gòu)分析表明，其存在一個可能的ATP：胍基磷酸轉(zhuǎn)移酶的活性位點（Cys286-Pro287-Thr288-Asn289-Leu290-Gly291-Thr292）； 病毒感染羅氏沼蝦幼體后，其AK基因表達在第9h開始出現(xiàn)顯著性上調(diào)，在12h時達到峰值，隨后開始降低。以上研究結(jié)果表明，AK基因在無脊椎甲殼動物中存在多樣性，其蛋白結(jié)構(gòu)存在保守性，并且其在羅氏沼蝦病毒感染過程中起到潛在的能量供給調(diào)節(jié)作用。

羅氏沼蝦；雙順反子病毒；精氨酸激酶；mRNA表達

羅氏沼蝦（Macrobrechium rosenbergii）又名馬來西亞大蝦，淡水長臂大蝦，是世界上最大型的淡水蝦之一。我國自1976年引進此蝦，現(xiàn)已廣泛養(yǎng)殖于廣東、廣西、湖南、湖北、江蘇、上海、浙江等十多個省市自治區(qū)，具有巨大的經(jīng)濟效益，其中浙江省是主要苗種養(yǎng)殖區(qū)之一。但是近幾年，我國羅氏沼蝦苗種培育過程中出現(xiàn)大規(guī)模死亡現(xiàn)象，給羅氏沼蝦育苗產(chǎn)業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失。2010年和2011年，90%以上的羅氏沼蝦育苗場因幼體相繼感染發(fā)病而停產(chǎn)，給羅氏沼蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成致命打擊。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)“羅氏沼蝦雙順反子病毒”為該病主要病原之一［1］，進化分析表明該病毒與桃拉綜合癥病毒（Taura syndrome virus，TSV）標(biāo)準(zhǔn)株（AF277675）具有較高同源性，和其他己知的雙順反子病毒科病毒也存在一定同源性。雙順反子病毒主要感染昆蟲綱的半翅目、膜翅目、雙翅目、鱗翅目、直翅目和甲殼綱的十足目，包括蜜蜂、蚜蟲、玻璃翅葉蟬、果蠅、紅火蟻、對蝦和鋸緣青蟹等［2］。

目前關(guān)于雙順反子病毒感染機制的研究較少，Cherry等［3］利用DCV 感染模式動物果蠅，發(fā)現(xiàn)雙順反子病毒可通過clathrin 介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細(xì)胞。關(guān)于羅氏沼蝦雙順反子病毒的研究主要集中于組織病理學(xué)，快速檢測及診斷技術(shù)等方面，而羅氏沼蝦雙順反子病毒感染機制未見報道，采用RTPCR和RT-LAMP技術(shù)，羅氏沼蝦雙順反子病毒快速檢測方法已建立［4］。

精氨酸激酶（Arginine Kinase，AK）作為磷酸原激酶家族的一員，主要分布于無脊椎動物體內(nèi)，調(diào)節(jié)無脊椎動物體內(nèi)磷酸精氨酸與ATP之間的能量平衡、代謝、儲存和利用具有重要作用［5，6］。當(dāng)無脊椎動物能量產(chǎn)生較多時，AK通過MgATP催化可逆磷酸化精氨酸，形成磷酸精氨酸和MgADP，從而在細(xì)胞活動暴發(fā)需要能量時，AK又將磷酸精氨酸分解產(chǎn)生ATP，這類似于脊椎動物中的肌酸激酶反應(yīng)［7］。目前，已在多種甲殼類動物中克隆得到精氨酸激酶基因，包括多齒新米蝦（Neocaridina denticulata）、南極磷蝦（Euphausia superba）、鮭魚海虱（Lepeophtheirus salmonis）和安氏偽鏢水蚤（Pseudodiaptomus annandalei）等。對于精氨酸激酶是否能在羅氏沼蝦幼體抗雙順反子病毒過程中起到能量供給的調(diào)節(jié)作用，目前尚沒有研究報道。

本研究通過對羅氏沼蝦雙順反子病毒刺激前后的羅氏沼蝦幼體構(gòu)建抑制性消減雜交文庫，驗證篩選基因，并從中篩選獲得與潛在免疫反應(yīng)相關(guān)的精氨酸激酶基因進行研究。在篩選得到AK基因EST序列的基礎(chǔ)上，通過RACE PCR技術(shù)獲得其cDNA全長，并對其進行了序列分析、功能預(yù)測和同源性比對，在此基礎(chǔ)上，使用Realtime-PCR技術(shù)檢測雙順反子病毒感染羅氏沼蝦幼體的表達變化情況，以探求AK在羅氏沼蝦幼體的抗病毒感染中的潛在作用。

1　材料與方法

1.1羅氏沼蝦病毒感染

取4500尾左右的羅氏沼蝦7日齡（發(fā)育第四幼體期）健康幼體（經(jīng)檢測雙順反子病毒為陰性），分成3個組別，即實驗組、陰性對照組和空白對照組； 每個組別分3個平行組，每組幼體500尾左右。實驗組為浸泡感染雙順反子病毒后的幼體，陰性對照組為浸泡感染健康羅氏沼蝦幼體提取的上清后的幼體，空白對照組為未浸泡感染的幼體。感染方法：在30℃提取液中浸泡感染10min后，暫養(yǎng)在4 L的海水里，養(yǎng)殖溫度為30℃，加氧氣泵供氧，隨后分別于0、3h、6h、9h、12h、24h和48h采集每個組的幼體約20尾，移入液氮保存。

1.2總RNA提取和雙鏈cDNA合成

采用TRizol法提取羅氏沼蝦幼體中總RNA，用Thermo Nano Drop 2000和2000c分光光度計定量，確保提取的RNA A260/A280在1.8—2.0，并用變性瓊脂糖凝膠電泳證實其結(jié)構(gòu)完整。按照PrimeScript reagent Kit（TaKaRa）操作說明進行反轉(zhuǎn)錄，用于熒光定量，反轉(zhuǎn)錄cDNA均稀釋10倍。反轉(zhuǎn)錄體系為：5×PrimeScript Buffer，2 μL； PrimeScript RT Enzyme Mix I，0.5 μL； OligodT Primer（50 μmol/L），0.5 μL；Random 6 mers（100 μmol/L），0.5 μL； Total RNA，500 ng； RNase Free H2O加至 10 μL。反應(yīng)條件為：37℃，15min，85℃，5s。

1.3羅氏沼蝦AK基因全長cDNA序列克隆

3′，5′-RACE cDNA的合成方法參照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit說明書進行。利用Primer Premier 5.0 引物軟件，參考篩選得到的EST序列，分別設(shè)計3′和 5′RACE的內(nèi)引物。引物交由南京金斯瑞生物公司合成，引物序列見表1。PCR產(chǎn)物目的條帶通過膠回收法進行純化。此過程按照TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。再進行TA克隆，選陽性克隆測序。

1.4羅氏沼蝦AK基因進化分析及三維結(jié)構(gòu)分析

將獲得的羅氏沼蝦AK基因全長cDNA序列與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析（http：// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）。同時將cDNA序列開放閱讀框（Open reading flame，ORF）翻譯成氨基酸序列后，用MEGA6.0軟件對其氨基酸序列進行多重比對和同源性分析。將獲得的羅氏沼蝦AK和其他物種AK的氨基酸序列進行比對，然后用MEGA6.0軟件中Neighbor-Joining Tree繪制系統(tǒng)進化樹。

采用SWISS-MODEL軟件對羅氏沼蝦AK進行蛋白特征和結(jié)構(gòu)預(yù)測，并與家蠶及果蠅的AK進行結(jié)構(gòu)對比。

1.5羅氏沼蝦AK基因表達分析

AK定量檢測引物和內(nèi)參引物見表1，按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒操作，使用real-time PCR儀（STRATA GENE，Mx3005P）進行實時定量PCR反應(yīng)。程序為兩步法，第一步95℃預(yù)變性30s，第二步95℃變性5s，63℃延伸30s，第二步循環(huán)40次。驗證PCR產(chǎn)物擴增特異性由融解曲線（55—95℃）來鑒定。選用β-actin作為內(nèi)參基因。應(yīng)用2-ΔΔCt法確定AK基因mRNA表達量［8］。用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS17.0中的單向方差分析法（ANOVA）進行分析，當(dāng)P＜0.05時，差異顯著。

表1　引物序列Tab. 1　Sequence of primers

2　結(jié)果

2.1羅氏沼蝦AK基因全長序列的克隆和特征分析

采用RACE PCR技術(shù)擴增其 5′端和3′端（引物見表1）。經(jīng)過序列拼接及驗證后獲得AK全長序列，提交GenBank（序列號KT970484）。AK基因全長1740 bp，5′端非編碼區(qū)（UTR）為102 bp，3′端非編碼區(qū)（UTR）為570 bp，含有完整的Poly A加尾序列AATAA。開放閱讀框（ORF）全長1068 bp，編碼356個氨基酸，預(yù)測分子量約為39 kD，等電點（PI）約為 6.17。但不含信號肽和跨膜區(qū)。使用ExPASy軟件對羅氏沼蝦AK預(yù)測蛋白進行結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測，結(jié)果顯示該基因包含一個ATP：胍基磷酸轉(zhuǎn)移酶的活性位點（Cys286-Pro287-Thr288-Asn289-Leu290-Gly291-Thr292），6個蛋白激酶C磷酸化位點和6個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（63S-Y-K-D66；89S-D-M-E92；157T-G-M-D160；270S-G-K-D273；304T-R-G-E307和327S-EV-E330）。

2.2同源性及進化樹分析

Blastx結(jié)果顯示該基因與目前已報道的相關(guān)AK序列高度同源，選取部分GenBank中的甲殼類動物AK序列進行比對，用clustal X 1.8軟件對其進行核苷酸同源性比對分析，結(jié)果顯示羅氏沼蝦AK與其他甲殼動物的AK相似性較高，與所選的基因相似度為79%—97%，其中與多齒新米蝦（Neocaridina denticulata）同源性最高，為97%。

根據(jù)同源性比對結(jié)果，使用MEGA6.0軟件構(gòu)建進化樹（圖1），結(jié)果顯示，羅氏沼蝦（HQ191218）的AK與多齒新米蝦（AB472045）的AK首先聚類在一起，然后與魚虱的AK聚類在一起，這3個物種的AK與水蚤并列形成一個大的分支，而蟹、對蝦和螯蝦的AK基因聚為另一大分支。在分類上，從亞目層次來說，關(guān)系不大； 和科的關(guān)系更為密切。蟹屬于腹胚亞目下面的蟹科，聚成分支A1； 對蝦屬于枝鰓亞目下面的對蝦科，聚成分支A2； 鰲蝦屬于腹胚亞目下面的鰲蝦科，聚成分支A3； 大型溞屬于溞科，聚成分支A4，這4個分支聚成一個大的分支。水蚤屬于水蚤科，聚成分支B1； 魚虱屬于魚虱科，聚成分支B2； 沼蝦屬于長臂蝦科，聚成分支B3，這3個聚成一個大的分支，最終構(gòu)成了一個進化樹。這說明AK在目分類級別上呈現(xiàn)多樣性，在科分類級別上呈現(xiàn)保守性。

圖1　用MEGA6.0軟件構(gòu)建的AK系統(tǒng)進化樹Fig. 1　AK phylogenetic tree constructed by MEGA6.0 software

2.3羅氏沼蝦AK蛋白結(jié)構(gòu)分析及比對

采用空間結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件SWISS-MODEL對獲得的羅氏沼蝦AK空間結(jié)構(gòu)進行預(yù)測（圖2）。羅氏沼蝦（KT970484）AK與果蠅（NP_729446）及家蠶（DQ272299）的AK的空間結(jié)構(gòu)非常的相似。根據(jù)SWISS-MODEL軟件分析得出：羅氏沼蝦AK由一個小的全α-螺旋的N端結(jié)構(gòu)域和一個大的C端結(jié)構(gòu)域組成：8-股反平行β-折疊被7個α-螺旋包繞著。同樣，果蠅和家蠶AK都是由一個小的全α-螺旋的N端結(jié)構(gòu)域和一個大的C端結(jié)構(gòu)域組成：8-股反平行β-折疊被6個α-螺旋包繞著［9］。

圖2　羅氏沼蝦、果蠅和家蠶的AK空間預(yù)測結(jié)構(gòu)的比較Fig. 2　Comparison of M. rosenbergii，D. melanogaster and B. mori AK spatial structure prediction

2.4羅氏沼蝦AK基因在不同時間的mRNA表達差異

為了探討羅氏沼蝦AK基因在羅氏沼蝦幼體抗雙順反子病毒感染中的作用，使用QPCR技術(shù)檢測羅氏沼蝦AK基因在雙順反子病毒感染羅氏沼蝦幼體不同時間段（0—48h） mRNA的表達變化譜。結(jié)果如圖3顯示，雙順反子病毒感染羅氏沼蝦幼體后9h、12h和24h表達量顯著上調(diào)，其中感染后 12h表達量達到峰值，為陰性對照組的7.7倍（P＜0.05）。而在感染后的3h、6h和48h，變化不顯著。

圖3　熒光PCR檢測Mr AK基因在不同時間的相對表達水平Fig. 3　Relative expression of M. rosenbergii AK gene in different time by Realtime-PCR

3　討論

羅氏沼蝦是我國重要的淡水養(yǎng)殖蝦類品種之一，但是近年來病害頻發(fā)，尤其是育苗產(chǎn)業(yè)，自2010年始暴發(fā)羅氏沼蝦幼體綜合癥，研究表明其主要病原之一為羅氏沼蝦雙順反子病毒。羅氏沼蝦是無脊椎動物，不具備獲得性免疫?？共≡腥局饕蕾囉谔烊幻庖?，包括天然體液免疫和天然細(xì)胞免疫［10］。因此，篩選獲得其免疫抗病相關(guān)細(xì)胞因子進行深入研究意義尤為重大。

本研究從羅氏沼蝦中克隆得到了AK基因，其全長1740 bp，可以編碼356個氨基酸。通過BLAST同源性及多序列比對分析可以發(fā)現(xiàn)，羅氏沼蝦AK基因和其他物種的AK基因同源性比較高，與安氏偽鏢水蚤、多齒新米蝦、南極磷蝦、鮭魚海虱等AK基因的同源性均在75%以上。系統(tǒng)進化樹顯示羅氏沼蝦AK與多齒新米蝦緊密聚為一支，與蟹及對蝦類親緣關(guān)系也相近。其蛋白空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測與果蠅、家蠶非常相似。羅氏沼蝦、多齒新米蝦、鮭魚海虱等相較于其他動物多出來的氨基酸（AESGKD），在結(jié)構(gòu)上的影響是少了一個β折疊，但不在活性中心。雖然在氨基酸序列上呈現(xiàn)多樣性，但是氨基酸的變化區(qū)域都沒有出現(xiàn)在AK的活性位點上，說明AK基因在保持多樣性的同時在其三維結(jié)構(gòu)上保持高度保守和一致的。

在本研究中，為了探討AK基因在羅氏沼蝦幼體抗雙順反子病毒感染中的作用，使用熒光定量PCR技術(shù)對雙順反子病毒感染后不同時間，羅氏沼蝦幼體中AK基因表達進行研究，結(jié)果表明在感染后0、3h和6h的時候，表達沒有顯著性差異（P＞0.05），隨后表達量顯著上調(diào)，在12h達到峰值，接著開始下降，到感染后48h回歸到初始水平。該結(jié)果說明羅氏沼蝦AK基因在羅氏沼蝦幼體抗雙順反子病毒過程中起到能量供給的調(diào)節(jié)作用。

本研究在分析羅氏沼蝦EST 基礎(chǔ)上，利用5′RACE法克隆了羅氏沼蝦AK cDNA全長，發(fā)現(xiàn)其AK 酶活性中心功能域氨基酸序列與其他無脊椎動物精氨酸激酶完全一致。精氨酸激酶一般都具有7個氨基酸殘基序列（CPTNLGT）組成的酶活性中心區(qū)域，由半胱氨酸殘基（C）組成的酶活性中心位點［11，12］，這些功能位點具有高度保守性，因此精氨酸激酶在不同甲殼動物中的功能也是高度保守的［13］； 以及具有能形成離子偶結(jié)構(gòu)的2個氨基酸殘基Asp 和Arg的典型特征，該離子偶結(jié)構(gòu)對于精氨酸激酶的活性具有重要作用［14，15］。

精氨酸激酶在能量代謝中的作用已經(jīng)得到廣泛證實，最近的研究發(fā)現(xiàn)，它還與機體的病原識別、免疫反應(yīng)［16—22］等多種重要的生理過程密切相關(guān)。在甲殼動物中，姚翠鸞等［23］通過用LPS感染凡納濱對蝦，隨后進行RT-PCR實驗，發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦體內(nèi)的AK基因和其免疫反應(yīng)相關(guān)； 曾勇等［24］通過對蝦白斑綜合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）感染鰲蝦，發(fā)現(xiàn)鰲蝦體內(nèi)的AK通過產(chǎn)生ATP，提供能量抵御病害的入侵； 還有一些研究者通過對對蝦免疫調(diào)控機理進行研究，發(fā)現(xiàn)在受到免疫多糖和病原刺激后，對蝦體內(nèi)的精氨酸激酶表達量發(fā)生了明顯變化［23］。 本研究表明，羅氏沼蝦體內(nèi)精氨酸激酶的表達的確受雙順反子病毒感染的影響，可能參與羅氏沼蝦幼體抗雙順反子病毒相關(guān)反應(yīng)，是重要的羅氏沼蝦抗雙順反子病毒感染相關(guān)細(xì)胞因子，為進一步深入研究羅氏沼蝦和雙順反子病毒感染相互關(guān)系及其抗感染機制奠定基礎(chǔ)，但是具體相互關(guān)系需要進行進一步的研究。

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ARGININE KINASE GENE OF MACROBRACHIUM ROSENBERGII LARVAE CDNA CLONING AND ITS CHARACTERISTIC EXPRESSION RESEARCH AFTER DICISTRO VIRUS INFECTION

TIAN Rong1，XU Ting2，PAN Xiao-Yi2and SHEN Jin-Yu1，2
（1. Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China； 2. Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries，Huzhou 313001，China）

The current study reported the identification and characterization of arginine kinase（AK） of shrimp Macrobrechium rosenbergii（denoted as MrAK）. The full length cDNA（1740 bp） of MrAK was identified by SSH cDNA library construction and RACE approaches. Its open reading frame（ORF） was 1068 bp encoding a polypeptide of 355 amino acids. The deduced amino acid of MrAK had a potential ATP：guanidine phosphotransferases active site：（Cys286-Pro287-Thr288-Asn289-Leu290-Gly291-Thr292）. Homology analysis showed that the putative MrAK shared 97%，82%，83% and 79% identities with AKs from Neocaridina denticulata，Euphausia superba，Lepeophtheirus salmonis，and Pseudodiaptomus annandalei，respectively. The phylogenetic tree analysis indicated that MrAK was similar to invertebrate AK，suggesting it has high evolutional conservation. Moreover，the expression of MrAK significantly up-regulated at 9h post-MrDV（M. rosenbergii dicistrovirus） immune challenge and reached peak level at 12h post-challenge. These findings suggest that MrAK might involve in host defense system against MrDV infection.

Macrobrachium rosenbergii； Dicistrovirus； Arginine kinase； mRNA expression

Q344+.1

A

1000-3207（2016）05-0908-06

10.7541/2016.117

2016-01-26；

2016-04-15

國家自然科學(xué)基金（2013skj002）； 農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項（20111103034）； 浙江省自然科學(xué)基金（LY12C19007）資助 ［Supported by the National Natural Science Foundation of China（2013skj002）； Special Research for Agro-scientific Research in the Public Interest（20111103034）； the Natural Science Foundation of Zhejiang Province（LY12C19007）］

田榮（1990—），女，江蘇南京人； 碩士研究生； 研究方向為水產(chǎn)動物病害研究。E-mail：1109787594@qq.com

沈錦玉，女，研究員； E-mail：sjinyu@126.com