不同ELISA試劑盒檢測(cè)豬瘟病毒抗體的比較分析

周美君/重慶市涪陵區(qū)李渡街道畜牧獸醫(yī)站

不同ELISA試劑盒檢測(cè)豬瘟病毒抗體的比較分析

周美君/重慶市涪陵區(qū)李渡街道畜牧獸醫(yī)站

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是 由 豬 瘟 病 毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)的病毒性疾病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為A類動(dòng)物傳染病，我國也將此病列為一類動(dòng)物疫病，2005年發(fā)布的新版《陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典》將豬瘟列入OIE規(guī)定必須通報(bào)疾病名錄，是我國發(fā)生最多、危害最大、流行最廣的動(dòng)物傳染病之一。然而就目前的研究來說，還沒找到一種方法完全把豬瘟完全根除?，F(xiàn)在世界范圍內(nèi)對(duì)該病的防制主要是采用強(qiáng)制免疫、禁運(yùn)、撲殺、消毒、封鎖等措施，而免疫接種是最主要的也是最經(jīng)濟(jì)的防控措施。近年來，由于我國采取了豬瘟強(qiáng)制免疫的預(yù)防措施，我國豬瘟的流行和發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了很大的變化，逐步轉(zhuǎn)變?yōu)殡[性感染和亞病毒感染，在臨床上表現(xiàn)也更加復(fù)雜，大規(guī)模的暴發(fā)流行基本停止，出現(xiàn)了所謂“非典型豬瘟”，“溫和型豬瘟”，“帶毒母豬綜合征”以及“新生仔豬的免疫耐受”等病例，在病理剖檢上也出現(xiàn)了不同于典型豬瘟的病理變化，這些改變就導(dǎo)致了獸醫(yī)工作者在臨床上根據(jù)臨床表現(xiàn)和病理變化很難對(duì)豬瘟做出確診，針對(duì)豬瘟流行的新特點(diǎn)，對(duì)豬瘟的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)要求也越來越高，準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷方法對(duì)于預(yù)防和控制豬瘟都有重要意義。

隨著疫苗免疫的廣泛應(yīng)用，疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)就顯得十分重要。目前，常見的豬瘟診斷方法分為血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷，其中血清學(xué)診斷方法包括瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）、熒光抗體試驗(yàn)（FAT）、間接血凝試驗(yàn)（IHA）、中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和免疫膠體金技術(shù)（IGSS）；分子生物學(xué)方法包括RT-PCR技術(shù)和核酸探針技術(shù)。而血清學(xué)診斷方法以其使用方便、一次性檢測(cè)量大、血清容易采集保存等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，特別是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)在豬瘟流行狀態(tài)的監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查等方面有著重要的作用，同時(shí)也是免疫豬群抗體水平監(jiān)測(cè)的主要方法，對(duì)疫苗免疫效果評(píng)價(jià)及免疫程序的制定均具有重要意義。但由于每種試劑盒的特異性和敏感性不同，用不同的試劑盒檢測(cè)時(shí)其抗體的阻斷率會(huì)出現(xiàn)差異。

本研究采用市面上常見的兩種豬瘟抗體檢測(cè)ELISA試劑盒對(duì)重慶市涪陵區(qū)農(nóng)村散養(yǎng)生豬豬瘟抗體進(jìn)行檢測(cè)，以明確不同試劑盒之間的敏感性和特異性，從而為以后針對(duì)性的選擇使用試劑盒提供依據(jù)。

一、材料與方法

（一）材料

1.試驗(yàn)試劑盒。進(jìn)口阻斷ELISA試劑盒，美國IDEXX公司生產(chǎn)；豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品。

2.血清來源。4 000份血清均為2014年采自重慶市涪陵區(qū)各鄉(xiāng)鎮(zhèn)農(nóng)村散養(yǎng)戶（一是疫苗相同，均是政府統(tǒng)一采購疫苗由鄉(xiāng)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站免疫；二是免疫程序一致，均是商品豬28日齡首免，58日齡二免，種豬春秋防集中免疫）。

（二）方法

1.重復(fù)性試驗(yàn)。在4 000份血清樣品中隨機(jī)抽取一份，分別采用兩種抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)其進(jìn)行豬瘟抗體檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置5個(gè)平行試驗(yàn)孔以檢測(cè)其重復(fù)性。操作方法嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。

2.兩種試劑盒檢測(cè)豬瘟抗體陽性率對(duì)比試驗(yàn)。隨機(jī)抽取2 000份血清用美國IDEXX公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行豬瘟抗體檢測(cè)，另外2 000份血清用中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行豬瘟抗體檢測(cè)，

3.操作方法。均嚴(yán)格按照ELISA試驗(yàn)診斷試劑盒中操作說明書進(jìn)行，最終判斷去陰陽性。

二、結(jié)果與分析

（一）重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

采用兩種試劑盒檢測(cè)同一份血清抗體結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，用兩種不同的試劑盒對(duì)豬瘟抗體進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)時(shí)，同一個(gè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果均一致，數(shù)據(jù)具有極高的重復(fù)性，但是兩個(gè)不同試劑盒之間的結(jié)果具有顯著性差異。

表1　兩種試劑盒檢測(cè)豬瘟抗體重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表2　豬瘟抗體檢測(cè)陽性率結(jié)果

（二）兩種試劑盒檢測(cè)豬瘟抗體陽性率對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

利用兩種不同試劑盒對(duì)豬瘟抗體進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果見表2。從表中可看出，采用中監(jiān)所試劑盒檢測(cè)豬瘟抗體的平均陽性率明顯高于采用IDEXX試劑盒的檢測(cè)結(jié)果，二者之間具有顯著性差異。

三、討論

本試驗(yàn)通過對(duì)4 000份生豬血清豬瘟抗體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中監(jiān)所的試劑盒的檢測(cè)結(jié)果陽性率明顯高于美國IDEXX的試劑盒，在本試驗(yàn)中，由于樣本選擇量大，所檢測(cè)的血清均是采用的政府統(tǒng)一采購疫苗，經(jīng)鄉(xiāng)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站統(tǒng)一免疫后的生豬血清，未注射過其他廠家的豬瘟疫苗，且所有免疫程序均一致，受到其他疫苗的干擾作用也一致。分析原因主要有以下幾點(diǎn)：

1.美國IDEXX公司生產(chǎn)的ELISA豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒為單克隆抗體阻斷ELISA方法，它所用的抗原是通過基因工程的方法生產(chǎn)的，純度高，所用的單抗針對(duì) E2蛋白，檢測(cè)E2抗體。但它只能識(shí)別豬瘟兩個(gè)位點(diǎn)中的一個(gè)，它所檢測(cè)的是豬瘟病毒特異性抗體，且抗原為原核表達(dá)產(chǎn)物，檢測(cè)特異性高，檢測(cè)敏感性受到單抗檢測(cè)范圍限制，影響檢測(cè)敏感性，因此檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)假陰性，特別是對(duì)免疫逃逸豬瘟病毒株的抗體檢測(cè)存在缺陷，不適合抗體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和免疫效果評(píng)價(jià)，但該種試劑盒可以區(qū)分牛病毒性腹瀉性病毒和邊界病，可以在引種監(jiān)測(cè)和個(gè)體淘汰中廣泛應(yīng)用。

2.中監(jiān)所生產(chǎn)的ELISA豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒為間接ELISA檢測(cè)方法，是以表達(dá)的E2蛋白作為ELISA包被抗原建立的間接ELISA方法檢測(cè)豬瘟抗體，敏感性較高，可作為豬群抗體檢測(cè)評(píng)價(jià)的首選檢測(cè)方法，但操作時(shí)需要避免假陽性的出現(xiàn)。

3.美國IDEXX公司的試劑盒成本高，而中監(jiān)所的試劑盒相對(duì)而言價(jià)格實(shí)惠，因此在具體選擇試劑盒時(shí)應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況加以靈活應(yīng)用，特別是對(duì)基層來說，這不僅能夠保證免疫監(jiān)測(cè)工作的完成，且能夠?yàn)榉乐曝i瘟的暴發(fā)提供可靠的依據(jù)，還可以解決實(shí)際供應(yīng)緊張等問題。但是一個(gè)地區(qū)在進(jìn)行疫病的免疫監(jiān)測(cè)時(shí)，為了更好的掌握疫苗免疫效果最好不要經(jīng)常變換檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒，相對(duì)穩(wěn)定的檢測(cè)方法有利于該地區(qū)的豬場(chǎng)和散養(yǎng)農(nóng)戶建立檔案資料，為指導(dǎo)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。所以我們要合理的選用試劑盒，更好的為生產(chǎn)服務(wù)。

（略）