等溫滴定量熱法測(cè)定酶催化反應(yīng)的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)

彭尚，孫麗霞，熊珍愛，周利琴，蘭雄雕，孫建華，童張法，廖丹葵

（廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西高校資源化工應(yīng)用新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004）

等溫滴定量熱法測(cè)定酶催化反應(yīng)的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)

彭尚，孫麗霞，熊珍愛，周利琴，蘭雄雕，孫建華，童張法，廖丹葵

（廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西高校資源化工應(yīng)用新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004）

采用等溫滴定量熱法（ITC）測(cè)定豬肺血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）催化水解其體外模擬底物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）反應(yīng)的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)，考察了溫度對(duì)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。結(jié)果表明，該反應(yīng)的摩爾水解焓ΔHhydr為正值，是吸熱反應(yīng)，且隨溫度升高ΔHhydr增大，等壓比熱容cp為0.2126kJ/（mol·K）；ACE催化HHL的水解反應(yīng)符合Michaelis-Menten機(jī)理，在實(shí)驗(yàn)溫度范圍內(nèi)（298.15～313.15K），米氏常數(shù)Km隨溫度升高而減小，催化常數(shù)kcat隨溫度的升高先增大后減少，在308.15K時(shí)達(dá)到最大值2.534s-1。將該法與傳統(tǒng)的初始速率法進(jìn)行比較，傳統(tǒng)法存在的局限性使測(cè)得的Km相對(duì)偏大。同時(shí)使用ITC結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析測(cè)得ACE抑制劑藥物依那普利拉為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，抑制常數(shù)KI為12.1 nmol/L，與文獻(xiàn)比較證明該法可用于抑制劑類型的判斷，是一種開發(fā)ACE抑制劑的新方法。應(yīng)用該方法確定活性多肽Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr（RY-5）為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，抑制常數(shù)KI為1.0 μmol/L。

等溫滴定量熱；反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶；熱力學(xué)；生物催化

酶的催化動(dòng)力學(xué)及抑制劑研究是酶學(xué)研究中非常重要的一個(gè)部分，得到的信息能夠預(yù)測(cè)催化反應(yīng)的路徑。傳統(tǒng)酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定的方法是通過光譜、電化學(xué)或者色譜等檢測(cè)手段測(cè)定在不同底物濃度下、一定時(shí)間內(nèi)酶催化底物生成某種產(chǎn)物的量，該方法較繁瑣且有一定局限性［1-2］。等溫滴定量熱（isothermal titration calorimetry，ITC）技術(shù)作為一種新興的測(cè)定方法，可以快速直接準(zhǔn)確測(cè)量化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生的熱量變化。

目前，ITC技術(shù)在酶催化反應(yīng)研究中被廣泛應(yīng)用。LONHIENNE等［3］使用ITC在大分子擁擠體系中測(cè)量了丙酮酸激酶等多種酶的酶學(xué)常數(shù)。CAI等［4］使用核糖核酸酶催化cCMP反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物3'-CMP抑制劑作為探針測(cè)量了核糖核酸酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為存在產(chǎn)物抑制的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定開辟了新的思路。BIANCONI等［5］與宋熙熙［6］先后使用等溫滴定量熱法測(cè)量了脲酶-尿素水解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。上述結(jié)果均證實(shí)了ITC是一種精確快速研究酶動(dòng)力學(xué)的方法。

ACE在人體血壓調(diào)節(jié)中起著重要的作用，通過將十肽血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為八肽血管緊張素Ⅱ從而使血壓升高，其抑制劑可以抑制ACE的活性起到降血壓作用［7］。早期對(duì)ACE酶學(xué)性質(zhì)的研究是用初始速率法測(cè)定其體外模擬底物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）與ACE的酶促反應(yīng)速率來監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)擬以ITC法測(cè)量ACE酶促反應(yīng)熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)及其抑制劑依那普利拉的抑制類型，并將所得結(jié)果與傳統(tǒng)法進(jìn)行比較。將ITC法用于小肽Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr（RY-5）抑制類型的判斷，為開發(fā)ACE抑制劑提供一種新的方法和思路。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)試劑

試劑：豬肺血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（自提，比活為1.2U/mg，具體方法見參考文獻(xiàn)［8］）；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu；HHL），Sigma公司；依那普利拉（Enalaprilat）,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，中國(guó)藥品生物制品檢定所；RY-5委托吉爾生化有限公司合成；硼酸、硼砂、氯化鈉，分析純；緩沖溶液均為pH=8.3的0.1mol/L的硼酸緩沖液（含0.3mol/L的NaCl）。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

等溫滴定量熱儀NANO ITC（USA TA），量熱池體積為164μL；高效液相色譜儀1260，美國(guó)安捷倫；紫外可見分光光度計(jì)UV2501pC，日本島津。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1ITC法測(cè)定不同溫度下ACE催化HHL反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)

在量熱池中注入0.5μmol/L的ACE酶液至滿，攪拌速度設(shè)定為300r/min，待量熱儀達(dá)到實(shí)驗(yàn)溫度且基線穩(wěn)定后開始自動(dòng)滴加15mmol/L的HHL，共20滴，每滴體積為1μL，時(shí)間間隔60s。

2.2初始速率法測(cè)定ACE催化HHL反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)

配制濃度范圍0.5～20mmol/L的HHL溶液，各取40μL加入1.5mL的離心管中，依次加入160μL ACE，在308.15K（催化常數(shù)達(dá)到最大值時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度）下保溫反應(yīng)5min，隨后加入150μL濃度為1mol/L的HCl終止反應(yīng)。

2.3ITC驗(yàn)證依那普利拉抑制類型

在量熱池中注入1μmol/LACE與10nmol/L依那普利拉1∶1的混合液至滿，攪拌速度設(shè)定為300r/min，待量熱儀達(dá)到308.15K且基線穩(wěn)定后開始自動(dòng)滴加15mmol/L的HHL，共30滴，每滴體積為1μL，時(shí)間間隔60s。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)進(jìn)行比較，確定ITC是否可用于藥物抑制類型的判斷。

2.4初始速率法判斷RY-5抑制劑類型

取12個(gè)1.5mL的小離心管，依次加入120μL ACE，每管加入不同濃度的抑制劑以及HHL各40μL。RY-5終濃度為0.86μmol/L和1.72μmol/L。在308.15K下保溫反應(yīng)5min，隨后加入150μL濃度為1mol/L的HCl終止反應(yīng)。

2.5應(yīng)用ITC判斷RY-5抑制類型

采用2.3節(jié)的方法判斷RY-5的抑制類型，即將依那普利拉更換為RY-5，濃度為0.8μmol/L，其他條件相同。

2.6數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)直接得到的數(shù)據(jù)為熱功率P，它代表的是單位時(shí)間t內(nèi)熱量值Q 的改變量。

通過式（2）可以計(jì)算HHL的摩爾水解焓ΔHhydr。

催化反應(yīng)的瞬時(shí)速率可表示為式（3），可以得知反應(yīng)速率v與P在相同實(shí)驗(yàn)條件下呈固定倍數(shù)關(guān)系，反應(yīng)速率的大小可以直觀的呈現(xiàn)在熱流曲線上。

反應(yīng)池底物濃度變化如式（4）所示。

無抑制劑、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在下的米氏方程及抑制常數(shù)KI的計(jì)算，如式（5）～式（8）。

3　結(jié)果與討論

3.1ACE催化HHL反應(yīng)的摩爾水解焓

采用ITC法測(cè)定反應(yīng)速率需要知道ΔHhydr，建立熱量與反應(yīng)速率的關(guān)系。表1為298.15～313.15K溫度下，計(jì)算得到ACE催化HHL反應(yīng)的ΔHhydr及等壓熱容cp，ΔHhydr均為正值，說明該反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，且其數(shù)值隨著溫度的升高而增大，較小的cp說明了底物與ACE的結(jié)合以剛性結(jié)合占主導(dǎo)，酶與底物結(jié)合主要由結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性（如較好的三圍結(jié)構(gòu)契合以及合適的非共價(jià)的離子鍵和氫鍵作用力）決定［9］。

表1　不同溫度的摩爾水解焓

3.2溫度對(duì)ACE催化HHL反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

不同溫度ACE催化HHL水解反應(yīng)的等溫滴定曲線如圖1，由式（3）可知，熱功率的變化反映了催化反應(yīng)速率的變化。

在每一次底物剛滴入量熱池中時(shí)，由于此時(shí)底物濃度最大，反應(yīng)速率達(dá)到最大值，且反應(yīng)速率會(huì)隨著底物的消耗而下降。為了測(cè)定酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，需要對(duì)底物濃度進(jìn)行累積。隨著底物濃度趨于飽和，反應(yīng)速率的增加量逐漸變小。

BIANCONI［5］報(bào)道了該方法測(cè)定脲酶水解尿素的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，其熱流曲線呈臺(tái)階式增長(zhǎng)（例如圖1中298.15K時(shí)的熱量曲線圖），即每一滴產(chǎn)生的熱流曲線中有一段時(shí)間熱功率值基本保持不變，這一階段被認(rèn)為是勻速反應(yīng)。本文作者認(rèn)為，在底物濃度較低時(shí)，反應(yīng)速率都會(huì)受底物濃度影響，這一階段反應(yīng)速率也會(huì)因?yàn)榈孜锉徊粩嘞膹亩档?，圖中呈臺(tái)階式的原因是因?yàn)檫@一階段底物消耗的量相對(duì)于這一滴底物增加的量是非常小的，所以在熱流曲線圖中表現(xiàn)不明顯。從而可以得知，傳統(tǒng)的初始速率法對(duì)于一些反應(yīng)速率較快的酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)量是存在較大誤差的。

圖1　不同溫度下ACE催化HHL水解反應(yīng)的等溫滴定量熱曲線

根據(jù)式（3）計(jì)算v，根據(jù)式（4）計(jì)算S，作出S與v的關(guān)系圖，并通過origin8進(jìn)行雙曲線擬合，結(jié)果見圖2，得到的催化常數(shù)kcat與米氏常數(shù)Km的值如表2。

由表2可知，Km的值隨著溫度的升高而變小，升高溫度有利于增加底物與ACE分子碰撞概率，底物更容易進(jìn)入ACE內(nèi)部并與活性中心結(jié)合，表現(xiàn)出底物與ACE更好的親和力。表2中kcat在298.15～303.15 K時(shí)變化非常明顯，隨溫度升高而急劇增大，在303.15～313.15K時(shí)變化緩慢且有下降的趨勢(shì)，下降的原因是因?yàn)闇囟冗^高會(huì)使部分酶失活，而Km與酶濃度無關(guān)，所以Km在這一溫度范圍內(nèi)不會(huì)下降。

圖2　不同溫度下ACE酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線

表2　不同溫度下Km、kcat的值

3.3初始速率法與ITC法比較

初始速率法中采用高效液相測(cè)定不同HHL濃度下反應(yīng)液中馬尿酸對(duì)應(yīng)的峰面積，根據(jù)馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線［8］計(jì)算出v。以S為橫坐標(biāo)，v為縱坐標(biāo)繪制ACE酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線，如圖3所示。

圖4為兩種不同方法在308.15K下的Lineweaver-Buck雙倒數(shù)圖，擬合直線在橫軸上的截距為-1/Km，可以看出初始速率法測(cè)得的Km要比等溫滴定量熱法大，計(jì)算得到308.15K時(shí)初始速率法測(cè)定Km為1.8mmol/L，而等溫滴定量熱法則為0.712 mmol/L。

圖3　ACE酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線

圖4　兩種不同方法的動(dòng)力學(xué)曲線

造成初始速率法測(cè)出的米氏常數(shù)偏大的原因是測(cè)定的速率為反應(yīng)過程5min的平均速率，在底物不飽和時(shí)，反應(yīng)速率是隨著底物濃度變化而變化的，所以測(cè)得的速率與實(shí)際初速率相比是偏小的，隨著底物濃度的增加，這種偏差越來越小，這樣勢(shì)必造成結(jié)果的偏差，即Km值偏大。而等溫滴定量熱法反應(yīng)速率可以實(shí)時(shí)的反映在熱功率的變化上，每滴熱功率極值即為在該濃度下的最大反應(yīng)速率，相比5min的平均速率法，該方法較大的提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確度。

Km作為酶的特征常數(shù)，可以一定程度上用于酶的定性，劉宏等［10］與吳瓊英等［11］報(bào)道了Km范圍為0.174～3.168mmol/L，均是使用初始速率法測(cè)得，且酶活反應(yīng)溫度在308.15～313.15K之間，從量熱曲線中可以看出，這一溫度范圍內(nèi)反應(yīng)速率隨底物消耗波動(dòng)較大。由于ACE來源及提取工藝的不同，與底物的親和力會(huì)有所差異，但對(duì)于同一實(shí)驗(yàn)得到的ACE來說，ITC法測(cè)得的Km會(huì)更接近真實(shí)值。所以ITC法與初始速率法相比，操作簡(jiǎn)單，測(cè)量精確，是值得被廣泛運(yùn)用，并可以通過進(jìn)一步完善來提高精確度的生物檢測(cè)手段。

3.4依那普利拉抑制類型

在ACE與HHL反應(yīng)的體系中加入依那普利拉，ITC結(jié)果見圖5，隨著底物濃度不斷增加，依那普利拉實(shí)驗(yàn)組的熱功率值越來越趨近于空白組的熱功率值，說明隨著底物濃度的增加依那普利拉抑制效果變?nèi)?，而?jìng)爭(zhēng)性抑制劑的特點(diǎn)就是底物與抑制劑共同競(jìng)爭(zhēng)活性位點(diǎn)，濃度的高低決定競(jìng)爭(zhēng)力的強(qiáng)弱，所以可判斷依那普利拉為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，與ANDUJAR-SANCHEZ等［12］報(bào)道的相符。即ITC可應(yīng)用于抑制劑類型的判斷。

根據(jù)式（3）計(jì)算v，根據(jù)式（4）計(jì)算S，做出L-B雙倒數(shù)圖，有/無依那普利拉的兩條擬合直線相交于縱軸的正半軸，符合典型的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑雙倒數(shù)圖特點(diǎn)［13］。根據(jù)式（8）計(jì)算得到抑制常數(shù)KI=12.1nmol/L，根據(jù)Cheng-Prusoff方程［14］KI=IC50/（1+I/Km），I為抑制劑的濃度，其值遠(yuǎn)小于Km值，所以IC50≈KI，在CECONI等［15］報(bào)道的2～36nmol/L范圍之內(nèi)。

圖5　有/無依那普利拉時(shí)ACE催化HHL水解反應(yīng)的等溫滴定量熱曲線

圖6　ITC法依那普利拉對(duì)ACE的L-B雙倒數(shù)圖

3.5RY-5抑制類型

用初始速率法測(cè)定RY-5的抑制類型，根據(jù)3.3節(jié)的方法計(jì)算出S與v，作RY-5濃度分別為0、0.86μmol/L、1.72μmol/L時(shí)對(duì)ACE的抑制動(dòng)力學(xué)L-B雙倒數(shù)圖，如圖7，不同濃度的抑制劑擬合直線相交于橫軸的負(fù)半軸，說明RY-5是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。

將ITC法應(yīng)用于活性多肽抑制類型的判斷，即在ACE與HHL反應(yīng)體系中加入RY-5，ITC結(jié)果見圖8，RY-5實(shí)驗(yàn)組的熱流曲線趨近平緩后與空白組的熱功率差值基本保持不變，說明RY-5的抑制效果與底物濃度無關(guān)，這符合非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的特點(diǎn)。

按照3.4節(jié)的方法處理數(shù)據(jù)，做出L-B雙倒數(shù)圖，見圖9。RY-5與無抑制劑的擬合直線相交于橫軸的負(fù)半軸，符合典型的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑雙倒數(shù)圖特點(diǎn)［13］。計(jì)算得到RY-5的抑制常數(shù)KI為1.0μmol/L。RY-5的IC50為0.7μmol/L［16］，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之接近，且與3.3節(jié)中初始速率法得到的抑制劑類型一致，而目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)活性多肽類ACE抑制劑均屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，說明等溫滴定量熱法能夠用于這類抑制劑類型的判斷，是一種開發(fā)ACE抑制劑的新方法。

圖7　初始速率法RY-5對(duì)ACE的L-B雙倒數(shù)圖

圖8　有/無抑制劑時(shí)ACE催化HHL水解反應(yīng)的等溫滴定量熱曲線

圖9　ITC法RY-5對(duì)ACE的L-B雙倒數(shù)圖

4　結(jié) 論

采用ITC研究血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）催化其模擬體外底物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）生成馬尿酸與二肽HL的過程，測(cè)定不同溫度下的摩爾水解焓ΔHhydr、米氏常數(shù)Km與催化常數(shù)kcat，同時(shí)采用傳統(tǒng)的初始速率法與該方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明，這一過程為吸熱過程，ΔHhydr的數(shù)值隨溫度升高而增大，等壓熱容cp為0.2126kJ/（mol·K）；Km在測(cè)定范圍內(nèi)隨溫度升高而減?。淮呋?shù)kcat在溫度較低時(shí)，隨溫度升高而增大，溫度過高會(huì)使酶變性從而下降；傳統(tǒng)的初始速率法由于采用平均速率來代替初速率使得相同溫度測(cè)得的Km偏大，因此在酶學(xué)性質(zhì)的研究中ITC法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)法。通過底物對(duì)酶與依那普利拉的混合溶液進(jìn)行滴定，從熱量曲線中即可直觀的判斷依那普利拉為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，與文獻(xiàn)結(jié)果一致，即ITC法可用于ACE抑制劑的開發(fā)。經(jīng)計(jì)算得到依那普利拉抑制常數(shù)KI值為12.1nmol/L，將這一方法應(yīng)用于小肽ACE抑制劑Arg-Tyr-Leu -Gly-Tyr（RY-5）的抑制類型測(cè)定，結(jié)果顯示RY-5為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑且與初始速率法測(cè)得的結(jié)果一致，KI值為1.0μmol/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明等溫滴定量熱法用于酶及其抑制劑的相關(guān)研究較為精確、簡(jiǎn)單和快捷。

符 號(hào) 說 明

cp—— 等壓比熱容，kJ/（mol·K）

［E］ —— 酶的濃度，mol/L

ΔHhydr—— 摩爾水解焓，J/mol

［I］ —— 抑制劑濃度，mol/L

kcat—— 催化效率，s-1

KI—— 抑制常數(shù)，mol/L

Km—— 米氏常數(shù)，mol/L

n —— 底物的物質(zhì)的量

P —— 熱功率，J/s

Q —— 熱量值，J

［S］ —— 底物濃度，mol/L

［S0］ —— 底物初始濃度，mol/L

T —— 熱力學(xué)溫度，K

t —— 時(shí)間，s

V —— 反應(yīng)池體積，L

v —— 反應(yīng)速率，mol/（s·L）

α——表觀系數(shù)

［1］ ELLIS R J. Macromolecular crowding：obvious but underappreciated［J］. Trends Biochem. Sci.，2001，26（10）：597-604.

［2］ OLSEN S N. Application of isothermal titration calorimetry to measure enzyme kinetics and activity in complex solutions ［J］. Thermochim Acta，2006，448（1）：12-18.

［3］ LONHIENNE T G A，WINZOR D J. A potential role for isothermal calorimetry in studies of the effects of thermodynamic non-ideality in enzyme-catalyzed reactions［J］. Journal of Molecular Recognition，2004，17（5）：351-361.

［4］ CAI L F，CAO A N，LAI L H. An isothermal titration calorimetric method to determine the kinetic parameters of enzyme catalytic reaction by employing the product inhibition as probe［J］. Analytical Biochemistry，2001，299（1）：19-23.

［5］ BIANCONI M L. Calorimetry of enzyme-catalyzed reactions ［J］. Biophysical Chemistry，2007，126（1/2/3）：59-64.

［6］ 宋熙熙. 等溫滴定量熱法測(cè)定脲酶催化尿素水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué) ［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，36（2）：175-179.

［7］ 周敬豪，徐存華，李玉嬋，等. 磁性殼聚糖微球的合成及其在固定化血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的應(yīng)用 ［J］. 化工進(jìn)展，2013，32（10）：2440-2445.

［8］ 周利琴，廖丹葵，孫建華. 豬肺血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的提取與純化［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，45（4）：639-642.

［9］ TELLEZ-SANZ R，GARCIA-FUENTES L，BARON C. Calorimetric analysis of lisinopril binding to angiotensin Ⅰ—converting enzyme［J］. Febs Letters，1998，423（1）：75-80.

［10］ 劉宏，陳蘭英. 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶純化和性質(zhì)研究［J］. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2000（6）：788-792.

［11］ 吳瓊英，馬海樂，崔恒林，等. 豬肺血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的提取純化及其性質(zhì)研究［J］. 食品科學(xué)，2004（9）：71-73.

［12］ ANDUJAR-SANCHEZ M，CAMAR-ARTIGAS A，JARA-PEREZ V. A calorimetric study of the binding of lisinopril，enalaprilat and captopril to angiotensin converting enzyme ［J］. Biophysical Chemistry，2004，111（2）：183-189.

［13］ 彭益強(qiáng)，劉鵬，鄧峰，等. 源于馬鈴薯的多酚氧化酶活性中心必需基團(tuán)組成與抑制機(jī)理 ［J］. 化工進(jìn)展，2012，31（2）：406-411.

［14］ CHENG Y，PRUSOFF W H. Relationship between the inhibition constant（Ki）and the concerntration of an inhibitor that causes a 50% inhibition （I50） of an enzymatic reaction ［J］. Biochemical Pharmacology，1973，22（1）：3099-3108.

［15］ CECONI C，F(xiàn)RANCOLINI G，OLIVARES A，et al. Angiotensin converting enzyme （ACE） inhibitors have different selectivity for bradykinin binding sites of human somatic ACE ［J］. European Journal of Pharmacology，2007，577（1/2/3）：1-6.

［16］ CONTRERAS M D，CARRON R，MONTERO M J，et al. Novel casein-derived peptides with antihypertensive activity ［J］. International Dairy Journal，2009，19（10）：566-573.

Thermodynamics and kinetics of an enzyme-catalyzed reaction determined by isothermal titration calorimetry

PENG Shang，SUN Lixia，XIONG Zhen'ai，ZHOU Liqin，LAN Xiongdiao，SUN Jianhua，TONG Zhangfa，LIAO Dankui
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of New Technology and Application in Resource Chemical Engineering，Nanning 530004，Guangxi，China）

Thermodynamic and kinetic parameters of angiotensin converting enzyme（ACE）catalyzed hydrolysis of simulating substrate Hippuryl-Histidyl-Leucine（HHL）in vitro were determined by isothermal titration calorimetry（ITC）. The effect of temperature on kinetic parameters was investigated；the results showed that the ACE-catalyzed reaction was endothermic with a small constant pressure specific heat capacity ［cp=0.2126kJ/（mol·K）］. The value of molar hydrolysis enthalpy ΔHhydrwas positive and increased as temperature rose. The reaction mechanism was in accordance with the Michaelis-Menten model in the temperature range （298.15—313.15K）；the effect of temperature on the Michaelis constant（Km）was negative，while catalytic constant（kcat）first increased then decreased with the increase of temperature，reaching the maximum value of 2.534s-1at 308.15K. Initial rate method was also used in order to compare with ITC method. The Kmmeasured by the initial rate method was relatively large because of the limitation in itself. The inhibitory type of the drug enalapril，known as ACE inhibitor，was determined by ITC and enzymatic kinetics analysis. The results show thatthe inhibitor was a competitive inhibitor with inhibition constant KI=12.1nmol/L. The ITC method is applicable for determining the inhibitor type in comparison with literature. It is a new approach for the development of ACE inhibitors. We determined that the active peptides Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr （RY-5）were noncompetitive inhibitors with KIof 1.0μmol/L by using this method..

isothermal titration calorimetry；reaction kinetics；angiotensin converting enzyme；thermodynamic；biocatalysis

O 642.3

A

1000-6613（2016）11-3459-06

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.11.011

2016-04-27；修改稿日期：2016-07-04。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（51372043）、廣西教育廳科研項(xiàng)目（KY2016YB035）、廣西大學(xué)博士啟動(dòng)項(xiàng)目（XBZ160130）及廣西博士后專項(xiàng)資助項(xiàng)目。

彭尚（1988—），男，碩士研究生，從事化學(xué)工藝方面的研究。聯(lián)系人：廖丹葵，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail liaodk@gxu.edu.cn。