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    Fn14活化凋亡增強人上皮性卵巢癌細胞順鉑敏感度的研究

    2016-11-12 08:18:26吳安玥邱麗華
    國際婦產科學雜志 2016年3期
    關鍵詞:細胞株敏感度卵巢癌

    吳安玥,邱麗華

    ·論著·

    Fn14活化凋亡增強人上皮性卵巢癌細胞順鉑敏感度的研究

    吳安玥,邱麗華

    目的:探討成纖維細胞生長誘導因子14(Fn14)對人上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)細胞的順鉑(DDP)敏感度的影響及其可能機制。方法:蛋白質印跡(Western blotting)法檢測EOC細胞株SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP中Fn14蛋白的表達情況,選擇低表達Fn14蛋白的細胞株轉染Fn14過表達質粒后,觀察轉染后細胞株的Fn14蛋白、凋亡相關蛋白caspase-3、cleaved caspase-3和Bcl-2的表達情況。CCK-8法檢測細胞增殖能力及DDP半數(shù)抑制濃度(IC50)。流式細胞學檢測細胞凋亡。結果:人EOC細胞株SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP中,A2780/DDP細胞株Fn14蛋白表達水平最低。Fn14過表達質粒轉染A2780/DDP細胞后,細胞內Fn14表達水平上調(P<0.05);細胞的增殖能力無變化,但細胞DDP的IC50顯著降低(P<0.05)。流式細胞學檢測結果進一步顯示Fn14可以增加DDP誘導的A2780/DDP凋亡細胞數(shù)目。同時,Western blotting結果顯示促凋亡蛋白caspase-3表達升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯下降(P<0.05)。結論:Fn14可能活化凋亡通路進而提高A2780/DDP細胞對DDP的敏感度。

    卵巢腫瘤;成纖維細胞生長誘導因子14;順鉑;抗藥性,腫瘤;細胞凋亡

    (J Int Obstet Gynecol,2016,43:335-339)

    上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)死亡率占婦科惡性腫瘤的首位[1],雖然腫瘤細胞減滅術聯(lián)合鉑類為主的化療對80%的患者有明顯臨床療效,但是大部分患者在初始治療18~24個月左右復發(fā),僅有10%~15%能獲得長期緩解[2]。目前認為EOC患者因化療耐藥而引起腫瘤復發(fā),是導致其5年生存率低下的主要原因之一[3-4]。故研究卵巢癌耐藥機制,從而找到靶點來減少或者逆轉卵巢癌鉑類耐藥,是改善卵巢癌預后的關鍵因素。成纖維細胞生長誘導因子14(Fn14)是Ⅰ型跨膜蛋白,是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族中的最小成員,其配體是腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑(TWEAK)。Fn14在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、化療耐藥中發(fā)揮重要作用[5-6]。目前研究顯示,F(xiàn)n14通過激活核因子κB(NF-κB)通路介導胃癌、小細胞肺癌的化療耐藥[7-8],但其在EOC鉑類耐藥中的作用不明。本實驗擬研究Fn14在EOC順鉑(DDP)耐藥中的作用及其相關機制,為進一步尋找遏制EOC細胞化療耐藥提供理論依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 主要儀器及試劑改良型RPMI 1640細胞培養(yǎng)液(Hyclone公司);FBS(Hyclone公司);雙抗(青霉素、鏈霉素,Hyclone公司);兔抗人Fn14抗體、兔抗人caspase-3抗體、兔抗人Bcl-2抗體(Cell Signaling Technology公司);CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所);pcDNA3.1-Fn14質粒(廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學科學研究中心惠贈);DH5α感受態(tài)菌(大連寶生物公司);DDP(山東齊魯制藥有限公司);無內毒素質粒提取盒(北京天根科技有限公司);細胞凋亡試劑盒(BD公司);細胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板(Corning公司);遠紅外熒光掃描儀(LICOR公司);異丙醇、無水乙醇、氯化鈉等均為國產分析純。

    1.2 實驗方法

    1.3 統(tǒng)計學方法采用Graphpad Prism 5軟件處理數(shù)據(jù),定量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 人EOC細胞株中Fn14蛋白表達水平的比較

    Western blotting結果顯示在人EOC的SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP細胞株中,A2780/DDP細胞株內Fn14蛋白表達水平最低,故采用低表達Fn14蛋白的A2780/DDP細胞株為研究對象進行后續(xù)實驗。見圖1。

    圖1 各EOC細胞株中Fn14蛋白表達水平

    2.2轉染Fn14過表達質粒對A2780/DDP細胞株中Fn14蛋白表達水平的影響Western blotting結果顯示,轉染Fn14過表達質粒后的A2780/DDP細胞中Fn14表達水平較vector組升高,差異有統(tǒng)計學意義(t=7.147,P=0.002)。見圖2。

    圖2 Fn14過表達質粒轉染A2780/DDP細胞后,F(xiàn)n14蛋白表達水平的變化

    2.3 轉染Fn14過表達質粒對A2780/DDP細胞DDP敏感度(IC50)的影響CCK-8法檢測結果顯示Fn14過表達質粒轉染后,A2780/DDP細胞IC50由(46.450±0.922)μg/mL降至(24.368±0.352)μg/mL,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.875,P=0.019),見圖3A。這提示Fn14增加了細胞對DDP的敏感度。未加入DDP時,與vector組相比,F(xiàn)n14過表達質粒轉染組細胞OD450 nm值的變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);加入DDP(終濃度10 μg/mL)處理后,DDP對Fn14過表達質粒轉染組細胞增殖抑制作用更明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3B。這提示Fn14不影響細胞增殖,故Fn14促進DDP對A2780/DDP細胞增殖能力的抑制,非細胞增殖能力減弱所致。

    2.4 Fn14對A2780/DDP細胞凋亡的影響流式細胞學檢測顯示,未加入DDP時,vector組和Fn14過表達質粒轉染組總凋亡率均<1%。當加入DDP(終濃度為25 μg/mL)處理24 h后,vector組和Fn14過表達質粒轉染組的總凋亡率分別為(12.1±1.5)%和(27.3±2.5)%,差異有統(tǒng)計學意義(t=8.864,P=0.001)。提示Fn14促進DDP所誘導的A2780/DDP細胞凋亡。見圖4。

    2.5 轉染Fn14過表達質粒對A2780/DDP細胞凋亡相關蛋白表達水平的影響Western blotting結果顯示,未加入DDP時,與vector組細胞相比,F(xiàn)n14過表達質粒轉染細胞中的caspase-3蛋白前體、caspase-3蛋白活化體、Bcl-2無明顯變化。當DDP處理(終濃度為25 μg/mL)24 h后,轉染Fn14過表達質粒的A2780/DDP細胞中的caspase-3蛋白活化體表達上調(t=3.411,P=0.027),Bcl-2蛋白表達下調(t=6.645,P=0.003),差異均有統(tǒng)計學意義。見圖5。

    圖3 Fn14過表達質粒轉染A2780/DDP細胞后,細胞增殖能力及DDP敏感度的變化

    3 討論

    圖4 A2780/DDP細胞株過表達Fn14后細胞凋亡的變化

    Fn14是由129個氨基酸構成的Ⅰ型跨膜蛋白,胞漿區(qū)中包含有腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)的結合序列,當配體與Fn14結合后,通過TRAF活化激活核因子κB(NF-κB)、胞外信號轉導激酶(ERK)、P38絲裂原活化蛋白激酶(p38MARK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路,調控腫瘤細胞凋亡、腫瘤細胞的遷徙和侵襲能力、促進腫瘤血管生成、參與炎癥反應等一系列生物學行為[9]。研究顯示,F(xiàn)n14在不同的腫瘤中發(fā)揮的生物學效應不盡相同,其可通過激活ERK信號通路促進非小細胞肺癌的侵襲轉移[10];可促進HER2和heregulin β1依賴的乳腺癌細胞的遷徙和侵襲[11];而在子宮內膜癌中,F(xiàn)n14則通過活化caspase通路促進腫瘤細胞凋亡[12];Fn14·TRAIL融合蛋白可以誘導肝癌細胞凋亡,抑制腫瘤生長[13]。Fn14在腫瘤耐藥中也發(fā)揮重要作用,Kwon等[7]發(fā)現(xiàn),F(xiàn)n14通過激活NF-κB通路介導胃癌對5-氟尿嘧啶耐藥的發(fā)生;Li等[8]同樣發(fā)現(xiàn)Fn14通過激活NF-κB通路導致小細胞肺癌對化療藥物的耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)在人EOC細胞株SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP中A2780/DDP細胞Fn14蛋白表達水平最低,繼而在A2780/DDP細胞中轉染Fn14過表達質粒后發(fā)現(xiàn)細胞IC50明顯降低,增加細胞DDP敏感度,這與在胃癌、非小細胞肺癌中Fn14促進腫瘤耐藥不同。因Fn14不影響細胞增殖能力,所以Fn14增強DDP對 EOC細胞株增殖的抑制作用不是細胞增殖能力減弱所致,進一步證明Fn14可以提高A2780/DDP細胞的DDP敏感度,在卵巢癌細胞鉑類耐藥機制中發(fā)揮重要作用。

    圖5 A2780/DDP細胞株過表達Fn14后,細胞凋亡相關蛋白的變化

    細胞凋亡是凋亡蛋白和凋亡抑制蛋白(IAP)共同調控下發(fā)生的一種主動的細胞自殺行為。DDP等經典的抗腫瘤藥物通過促進細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤效應,然而細胞抗凋亡能力增強如抗凋亡基因過表達或促凋亡基因丟失,可能導致腫瘤細胞產生耐藥性,故細胞凋亡異常與EOC的DDP化療耐藥密切相關[14-15]。caspase是凋亡蛋白酶家族,通過選擇性地剪切其底物蛋白完成自我活化和相互激活過程,最終通過下游效應分子caspase-3活化觸發(fā)細胞凋亡。當caspase功能受到抑制時,機體細胞凋亡障礙,進而誘使EOC的發(fā)生和進一步進展[16]。Bcl-2是凋亡抑制因子,主要通過抑制線粒體釋放細胞色素C來抑制細胞通過線粒體途徑發(fā)生凋亡。研究表明,當EOC細胞Bcl-2蛋白表達增多,細胞凋亡減少,DDP耐藥性增加[17]。本研究發(fā)現(xiàn)A2780/DDP細胞轉染Fn14過表達質粒后,可以促進DDP誘導凋亡細胞數(shù)目增多,同時促進凋亡相關蛋白caspase-3蛋白的活化和抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,進一步提示Fn14可能通過活化凋亡通路促進A2780/DDP細胞凋亡,進而提高A2780/DDP對DDP的敏感度。

    綜上所述,本研究探索了Fn14與EOC細胞耐藥的關系,首次發(fā)現(xiàn)了Fn14可能通過活化凋亡增強人EOC細胞株對DDP的敏感度,為臨床開創(chuàng)有效逆轉EOC鉑類耐藥的治療新途徑提供了理論基礎。

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    Fn14 Enhances Cisplatin Sensitivity in Human Epithelial Ovarian Cancer Cells by Regulating Apoptosis

    WU An-yue,QIU Li-hua.Department of Obstetrics and Gynecology,Shanghai Key Laboratory of Gynecology Oncology,Renji Hospital,School of Medicine,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200127,China

    QIU Li-hua,E-mail:lilyqiulh@126.com

    Objective:To investigate the effects of Fn14 on regulating cisplatin(DDP)sensitivity in human ovarian cancer cells.Methods:Fn14 protein expression levels in SKOV3,CAOV3,OVCAR3,ES2,3AO,A2780 and A2780/DDP were detected through Western blotting.The expression of Fn14,caspase-3,cleaved caspase-3 and Bcl-2 were accessed by Western blotting in lowest expression of Fn14 cell line when transfected with Fn14 plasmid.The half cell lethal dose(IC50)of DDP and the ability of proliferation in A2780/DDP cells were assayed by CCK-8 kit.The ratio of apoptosis in A2780/DDP cells were determined by flow cytometry.Results:A2780/DDP cells exhibited the lowest expression of Fn14 in these cell lines.Fn14 transfer had no effect on the proliferation of A2780/DDP cells,whereas it could reduce the IC50 of DDP in A2780/DDP cells(P<0.05).When Fn14 was transferred,the apoptosis induced by DDP was increased in A2780/DDP cells,meanwhile,the expression of apoptosiscorrelated protein caspase-3 was up-regulated and anti-apoptotic protein Bcl-2 was down-regulated(P<0.05).Conclusions: Fn14 may increase chemosensitivity to DDP by apoptosis pathway in human epithelial ovarian cancer cells.

    Ovarian neoplasms;Fn14;Cisplatin;Drug resistance,neoplasm;Apoptosis

    2015-12-10)

    [本文編輯 王昕]

    國家自然科學基金面上項目(81272884)

    200127上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院婦產科,上海市婦科腫瘤重點實驗室

    邱麗華,E-mail:lilyqiulh@126.com

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