氟伐他汀對同型半胱氨酸誘導的凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1表達的影響

趙　穎　趙興山孫華毅　胡文蘭北京積水潭醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京100035

氟伐他汀對同型半胱氨酸誘導的凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1表達的影響

趙穎趙興山▲孫華毅胡文蘭
北京積水潭醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京100035

目的探討氟伐他汀對同型半胱氨酸（Hcy）誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）信使核糖核酸（mRNA）表達的影響。方法分離培養(yǎng)HUVECs，分為正常對照組、Hcy刺激組：100μmol/LHcy與細胞孵育24 h，3種不同濃度的氟伐他汀干預組：分別以不同濃度的氟伐他?。?.1、1、10μmol/L）預孵育細胞24 h，再與100μmol/LHcy共同培養(yǎng)24 h，應用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測LOX-1mRNA的表達。結(jié)果Hcy顯著誘導HUVECs LOX-1mRNA的表達，氟伐他汀抑制Hcy誘導的LOX-1mRNA的表達，并呈現(xiàn)一定劑量依賴性。結(jié)論Hcy可能通過LOX-1介導其內(nèi)皮損傷作用，氟伐他汀可能通過減少LOX-1過度表達發(fā)揮其抗動脈粥樣硬化作用。

氟伐他汀曰凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1曰同型半胱氨酸曰內(nèi)皮細胞曰動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的病理基礎，內(nèi)皮功能障礙則是動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié)。研究證實同型半胱氨酸（Hcy）能夠?qū)е聝?nèi)皮損傷，促進動脈粥樣硬化形成［1］。已知他汀類藥物具有抗動脈粥樣硬化作用，其中獨立于降脂作用以外的內(nèi)皮保護功能尤為重要。LOX-1作為氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）的內(nèi)皮細胞受體，通過介導oxLDL在內(nèi)皮細胞的多種生物學效應，參與動脈粥樣硬化的形成［2］。多種炎癥因子、氧化應激因素都可誘導LOX-1的表達。但目前鮮有關于Hcy對內(nèi)皮細胞LOX-1表達誘導以及氟伐他汀對內(nèi)皮細胞LOX-1表達影響的研究。故本研究擬探討氟伐他汀在體外對Hcy誘導的LOX-1表達所具有的影響。

1　材料與方法

1.1一般材料

DL-同型半胱氨酸（Sigma公司），氟伐他汀原藥粉（Novartis公司，批號：X0362），RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、人AB血清（GibcoBrl公司），青霉素、鏈霉素、膠原酶Ⅰ型（Sigma公司），0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA（HyClone公司），HEPES、PBS緩沖液、內(nèi)皮生長因子（Sigma公司），肝素鈉（Solarbio公司），內(nèi)皮細胞鑒定試劑盒（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司），通用PCR優(yōu)化試劑盒Ⅰ（博大泰克公司）。

1.2人臍靜脈內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)與鑒定

無菌條件下取健康產(chǎn)婦臍帶，PBS緩沖液反復沖洗后，加0.1%膠原酶，37℃消化15 min，離心后加完全培養(yǎng)基RPMI1640（10%胎牛血清，10%人AB血清，100 U/m L青霉素，100μg/mL鏈霉素，50 ng/mL內(nèi)皮生長因子，50μg/mL肝素鈉儲存液），置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，24 h后換液，待人臍靜脈內(nèi)皮細胞80%融合，用胰蛋白酶-EDTA消化傳代，經(jīng)Ⅷ因子鑒定后，第2～3代用于實驗。

1.3實驗分組

實驗分為五組：①正常對照組：HUVECs與培養(yǎng)基孵育24 h；②Hcy刺激組：100μmol/LHcy與HUVECs孵育24 h；③低濃度氟伐他汀干預組：以0.1μmol/L氟伐他汀預處理HUVECs后，再與Hcy共同培養(yǎng)24 h；④中濃度氟伐他汀干預組：以1μmol/L氟伐他汀預處理HUVECs后，再與Hcy共同培養(yǎng)24 h；⑤高濃度氟伐他汀干預組：以10μmol/L氟伐他汀預處理HUVECs后，再與Hcy共同培養(yǎng)24 h。每組4個樣本。

1.4逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應淵RT-PCR冤檢測LOX-1m RNA的表達

培養(yǎng)結(jié)束后按常規(guī)方法提取細胞總RNA，并進行純化，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用于LOX-1基因序列擴增的引物序列：上游5＇-AAGGACCAGCCTCATGAGAAG-3＇，下游5＇-TTGGCATCCAAAGACAAGCAC-3＇。以β-actin為內(nèi)參照物，引物序列：上游5＇-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3＇，下游5＇-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3＇。PCR反應程序為：94℃變性3.5min→94℃40 s→54℃退火1min→72℃延伸1 min，重復40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，紫光燈下拍照，將凝膠電泳圖像輸入GeneGenius凝膠分析系統(tǒng)，應用GeneTool計算同一管內(nèi)LOX-1與β-actin擴增條帶吸光度比值作為其相對表達強度。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x依s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

正常對照組有極微量LOX-1mRNA的表達（0.08± 0.01）。與正常對照組比較，100μmol/LHcy與HUVECs孵育24 h顯著誘導LOX-1mRNA的表達（0.40±0.09），Hcy刺激組LOX-1mRNA水平（0.36±0.04）升高至正常對照組的5倍（P＜0.05）。氟伐他汀干預組可減輕LOX-1 mRNA在HUVECs的過度表達。但與Hcy刺激組相比較，0.1μmol/L氟伐他汀組僅輕度減輕LOX-1mRNA水平。而1μmol/L氟伐他汀組（0.27±0.03）與10μmol/L氟伐他汀組（0.13±0.02）均可顯著降低LOX-1mRNA水平（P＜0.05），且10μmol/L氟伐他汀組較1μmol/L氟伐他汀組的抑制作用比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），呈現(xiàn)出一定劑量依賴性。見圖1。

圖1　氟伐他汀對Hcy誘導的LOX-1 m RNA表達的影響

3　討論

LOX-1是1997年由Sawamura等［3］在牛主動脈內(nèi)皮細胞上發(fā)現(xiàn)的oxLDL的一種新型受體，主要在血管內(nèi)皮細胞表達，也存在于平滑肌細胞、巨噬細胞、血小板和心肌細胞。其基礎表達水平較低，但可以被多種致動脈粥樣硬化的因素所誘導增強，包括oxLDL自身、氧化應激、機械刺激的切應力、腫瘤壞死因子-α、腫瘤生長因子-β1、C反應蛋白、內(nèi)皮素-1、血管緊張素Ⅱ、血管緊張素Ⅱ受體、高糖［2］。LOX-1介導oxLDL在內(nèi)皮細胞的多種生物學效應，導致內(nèi)皮細胞損傷，在動脈粥樣硬化的形成中至關重要。

Hcy是近年來確認的一種新的獨立的促動脈粥樣硬化的危險因子。它通過內(nèi)皮損傷、氧化應激、炎性反應等多方面參與動脈粥樣硬化進程。其中內(nèi)皮功能障礙是Hcy導致動脈粥樣硬化的重要原因。目前已知Hcy能夠破壞內(nèi)皮屏障、誘導內(nèi)皮細胞調(diào)亡、增加內(nèi)皮表面單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）等的表達、抑制內(nèi)皮衍生舒張因子的合成釋放和活性等，造成內(nèi)皮的損傷［4-6］。近期有研究發(fā)現(xiàn)在Hcy刺激下，內(nèi)皮細胞的oxLDL濃度明顯升高，同時LOX-1mRNA的表達顯著增加［7］。本研究應用人臍靜脈內(nèi)皮細胞與Hcy共同孵育，結(jié)果顯示，LOX-1的基礎表達水平較低，而Hcy能夠顯著上調(diào)LOX-1mRNA的表達，這與此前的研究結(jié)果相一致［7-8］，上述結(jié)果提示Hcy可能通過LOX-1導致內(nèi)皮損傷，參與動脈粥樣硬化的形成。

有研究表明Hcy可促進低密度脂蛋白氧化修飾成oxLDL［9］，而oxLDL即可上調(diào)LOX-1的表達，本研究中Hcy上調(diào)LOX-1表達的機制可能就經(jīng)由oxLDL途徑進行。氧化應激是Hcy造成內(nèi)皮損傷的主要機制之一。Hcy易于自身氧化，生成超氧陰離子，產(chǎn)生活性氧（ROS），降低一氧化氮（NO）生物活性。Hcy還通過降低抗氧化酶的生物活性間接導致氧化應激的產(chǎn)生［10］。據(jù)此推測Hcy很可能通過產(chǎn)生的ROS以及所形成的氧化應激上調(diào)LOX-1的表達。Miki等［11］的研究中在加入Hcy前，事先用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸處理胎牛主動脈內(nèi)皮細胞，結(jié)果部分抑制了Hcy誘導的LOX-1表達，亦提示Hcy可通過氧化應激上調(diào)LOX-1的表達。

他汀類藥物廣泛應用于高脂血癥的治療。有關冠心病患者的臨床試驗證實他汀類藥物能夠降低主要心血管事件的風險，延緩動脈粥樣硬化的進展［12-13］。他汀類藥物對心血管病發(fā)病率和病死率的降低得益于他汀類的多效性。他汀類除了直接抑制膽固醇合成外，還具有獨立于降脂作用以外的多效性，包括改善內(nèi)皮功能、抑制平滑肌細胞增殖、減少血管炎性反應和抗血小板作用等。oxLDL經(jīng)內(nèi)皮細胞攝取后，內(nèi)皮細胞激活，內(nèi)皮細胞分泌功能及完整性改變，繼而白細胞、單核細胞及血小板沉積在血管內(nèi)膜，完成了動脈粥樣硬化的早期進程，在此過程中LOX-1激活至關重要［14-16］。目前已有一些關于他汀類藥物在體外抑制LOX-1表達的研究。辛伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀預處理人冠狀動脈內(nèi)皮細胞可以下調(diào)ox-LDL誘導的LOX-1表達［17-20］。辛伐他汀還可以在鼠血管平滑肌細胞下調(diào)ox-LDL誘導的LOX-1表達［21］。洛伐他汀可以下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細胞及血管平滑肌細胞的LOX-1表達［22］。氟伐他汀能夠下調(diào)血管平滑肌細胞的LOX-1表達［23］。但有關氟伐他汀在內(nèi)皮細胞對LOX-1表達的研究鮮有報道。本研究應用氟伐他汀預處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞，以Hcy作為刺激因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氟伐他汀能夠抑制Hcy誘導的LOX-1表達，提示氟伐他汀可能通過下調(diào)LOX-1過度表達發(fā)揮內(nèi)皮保護作用，改善Hcy對內(nèi)皮的損傷。在本研究中高濃度（10μmol/L）氟伐他汀比低濃度（1μmol/L）氟伐他汀對Hcy誘導的LOX-1mRNA表達的抑制作用更強，具有濃度依賴性。在此前的研究中，辛伐他汀及阿托伐他汀亦呈現(xiàn)出類似的濃度依賴性［17-19］。

目前對于他汀類藥物下調(diào)LOX-1表達的作用機制還未明確。有研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的穩(wěn)定性、增加內(nèi)皮細胞NO的產(chǎn)生，其中氟伐他汀能增加培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細胞的eNOS濃度［24］。離體實驗發(fā)現(xiàn)氟伐他汀不僅能保護ox-LDL不被氧化，還可有效清除自由基活性［25］。均證實氟伐他汀的抗動脈粥樣硬化作用并不限于它的降脂作用，是與它的抗氧化效應亦相關。而內(nèi)皮細胞LOX-1的表達受到氧化應激狀態(tài)的誘導，因此認為Hcy氧化產(chǎn)生ROS，形成的氧化應激上調(diào)了LOX-1在內(nèi)皮細胞的表達，而氟伐他汀可能通過其抗氧化作用抑制Hcy對LOX-1表達的上調(diào)作用。

本研究也有一些缺陷和不足，對LOX-1表達的檢測采用半定量的RT-PCR方法，未采用更為精準的實時定量PCR或結(jié)合蛋白質(zhì)印跡同時分析檢測LOX-1的蛋白表達。沒能進一步證實氧化應激是氟伐他汀與Hcy對LOX-1表達調(diào)控的作用機制，因此尚需更多的研究去探究他汀類藥物對LOX-1表達調(diào)控的具體作用機制。

綜上所述，本研究揭示了Hcy致動脈粥樣硬化的可能機制，Hcy可能通過上調(diào)內(nèi)皮細胞的LOX-1表達形成內(nèi)皮損害而導致動脈粥樣硬化。同時發(fā)現(xiàn)氟伐他汀可能通過調(diào)控LOX-1表達發(fā)揮其抗動脈粥樣硬化作用，氟伐他汀能夠下調(diào)Hcy誘導的LOX-1過度表達，提示對抗Hcy、抑制LOX-1表達可能為他汀類藥物降脂作用以外的多效性。

［1］Tehlivets O.Homocysteine as a risk factor for atherosclerosis：is its conversion to S-adenosyl-L-homocysteine the key to deregulated lipidmetabolism？［J］.Lipids，2011，2011：702853.

［2］YoshimotoR，F(xiàn)ujitaY，KakinoA，etal.ThediscoveryofLOX-1，its ligands and clinical significance［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2011，25（5）：379-391.

［3］Sawamura T，Kume N，Aoyama T.An endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein［J］.Nature，1997，386（6620）：73-77.

［4］Sung FL，Siow YL，Wang GP，et al.Homocysteine stimulates the expression ofmonocyte chemoattractant protein-1 in endothelial cells leading to enhanced monocyte chemotaxis［J］.Mol Cell Biochem，2000，216（1/2）：121-128.

［5］ Lang D，Kredan MB，Moat SJ，et al. Homocysteine-inducedinhibition of endothelium-dependent relaxation in rabbitaorta：Role for superoxide anions［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2000，20（2）：422-427.

［6］Eberhardt RT，F(xiàn)orgione MA，Cap A，et al.Endothelial dysfunction in amurine model ofmild hyperhomocyst（e）inemia［J］.JClin Invest 2000，106（4）：483-491.

［7］Yang XL，Tian J，Liang Y，etal.Homocysteine inducesblood vessel global hypomethylation mediated by LOX-1.Genet Mol Res［J］.2014，13（2）：3787-3799.

［8］李全忠，朱雯霞，趙水平.同型半胱氨酸對血管內(nèi)皮細胞血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體1mRNA表達及氧化型低密度脂蛋白攝取的影響［J］.中國動脈硬化雜志，2000，10（4）：324-326.

［9］Hineche JW，Kawamura M，Suzuki，et al.Oxidation of low density lipoprotein by thiols：superoxide-dependent andindependentmechanisms［J］.J Lipid Res，1993，34（12）：2051-2054.

［10］Handy DE，Loscalzo J.Homocysteine downregulates cellular glutathione peroxidase（GPx1）by decreasing translation［J］.JBiol Chem，2005，280（16）：15518-15525.

［11］Nagase M，Ando K，Nagase T，etal.Redox-Sensitive Regulation of LOX-1 Gene Expression in Vascular Endothelium［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2001，281（3）：720-725.

［12］Randomised trial of cholesterol lowering in 4444 patients with coronary heartdisease：the Scandinavian Simvastatin Survival Study（4S）［J］.Lancet，1994，344（8934）：1383-1389.

［13］Prevention of cardiovasculareventsand death with pravastatin in patients with coronary heart disease and a broad rangeofinitial cholesterol levels.The Long-Term Interventionwith Pravastatin in Ischaemic Disease（LIPID）Study Group［J］.N Engl JMed，1998，339（19）：1349-1357.

［14］Li D，Mehta JL.Antisense to LOX-1 inhibits oxidized LDL-mediated upregulation ofmonocyte chemoattractant protein-1 and monocyte adhesion to human coronary artery endothelial cells［J］.Circulation，2000，101（25）：2889-2895.

［15］Mehta A，Yang B，Khan S，et al.Oxidized low-density lipoproteins facilitate leukocyte adhesion to aortic intima without affecting endothelium-dependent relaxation Role of P-selectin［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1995，15（11）：2076-2083.

［16］Eichhorn B，Muller G，Leuner A，et al.Impaired vascular functioninsmallresistancearteriesofLOX-1overexpression mice on hing-fat diet［J］.Cardiovasc Res，2009，82（3）：493-502.

［17］Li D，Chen H，Romeo F，et al.Statinsmodulate oxidized low-density lipoprotein-mediated adhesion molecule expression in human coronary artery endothelial cells：role of LOX-1［J］.JPharmacol Exp Ther，2002，302（2）：601-605.

［18］Li DY，Chen HJ，Mehta JL.Statins inhibitoxidized-LDL-mediated LOX-1 expression，uptake of oxidized-LDL and reduction in PKB phosphorylation［J］.Cardiovasc Res，2001，52（1）：130-135.

［19］Mehta JL，Li DY，Chen HJ，et al.Inhibition of LOX-1 by statinsmay relate to upregulation of eNOS［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，289（4）：857-861.

［20］Chen J，Zhou S，Tan Z.Aspirin and pravastatin reduce lectin-like oxidized low density［J］.Chin Med J（Engl），2010，123（12）：1553-1560.

［21］Zhang Z，Zhang M，Li Y，et al.Simvastatin inhibits the additive activation of ERK1/2 and proliferation of rat vascular smooth muscle cells induced by combined mechanical stress and oxLDL through LOX-1 pathway［J］. Cell Signal，2013，25（1）：332-340.

［22］Quan Z，Li Q，Deng H，et al.Lovastatin down regulates theexpression of lecctin-like oxidized low density lipoprotein receptor（LOX-1）mRNA on human umbilical vein endothelial cells［J］.Chin J Arterioscler，2002，10（1）：26-29.

［23］Prochnau D，Rodel J，Prager K，et al.Induced expression of lectin-like oxidized ldl receptor-1 in vascular smooth muscle cells following Chlamydia pneumoniae infection and its down-regulation by fluvastatin［J］.Acta Microbiol Immunol Hung，2010，57（2）：147-155.

［24］Mueck AO，Seeger H，Wallwiener D.Further evidence for direct vascular actions of statins：effect on endothelial nitric oxide synthase and adhesionmolecules［J］.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2001，109（3）：181-183.

［25］Suzumura K，YasuharaM，Narita H.Superoxide anion scavenging properties of fluvastatin and its metabolites［J］. Chem Pharm Bull，1999，47（10）：1477-1480.

Effect of fluvastatin on lectin-like oxidized low-density lipoprotein recep－tor-1 expression induced by homocysteine in human umbilical vein en－dothelial cells

ZHAO Ying ZHAO Xingshan▲SUN Huayi HUWenlan
Department of Cardiology，Beijing Jishuitan Hospital，Beijing 100035，China

Objective To investigate the effect of fluvastatin on the expression of LOX-1 induced by homocysteine（Hcy）in cultured human umbilicalvein endothelial cells（HUVECs）.M ethods Human umbilicalvein endothelial cellswere cultured and treated with Hcy（100μmol/L for 24 hours）alone，or pre-treated with fluvastatin（0.1，1 or 10μmol/L for 24 h），followed by Hcy treatment.After respective treatment，the expression of lectin-like ox-LDL receptor-1（LOX-1）wasmeasured by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）.Results Hcy（100 umol/L）treatment up regulated the expression of LOX-1 in HUVECs.Pretreatment of HUVECswith fluvastatin（0.1，1 or 10μmol/L）decrease Hcy-induced expression of LOX-1.A high concentration of fluvastatin（10 umol/L）wasmore potent than the lower concentration（1μmol/L）.Conclusion These observations indicate that endothelial dysfunction elicited by Hcymay beassociated with an increase of LOX-1 expression.Inhibition of expression of LOX-1 may be anothermechanism of beneficial effects of statins in vascular diseases.

Fluvastatin；Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1；Homocysteine；Endothelial cells；Atherosclerosis

R972

A

1673-7210（2016）06（c）-0169-04

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（2016-02-23本文編輯：趙魯楓）